白喜云，孫耀貴，李宏全

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801)

大鼠腎被膜微環(huán)境對牙齒發(fā)育的誘導(dǎo)作用

白喜云，孫耀貴，李宏全

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801)

目的 為探索一種組織工程化牙齒異位培養(yǎng)的理想環(huán)境，檢測全牙胚、牙乳頭及成釉器在腎被膜環(huán)境下的發(fā)育能力。方法 利用剖腹產(chǎn)取出胚齡18 d的大鼠胎兒，顯微外科分離牙胚，并將之進(jìn)一步分為牙乳頭和成釉器兩部分。使用特制玻璃移植管分別將獲得的全牙胚、牙乳頭及成釉器植入異體大鼠腎被膜下。2周后取出培養(yǎng)物，HE染色觀察其發(fā)育情況。結(jié)果 在腎被膜微環(huán)境下，全牙胚在腎被膜下發(fā)育良好，形成較為完整的牙齒形態(tài)和結(jié)構(gòu)，單獨(dú)的牙乳頭可以形成牙本質(zhì)，而單獨(dú)的成釉器無法形成特定形態(tài)的牙冠，也無法分化成釉質(zhì)。結(jié)論證明腎被膜下是牙齒異位生長的適宜環(huán)境，ED18后成釉器發(fā)育仍然受到牙乳頭調(diào)控，與此相反，牙乳頭發(fā)育不再依賴成釉器的信號(hào)。

大鼠，腎被膜;微環(huán)境;牙齒;發(fā)育

1 材料與方法

1.1 材料

體視顯微鏡、普通光學(xué)顯微鏡(Olympus);顯微外科鑷(美國);普通外科手術(shù)器械(上海);長頸細(xì)口玻璃移植管(自制)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：妊娠18 d的SD大鼠以及10月齡SD大鼠，第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［SCXK2002-005］。大鼠根據(jù)受體接受的移植物不同分為三組：①全牙胚組;②牙乳頭組;③成釉器組。每組5只供體和5只受體。

1.2.2 牙胚的收集與分離：取妊娠18 d的 SD大鼠，頸部脫臼處死，酒精浸泡全身。超凈工作臺(tái)內(nèi)剖宮產(chǎn)術(shù)從子宮內(nèi)收集胎兒。取胎兒頭部，分離上下頜，在顯微鏡下用顯微外科器械分離第一磨牙。進(jìn)而將磨牙分為牙乳頭和成釉器兩部分，置DMEM培養(yǎng)液保存，備用移植。

1.2.3 腎被膜下移植術(shù)：選10月齡SD大鼠為受體，以戊巴比妥鈉麻醉。垂直切開第一肋后方皮膚及腹壁，暴露腎臟。有齒鑷輕輕夾起腎被膜一端，用外科刀打一小孔。將已吸取牙胚的長頸細(xì)口玻璃吸管口沿小孔深入腎被膜中部(即距入口1 cm處，見圖1A)，同時(shí)推入牙胚，不需縫合。每個(gè)受體只移植一側(cè)腎臟，植入兩枚移植物。

1.2.4 移植體的觀察：分別于移植后2周處死大鼠，腎被膜下收取移植物。4%多聚甲醛固定24 h，脫鈣3 d。然后進(jìn)行石蠟包埋，制作5 μm組織切片，HE染色觀察移植體組織形態(tài)。

2 結(jié)果

所有受體在手術(shù)植入移植物后2周內(nèi)飲食欲、行為均表現(xiàn)正常，移植物在腎被膜下均未發(fā)生丟失現(xiàn)象。移植物在腎被膜下發(fā)育的外觀形態(tài)及組織發(fā)育情況如下。

2.1 全牙胚發(fā)育情況

見圖1(彩插5)。ED18的大鼠全牙胚植入腎被膜下后整體生長良好，體積為3 mm×1.5 mm×1.2 mm大小，牙冠部形態(tài)基本與同期磨牙一致(見圖1B，C)。牙體外感堅(jiān)硬，色澤白而光亮。但牙根部平整，沒有生長發(fā)育跡象。HE染色可見牙冠部形成典型的縱向排列的整齊釉柱結(jié)構(gòu)，牙體部位牙本質(zhì)小管柱狀排列，結(jié)構(gòu)良好(見圖1D)。牙根部位平整，為成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞包繞。

2.2 牙乳頭發(fā)育情況

單獨(dú)的牙乳頭在腎被膜下發(fā)育良好，外觀形態(tài)為不規(guī)則塊狀。HE染色可見移植物內(nèi)牙本質(zhì)小管柱狀排列橫斷面影像，形成典型的牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體，移植物內(nèi)有一定程度炎性細(xì)胞浸潤(見圖1E)。

2.3 成釉器發(fā)育情況

單獨(dú)的成釉器在腎被膜下不能進(jìn)一步發(fā)育，外觀形態(tài)也呈不規(guī)則塊狀。HE染色可見移植物內(nèi)結(jié)構(gòu)混亂，無成釉細(xì)胞存活，也無規(guī)則釉柱或者單獨(dú)的釉質(zhì)結(jié)構(gòu)形成，炎性細(xì)胞浸潤明顯(見圖1F)。

3 討論

早期牙齒的發(fā)育是上皮－間充質(zhì)機(jī)制作用下一系列信號(hào)交互作用的結(jié)果，它決定了牙齒的形成部位、大小、形態(tài)和數(shù)量［2］。臨床上要求研究者盡可能去模擬牙胚體內(nèi)發(fā)育過程，實(shí)現(xiàn)牙齒局部組織修復(fù)甚至全牙再生。因此，建立科學(xué)、高效的牙齒培養(yǎng)系統(tǒng)十分重要。

牙胚異體異位培養(yǎng)作為牙齒培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，是極富挑戰(zhàn)性的工作。它不僅涉及新環(huán)境細(xì)胞信號(hào)對發(fā)育的調(diào)控，也涉及到異位營養(yǎng)供應(yīng)及異體免疫排斥反應(yīng)等問題。本實(shí)驗(yàn)將全牙胚在植入腎被膜下后，發(fā)育良好。色澤為乳白色，體積與正常牙齒大小相似，具有完整的牙冠結(jié)構(gòu)。H＆E染色牙齒釉質(zhì)、牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體結(jié)構(gòu)與口腔正常生長的牙齒無顯著差異。這說明腎被膜下可以為牙胚發(fā)育提供充足的養(yǎng)分，免疫排斥反應(yīng)輕微，是進(jìn)行牙胚培養(yǎng)的良好環(huán)境。但目前存在的問題是，牙胚位于牙床內(nèi)生長時(shí)可以生成牙根，而在腎被膜下未能形成牙根。說明腎被膜下環(huán)境與牙床內(nèi)環(huán)境差異依然較大，其細(xì)胞所釋放的胞間信號(hào)不能支持牙乳頭進(jìn)一步向牙根分化，這是進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)需要解決的問題。

單獨(dú)植入腎被膜下的成釉器不能獨(dú)立發(fā)育。HE染色顯示成釉細(xì)胞幾乎完全死亡。沒有釉基質(zhì)沉積，鈣化也不好。形成了骨樣的成分，這可能是釉基質(zhì)的分泌和釉質(zhì)的形成過程中，牙乳頭所發(fā)揮的功能不可替代。缺乏牙乳頭的情況下，發(fā)育指示信息的反饋通路阻斷，無法產(chǎn)生正常的基質(zhì)，鈣化過程也被中斷。獨(dú)立的成釉器組織在腎被膜下無法形成正常形態(tài)和功能的釉質(zhì)，這顯示了成釉器在牙齒發(fā)育中對于牙乳頭組織的依賴性。在缺乏牙乳頭的情況下，它無法獨(dú)立完成發(fā)育過程。

與此相反，單獨(dú)的牙乳頭在腎被膜下則可以正常的發(fā)育。H＆E染色分析說明，單獨(dú)的牙乳頭形成形態(tài)學(xué)上較為理想的牙本質(zhì)結(jié)構(gòu)。也有一定密度的規(guī)則排列的成牙本質(zhì)細(xì)胞與牙本質(zhì)相連。牙本質(zhì)結(jié)構(gòu)礦化良好，外觀形態(tài)除無牙冠結(jié)構(gòu)以外，其他特征與腎被膜下培養(yǎng)的全牙胚無明顯差異。顯示牙乳頭在腎被膜下可以獨(dú)立發(fā)育。說明ED18的成釉器對牙乳頭發(fā)育已經(jīng)不在發(fā)揮作用，這與 Lesot等［3］的研究結(jié)果一致。

除腎被膜以外，研究顯示大網(wǎng)膜、耳后皮下、眼窩內(nèi)均可以進(jìn)行牙胚的體內(nèi)培養(yǎng)。但于金華等［4］對幾種體內(nèi)誘導(dǎo)環(huán)境進(jìn)行比較后證實(shí)，從營養(yǎng)供應(yīng)角度考慮，腎區(qū)血液供應(yīng)豐富營養(yǎng)充足;從免疫學(xué)角度看，腎區(qū)為免疫特惠區(qū)，所產(chǎn)生的免疫排斥反應(yīng)輕微，所以腎被膜是培養(yǎng)牙胚的最佳環(huán)境。這與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果一致。

總之，本實(shí)驗(yàn)初步證明腎被膜環(huán)境是牙胚異位發(fā)育較為理想的體內(nèi)環(huán)境，可以作為組織工程牙齒再生實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)環(huán)境。進(jìn)一步的研究應(yīng)該考慮到胞間信號(hào)傳導(dǎo)問題，以提高牙齒發(fā)育的可控度，降低炎性反應(yīng)，逐步實(shí)現(xiàn)再生牙齒的夢想。

(本文圖1見彩插5。)

［1］ Sumitaa Y，Honda M，Ohara T.Performance of collagen sponge as a 3-D scaffold for tooth-tissue engineering［J］.Biomaterials，2006，27：3238 －3248.

［2］ Pispa J，Thesleff I.Mechanisms of ectodermal organogenesis［J］.Dev Biol，2003，262：195 － 205.

［3］ Smith A，Lesot H.Induction and regulation of crown dentinogenesis：embryonic events as a template for dental tissue repair?［J］.Crit Rev Oral Biol Med，2001，12：425 －437.

［4］ 于金華，金巖，史俊南，等.大鼠牙胚同種異體異位移植的組織學(xué)觀察［J］.臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志，2005，21(5)：280－282.

Promoting effect of the sub-renal capsule microenvironment on the development of allotransplanted tooth in rats

BAI Xi-yun，SUN Yao-gui，LI Hong-quan
(College of Animal Science and Veterinary Medicine，Shanxi Agricultural University，Taigu，Shanxi 030801，China)

Objective To explore a suitable culture environment for tissue-engineered teeth and to evaluate the developmental ability of full tooth germs，dental papilla and enamel organ in sub-renal capsule space.Methods Rat fetus at embryonic day 18(ED18)were obtained by Cesarean section.The full first molar germs were separated from fetus，and to separate them further into enamel organ and dental papilla by microsurgery.Subsequently，full tooth germ，enamel organ and dental papilla were transplanted into sub-renal capsule tissue of adult Sprague-Dawley rat by special glass tube and collected at 2 weeks after grafting.Paraffin sections were prepared and the histological changes of transplants were examined with H＆E staining.Results Full tooth germs were well developed into normal shape and structure in the rat sub-renal capsule microenvironment.The dentin-pulp complexes were formed by separated dental papillas.However，the separated enamel organs were not well developed，both tooth crown and enamel were not formed in this group.Conclusions The results of this study indicate that renal subcapsular space is a suitable culture environment for allotransplantated teeth development.After ED18，enamel organ development is still regulated by signals from dental papilla，but in contrast，dental papilla development is no longer dependent on the signals from enamel organ.

Rat;Sub-capsular space，kidney;Microenvironment;Tooth;Development;Rat

Q95-33，R78.12

A

1005-4847(2011)01-0042-03

10.3969/j.issn.1005-4847.2011.01.010

牙齒是動(dòng)物體內(nèi)最堅(jiān)硬的器官，在咀嚼食物、防衛(wèi)攻擊及維持頜面部正常形態(tài)等方面具有重要功能。然而，哺乳動(dòng)物的牙齒終身只有一次替換機(jī)會(huì)，成年后牙齒釉質(zhì)不再含有活細(xì)胞，一旦被致病因素破壞就會(huì)造成永久性的不可修復(fù)的損傷。因此，臨床上對牙齒缺損修復(fù)和功能性牙齒再生技術(shù)的需求十分迫切。近年來基于牙齒發(fā)育和干細(xì)胞理論的牙齒再生技術(shù)成為人們研究的熱點(diǎn)，其當(dāng)前面臨的難題之一是器官培養(yǎng)模式。迄今為止已經(jīng)在雞胚尿膜絨毛膜、小鼠眼窩、耳后皮下及腎被膜下等部位進(jìn)行過牙胚異體異位培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)并獲得成功［1］。為進(jìn)一步驗(yàn)證腎被膜下牙胚發(fā)育能力，2006年～2007年我們先后對牙胚腎被膜下移植技術(shù)作了改進(jìn)，在全牙胚移植的基礎(chǔ)上，牙乳頭與成釉器的單獨(dú)發(fā)育能力進(jìn)行了檢測。

山西省青年科技研究基金(2012021029－1);山西農(nóng)業(yè)大學(xué)青年科技研究基金提供資助(2008006)。

白喜云(1976 － )，男，講師，碩士，從事胚胎早期發(fā)育研究。E-mail： xiyunbai@126.com，Tel：0354-6286659。

李宏全，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)楂F醫(yī)外科學(xué)。E-mail：hongquanlijoe@yahoo.com.cn

2010-02-24