王 虹 林英忠 (廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科，廣西 南寧 530021)

微小RNA(MircroRNA，miRNA)是由21～23個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼單股小RNA，通過與目標(biāo)信使RNA(messenger RNA，mRNA)的3'-非翻譯端(3'-UTR)整合使其翻譯減少或降解，從而調(diào)控基因的表達(dá)〔1〕，進(jìn)而調(diào)控眾多的生理和病理生理過程，是基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)器。最先確認(rèn)的miRNA是控制線蟲發(fā)育關(guān)鍵步驟的lin-4和let-7，隨后的研究在包括人類、果蠅、植物等多種生物物種中通過分子克隆和生物信息學(xué)鑒別出數(shù)百個(gè) miRNA〔2〕。

在許多疾病的發(fā)生過程中miRNA都發(fā)揮重要作用，對(duì)心血管疾病發(fā)病機(jī)制的作用正逐漸被闡明。急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)過程中的梗死缺血損傷是因血栓或冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊急性改變引發(fā)冠脈血流供應(yīng)嚴(yán)重受損，導(dǎo)致心肌缺血損傷。探討細(xì)胞對(duì)缺氧反應(yīng)中特定miRNA的作用，探討特定miRNA在AMI的細(xì)胞凋亡、纖維化、新生血管生成以及心率失常中的調(diào)控作用，不僅具有理論價(jià)值，在臨床上更具有尋求AMI生物標(biāo)記指標(biāo)，用于診斷或評(píng)估AMI危險(xiǎn)度，提高AMI高危病人篩選的敏感性與準(zhǔn)確性以及針對(duì)特定miRNA進(jìn)行干預(yù)治療的臨床實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1 miRNA及細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)及特定miRNA的調(diào)控作用

缺氧不僅發(fā)生在急性和慢性缺血后，并且在嚴(yán)重的病理生理環(huán)境中，如快速的組織生長(zhǎng)，器官的發(fā)育或腫瘤的發(fā)生，高海拔狀態(tài)時(shí)均會(huì)發(fā)生。氧濃度的降低會(huì)引發(fā)強(qiáng)烈的反應(yīng)以緩解組織缺氧及細(xì)胞的不可逆性損傷。這一系列的反應(yīng)包括:內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷徙及成血管化，亦包括生長(zhǎng)停止及細(xì)胞凋亡。其自然過程的結(jié)果取決于多種因素，如細(xì)胞來(lái)源及基因型，以及缺氧的嚴(yán)重程度。而且缺氧是構(gòu)成腫瘤微環(huán)境的主要因素。如果腫瘤處于極度缺氧狀態(tài)說明其預(yù)后極差而且對(duì)傳統(tǒng)治療方法有抵抗。

在缺氧時(shí)，有一系列的細(xì)胞通路及器官水平的通路被激活以恢復(fù)供氧的平衡穩(wěn)定。缺氧誘發(fā)因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α(HIF-1α))無(wú)論在正常情況，還是持續(xù)缺氧狀態(tài)，都通過調(diào)節(jié)兩個(gè)重要的血管形成因子(內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子及促血管生成蛋白因子-2)起到關(guān)鍵的激發(fā)新生血管形成的作用〔3〕。

在HIF-1α調(diào)節(jié)的眾多基因中，miR-210被認(rèn)為是在缺氧反應(yīng)中起到最關(guān)鍵性作用的miRNA。因?yàn)樵谌毖醯乃屑?xì)胞、組織中發(fā)現(xiàn)其表達(dá)升高，miRNA-210是缺氧調(diào)控唯一的所有研究均公認(rèn)的miRNA〔4〕，且不受生長(zhǎng)因子缺乏、酸中毒、過氧化的影響。研究認(rèn)為 HIF-1α誘發(fā) miR-210表達(dá)增多，故認(rèn)為其是miRNA-210的最主要的調(diào)控物〔4〕。如果抑制了 HIF-1α，就可以抑制在缺氧狀態(tài)下miRNA-210的產(chǎn)生，但如果只是抑制了HIF的主要成分HIF-2α，就無(wú)類似的作用。研究發(fā)現(xiàn)miRNA-210 的主要靶點(diǎn)是 EFNA3、E2F3、NPTX1、RAD52、ACVR1B、MNT和CASP8AP2等。提示miRNA-210參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、分化、DNA修復(fù)和凋亡〔4〕。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，大鼠腦短暫性局灶性缺血模型、小鼠下肢缺血模型、小鼠心衰或者心肌肥大模型中，miRNA-210表達(dá)是上調(diào)的。臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在先兆子癇的病人中，其表達(dá)亦是上調(diào)的。

2 AMI中特定miRNA調(diào)控作用

AMI在20～30 min內(nèi)其不可逆性損傷即開始，一般在嚴(yán)重的缺血發(fā)生后4～6 h內(nèi)發(fā)生完全的梗死。由于缺氧、線粒體氧化磷酸化的迅速終止導(dǎo)致能量代謝的主要來(lái)源ATP的不足。確定的AMI有明確的梗死中心區(qū)帶和周邊區(qū)帶，缺血區(qū)域從中心到周邊損傷嚴(yán)重程度的變化，反映了再灌注缺乏程度。AMI在四個(gè)方面受特定miRNA調(diào)控。

2.1 梗死后細(xì)胞的存活 肌肉特異性miRNA-1與心肌細(xì)胞及其他細(xì)胞系統(tǒng)的凋亡有關(guān)。近年發(fā)現(xiàn)miRNA-1表達(dá)增加與缺血-灌注損傷及心肌梗死AMI后缺血凋亡細(xì)胞死亡有關(guān)。其是通過轉(zhuǎn)錄后抑制抗凋亡的蛋白B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)及胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)導(dǎo)致心肌缺血后凋亡細(xì)胞的死亡的〔5〕。

相反地，miRNA-320在缺血-灌注的心臟中無(wú)論是體內(nèi)或體外實(shí)驗(yàn)，其表達(dá)均明顯減少〔6〕。與野生型小鼠比較，miRNA-320過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠其梗死和凋亡區(qū)域增大，而抗miRNA-320治療可以減小梗死面積，其促進(jìn)凋亡的作用是直接抑制心臟保護(hù)性蛋白-熱休克相關(guān)蛋白20(Hsp20)。

Dong等〔7〕發(fā)現(xiàn)miRNA-21在心梗后大鼠的心臟中起到保護(hù)作用，抑制凋亡。在AMI早期，梗死區(qū)miRNA-21是顯著下調(diào)，而在邊緣區(qū)其表達(dá)增加。其機(jī)理可能與調(diào)控程序性細(xì)胞死亡分子(PDCD)-4及激活蛋白(AP)-1有關(guān)，其體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)miRNA-21的過表達(dá)可以減少梗死后心臟細(xì)胞的凋亡。但是miRNA-21在心臟生物學(xué)上其作用非常復(fù)雜和多樣性，其亦參與了心臟重構(gòu)和缺血預(yù)適應(yīng)中抑制促凋亡基因的功能。

2.2 AMI與心律失常 miRNA-1與AMI后心律失常有關(guān)，其靶點(diǎn)為間隙連接蛋白43及鉀離子通道亞基Kir2.1〔8〕。其上調(diào)是受到β-腎上腺素受體-cAMP-蛋白激酶A信號(hào)通路調(diào)控，β-受體阻滯劑能夠部分下調(diào)miRNA-1靶點(diǎn)KCNJ2和GJA1的表達(dá)〔9〕。

2.3 AMI后纖維化和心臟重構(gòu) Roy等發(fā)現(xiàn)miRNA-21在缺血-灌注損傷心臟區(qū)域中特異性地存在，其與心肌纖維化、心臟重構(gòu)有關(guān)。同源重失性磷酸張力蛋白基因(PTEN)是miRNA-21的靶點(diǎn)〔10〕。在心肌缺血-灌注后，心肌纖維母細(xì)胞中的miRNA-21產(chǎn)生抑制PTEN繼而是基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)產(chǎn)生增加，導(dǎo)致心臟重構(gòu)。Rooij等〔11〕發(fā)現(xiàn)左冠脈堵塞后，在梗死的邊緣區(qū)心肌纖維母細(xì)胞中miRNA-29b表達(dá)下調(diào)。

2.4 梗死后新生血管生成 Bonauer等〔12〕發(fā)現(xiàn)在體外試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)miRNA-92a是內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)源性的血管形成的抑制物，在心肌缺血或肢端缺血的小鼠動(dòng)物模型中其抑制血管形成的作用更明顯。抑制miRNA-92a的表達(dá)可以改善左室功能、減少梗死面積、減少凋亡細(xì)胞數(shù)及增加血管數(shù)。

3 miRNA在AMI臨床應(yīng)用展望

AMI過程中對(duì)缺血起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的特定miRNA的確定，為AMI臨床診斷治療開辟了新途徑。特定miRNA可以發(fā)展作為AMI良好的相對(duì)無(wú)創(chuàng)性生物標(biāo)記指標(biāo);特定miRNA可以發(fā)展作為AMI臨床新治療戰(zhàn)略靶標(biāo)。

3.1 miRNA作為診斷或預(yù)測(cè)的生物標(biāo)記指標(biāo) 疾病診斷或預(yù)測(cè)的生物標(biāo)記物測(cè)定樣品的采集必須是無(wú)創(chuàng)性的，這是一條重要的原則。miRNA一直是從血清、血漿或其他體液中取樣測(cè)定。腫瘤研究表明，幾百個(gè)miRNA構(gòu)成的miRNA圖譜比幾千個(gè)mRNA構(gòu)成的mRNA圖譜對(duì)癌癥分類更有效，特別是在組織病理無(wú)法分類時(shí)〔13〕。對(duì)于確定腫瘤病人對(duì)化療的反應(yīng)和存活，miRNA有預(yù)測(cè)意義〔14〕。miRNA在心血管疾病中潛在的診斷、預(yù)測(cè)價(jià)值，僅僅剛剛開始研究，但至今所獲得的結(jié)果顯示，這種作用價(jià)值不只是僅存在于腫瘤的診斷、預(yù)測(cè)。去甲腎上腺素誘發(fā)的大鼠心肌損傷模型，心臟特定miRNA-208血漿中的聚集度增高，并與典型的心肌損傷生物標(biāo)記物——肌鈣蛋白I的含量相關(guān)〔15〕。前述特定miRNA與AMI的研究資料提示，有理由相信通過進(jìn)一步深入研究應(yīng)能發(fā)現(xiàn)用于診斷和預(yù)測(cè)AMI，高危人群的特定miRNA生物標(biāo)記指標(biāo)。

3.2 miRNA作為AMI臨床新治療戰(zhàn)略靶標(biāo) 特定miRNA作為AMI臨床治療新戰(zhàn)略靶標(biāo)，至少有二個(gè)理由可以認(rèn)為有突破。一是單一的miRNA可以調(diào)節(jié)多個(gè)靶基因并能夠影響到整個(gè)基因網(wǎng)絡(luò);二是特定miRNA無(wú)論是體外還是體內(nèi)，都能被有效抑制。特定miRNA還能借助某些工具定向地降低致病的或異常表達(dá)的miRNA水平，或增高具有有益功能的特定miRNA水平。由于多種核酸酶以及磷酸二酯酶能迅速降解核酸，已經(jīng)開發(fā)出多種增強(qiáng)寡核苷酸穩(wěn)定性的化學(xué)修飾方法用于調(diào)控miRNA〔16〕。

特定miRNA作為AMI臨床新治療戰(zhàn)略靶標(biāo)的可行性，已經(jīng)被一個(gè)miRNA拮抗劑臨床應(yīng)用證實(shí)認(rèn)可。這標(biāo)志miRNA抑制劑可能成為一種重要的新藥。該臨床試驗(yàn)(19)是以肝臟特定miRNA-122作為C型肝炎的治療靶標(biāo)，開發(fā)應(yīng)用基于鎖核苷酸(LNA)的 miRNA拮抗劑調(diào)控miRNA-122，獲得成功。由于miRNA-122還調(diào)控血膽固醇水平，所以這種新開發(fā)的miRNA拮抗劑也可能在心血管領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價(jià)值〔17〕。

3.2.1 miRNA上調(diào) 合成分子結(jié)構(gòu)與干擾RNA相似的短雙股寡核苷酸，可以實(shí)現(xiàn)miRNA的過表達(dá)，雙股結(jié)構(gòu)對(duì)于有效識(shí)別并定位加載到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)是必須的。合成的短雙股寡核苷酸中的一股是成熟的miRNA，另一股與其互補(bǔ)，只有成熟miRNA進(jìn)入并與RISC結(jié)合。盡管這一技術(shù)在體外試驗(yàn)被成功使用，但至今還沒有證實(shí)在體內(nèi)應(yīng)用成功。

應(yīng)用表達(dá)載體可以實(shí)現(xiàn)miRNA的持續(xù)表達(dá)。這種方法已被成功地用于增加miRNA-155表達(dá)，治療白血病、乳腺癌、胃癌的體內(nèi)試驗(yàn)〔18〕;還被用于證實(shí)miRNA-15a、miRNA-16在前列腺癌中起抑腫瘤基因的作用〔18〕。過表達(dá)方法有內(nèi)生性miRNA過飽和進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)生性miRNA失調(diào)節(jié)危險(xiǎn)。腺相關(guān)病毒所致shRNA強(qiáng)烈的過表達(dá)，誘發(fā)肝源性miRNA下調(diào)，肝損傷以及試驗(yàn)小鼠死亡〔19〕。

3.2.2 miRNA拮抗劑 miRNA拮抗劑是與目的miRNA完全互補(bǔ)的單股寡核苷酸，有抑制miRNA的作用。miRNA拮抗劑捆綁在成熟miRNA上，起競(jìng)爭(zhēng)抑制作用，使特定miRNA進(jìn)入RISC減少。miRNA拮抗劑也可以捆綁在miRNA前體上，阻止其進(jìn)一步加工，即抑制其進(jìn)入RISC或抑制其由細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。采用靜脈注射經(jīng)過修飾的miRNA拮抗劑全身給藥方式，結(jié)果包括心臟在內(nèi)的多組織，相應(yīng) miRNA表達(dá)顯著降低〔20〕。用經(jīng)修飾的反義RNA處理小鼠，顯示miRNA-133在控制心肌肥厚〔21〕、miRNA-29 在心肌纖維化中起重要作用〔22〕。

3.2.3 miRNA海綿，miRNA橡皮擦(eraser)和miRNA面紗(mask)miRNA海綿，miRNA橡皮擦和miRNA面紗是三種不同的miRNA拮抗劑。miRNA海綿含有多個(gè)反義寡核苷酸，為防止RNA干擾切割，在通常RISC切割部位設(shè)計(jì)有凸起。miRNA橡皮擦由二個(gè)完全互補(bǔ)的反義寡核苷酸構(gòu)成。miRNA面紗是捆綁在mRNA的miRNA目標(biāo)序列上的寡核苷酸。miRNA海綿已成功在體內(nèi)用于miRNA-31下調(diào)〔23〕。miRNA橡皮擦被用于證實(shí)miRNA-21的靶點(diǎn)是 Sprouty2〔24〕。每個(gè)miRNA可以調(diào)節(jié)數(shù)百個(gè)mRNA〔24〕，直接抑制miRNA可能影響許多下游靶基因。miRNA面紗用于抑制miRNA/mRNA關(guān)聯(lián)。

3.3 運(yùn)載系統(tǒng) miRNA治療的成功有賴于反義寡核苷酸或表達(dá)載體、合成的短雙股寡核苷酸有效地被運(yùn)載到達(dá)靶標(biāo)。盡管全身給藥技術(shù)有了顯著的進(jìn)步，但是已開發(fā)的多數(shù)核酸載體至今只證實(shí)運(yùn)載到肝臟是有效的?；赗NA干預(yù)的基因治療已經(jīng)使用了數(shù)年，miRNA作為治療靶標(biāo)，需要評(píng)定載體運(yùn)載核酸到達(dá)組織和細(xì)胞的能力。寡核苷酸為了穿過目的細(xì)胞的脂質(zhì)雙層膜，需要包裹在脂質(zhì)體或納米粒子中〔25〕。最近開發(fā)出了一種新型的脂質(zhì)體(“l(fā)ipidoids”)，無(wú)論其運(yùn)載雙股小干擾，還是單股寡核苷酸，都顯示高水平的特定內(nèi)生基因轉(zhuǎn)錄沉默〔26〕。lipidoids的初步動(dòng)物(小鼠、大鼠和非人靈長(zhǎng)類)模型試驗(yàn)符合安全和具體標(biāo)準(zhǔn)。

納米技術(shù)提供了一個(gè)誘人的藥物運(yùn)載系統(tǒng)，與其他載體比較，納米載體有相同的運(yùn)載能力，而極少毒性。納米載體已成功地應(yīng)用于體外和體內(nèi)，特定地殺死癌細(xì)胞而不損害健康細(xì)胞〔27〕。寡核苷酸與脂質(zhì)分子，如高密度脂蛋白結(jié)合，能更好地被運(yùn)送到特定器官。

病毒已被廣泛用做載體，最近腫瘤基因治療的臨床試驗(yàn)載體就是病毒。改良腺病毒，如腺相關(guān)病毒和慢病毒，與siRNA/shRNA穩(wěn)定結(jié)合并成功將其運(yùn)送到達(dá)靶基因〔28〕。

miRNA抑制劑已成功用于小鼠并可能用于基于miRNA的治療。在心血管領(lǐng)域，對(duì)miRNA的興趣正在增長(zhǎng)。研究miRNA的表達(dá)和功能，將增加對(duì)被AMI激活的分子機(jī)制以及AMI后退行性變和再生過程的調(diào)控的了解。以miRNA為靶標(biāo)的AMI治療新戰(zhàn)略，面臨的挑戰(zhàn)包括運(yùn)載系統(tǒng)的效率，以及其選擇特定靶器官和在同一器官中選擇不同細(xì)胞類型的能力。此外心臟的成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞對(duì)于miRNA治療，可能會(huì)產(chǎn)生與其他器官完全不同的功能結(jié)果。隨著研究的深入，這些問題將會(huì)得以解決。新的AMI診斷、預(yù)測(cè)指標(biāo)及治療戰(zhàn)略將會(huì)產(chǎn)生。

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