鐘海潮，趙士海，饒子亮，孫 俠，鐘志勇，王 剛，陳系古

(廣東省醫(yī)學實驗動物中心，佛山 528248)

增殖細胞核抗原在低氧大鼠肺動脈平滑肌細胞中表達

鐘海潮，趙士海，饒子亮，孫 俠，鐘志勇，王 剛，陳系古

(廣東省醫(yī)學實驗動物中心，佛山 528248)

目的 通過建立低氧性肺動脈高壓大鼠模型，探討增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)在大鼠低氧性肺血管平滑肌細胞中的表達。方法 將SPF級SD大鼠隨機分為正常對照組(n=10)、模型組(n=10)，通過間斷常壓低氧法建立大鼠低氧性肺動脈高壓模型，肺組織切片經(jīng)HE染色后圖像分析技術(shù)定量檢測大鼠肺小動脈的形態(tài)改變;免疫組織化學染色法測定肺血管平滑肌細胞內(nèi)PCNA蛋白表達，并經(jīng)圖像分析半定量檢測其表達強度。結(jié)果 4周后，模型組SD大鼠MT%、MA%與對照組比較，差異具有顯著性(P＜0.05);模型組SD大鼠肺血管平滑肌細胞內(nèi)PCNA核蛋白表達(積分面積、累積光密度)與對照組比較，差異具有顯著性(P＜0.05)。結(jié)論 常壓低氧4周可成功建立肺動脈高壓大鼠模型，PCNA在肺血管平滑肌細胞中的表達量具有差異性提示其可能在肺動脈高壓形成過程中起重要作用。

低氧;增殖細胞核抗原;肺動脈

1 材料與方法

1.1 實驗材料

羊抗小鼠免疫組化試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司，批號：200811;細胞凋亡檢測試劑盒：廠家：Roche Diagnotics GmbH，批號：14492200;顯微成像系統(tǒng)：奧林巴斯，型號：BX41;圖像分析軟件：MediaCybernetics，版本：Image-Pro Plus 6.0。

1.2 實驗動物

SPF級 SD大鼠20只，雄性，體質(zhì)量160～200 g，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供【SYXK(粵)2003-0002】。飼養(yǎng)條件：采用12 h∶12 h晝夜間斷照明，室內(nèi)保持20～25℃，自由飲食。實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準。

1.3 實驗方法

1.3.1 建立肺動脈高壓大鼠模型：SPF級SD大鼠20只，雄性，隨機分為正常對照組、模型組，每組10只。將模型組置于常壓低氧箱內(nèi)，箱內(nèi)濃度穩(wěn)定于(10±0.5)%，8 h/d，連續(xù)4周。每天觀察和記錄動物外觀體征、行為活動和二便情況。

1.3.2 標本采集：兩組大鼠經(jīng)乙醚麻醉后，經(jīng)股動脈放血法處死。于 4℃，4%多聚甲醛固定 36～48 h，經(jīng)脫水透明后石蠟包埋切片，片厚 4 μm，行HE染色、免疫組織化學染色檢測。

1.3.3 肺組織切片的半定量分析：顯微鏡下觀察大鼠肺組織切片，用Image-pro plus 6.0圖像系統(tǒng)進行圖像采集并進行圖像分析，測量與呼吸性細支氣管及肺泡管伴行的肺小動脈外徑、管壁厚度、血管總面積及管壁面積，計算管壁厚度占血管外徑的百分比(MT%)和管壁面積占血管總面積的百分比(MA%)。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 實驗動物一般情況觀察

2組動物活動未見異常，行為活潑，毛發(fā)光潤、口、眼、耳、鼻均無異常分泌物，二便排泄無異常。將低氧組大鼠放入低氧箱中，大鼠從活躍狀態(tài)轉(zhuǎn)入睡眠、安靜、少動狀態(tài)。

2.2 低氧大鼠肺動脈血管的病理檢測

經(jīng)過肺小血管圖像分析，常壓低氧4周后，模型組大鼠的MT%、MA%分別為51.31±18.14和64.5±16.5，均高于對照組(分別為 36.89±12.63和59.6±12.5)，差異有顯著性(P＜0.05)，提示低氧4周后低氧性肺血管重建形成。

2.3 PCNA在肺血管平滑機細胞中的表達

免疫組織化學圖像分析結(jié)果提示，模型組大鼠肺組織切片PCNA表達(積分面積、累積光密度)分別為685.6±2719.47和2950.89±1773.68，均高于對照組(分別為 3422.20±2194.96和 2160.57±1465.92)差異有顯著性(P＜0.05)。

3 討論

低氧性肺血管結(jié)構(gòu)重建是低氧性肺動脈高壓的重要病理基礎。近年來受到越來越多的重視。本實驗通過建立低氧性肺動脈高壓大鼠模型，探討增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)在大鼠低氧性肺血管重建中的作用。實驗結(jié)果表明，模型組 SD大鼠的 MT%、MA%與對照組比較，顯著性升高(P＜0.05)，結(jié)果提示模型組大鼠的肺血管出現(xiàn)了重塑現(xiàn)象，提示低氧肺血管高壓大鼠的造模是成功的。

PCNA首先由Miyachi等在1978年發(fā)現(xiàn)。PCNA是一種僅在增殖細胞內(nèi)合成和表達的酸性多肽，又稱周期素(cyclin)，為DNA多聚酶δ的輔助蛋白，是細胞合成期必不可少的因子［3］。PCNA最重要的功能是其在核酸代謝中作為DNA聚合酶6的輔助蛋白，是DNA合成不可缺少的物質(zhì)，而DNA合成是細胞增殖周期中的關(guān)鍵。PCNA的含量隨細胞不同增殖周期而變化，自Gl晚期出現(xiàn)并開始增加，在s期達高峰，在G2期、M期逐漸減少到含量甚微。這表明PCNA的出現(xiàn)與細胞增殖周期密切相關(guān)，是反映細胞增殖活性的重要生物學指標［4］。

本研究結(jié)果顯示，模型組SD大鼠肺血管PCNA核蛋白表達(積分面積、積分光密度)與對照組比較，差異具有顯著性(P＜0.05)，結(jié)果提示低氧4周后在鼠形成肺血管結(jié)構(gòu)重建，同時肺小動脈PCNA表達增強，提示PCNA在低氧性肺血管結(jié)構(gòu)重建及肺動脈高壓形成中起重要作用。

作者認為，PCNA在大鼠低氧性肺動脈高壓和肺血管重建過程中起到一定作用，但其在人體是否有相同表現(xiàn)，其作用的信號轉(zhuǎn)導途徑、作用發(fā)生的階段、早期干預能否預防肺動脈高壓和肺血管重建的發(fā)生以及如何延緩其進展尚待進一步研究。

［1］ 馮曉東，蔡英年.內(nèi)皮衍生因子(ET/NO)與低氧性肺動脈高壓.基礎醫(yī)學與臨床.1996，16(1)：6.

［2］ 蔡英年.肺動脈高壓形成時肺血管細胞的增殖和調(diào)節(jié).生理科學進展，1992，23(3)：29.

［3］ Iwase M，Imamura Y，Noriki S，et al.Immunohistochemical detection of early-stage carcinogenesis of oral leukoplakia by increased DNA2 instability and various malignancy markers［J］.Eur J Histochem，2001，45(4)：333-346.

［4］ 麻世紅，譚文華.子宮內(nèi)膜癌中FHIT、PCNA蛋白的表達及意義［J］.哈爾濱醫(yī)科大學學報.2009，43(1)：65.

Expression of PCNA in pulmonary artery smooth muscle cells of hypoxic pulmonary hypertensive mice

ZHONG Hai-chao，ZHAO Shi-hai，RAO Zi-liang，SUN Xia，ZHONG Zhi-yong，WANG Gang，CHEN Xi-gu
(Guangdong Medical Laboratory Animal Center，F(xiàn)oshan 528248，China)

Objective To establish a mouse model of hypoxic pulmonary hypertension and to explore the expression of proliferating cell nuclear antigen(PCNA)in aorta and pulmonary artery smooth muscle cells of rats with hypoxic pulmonary hypertension.Methods SPF SD mice were randomly divided into 2 groups：normal group(n=10)and hypoxia group(n=10).The mouse model of hypoxic pulmonary hypertension was constructed by intermittent ordinary pressure hypoxia.Histology of HE stained lung tissue sections and image analysis were performed to detect the morphological changes of pulmonary arterioles.PCNA level in pulmonary artery smooth muscle cells were detected by immunohistochemistry，and the PCNA concentration was determined by semi-quantitative image analysis.Results Four weeks later，MT%and MA%in the SD mice of hypoxia group were significantly higher than that of normal group(P＜0.05).PCNA ribonucleoprotein expression(area IOD)of pulmonary artery smooth muscle cells in the SD mice of hypoxia group was significantly higher than that of the normal group(P＜0.05).Conclusions The method of intermittent ordinary pressure hypoxia can be successfully used to construct a hypoxic pulmonary hypertensive mouse model within four weeks，suggesting that PCNA expression may play a very important role in the formation of chronic HPH.

Hypoxia;PCNA;Pulmonary artery;Rat

Q95-33

A

1005-4847(2011)01-0089-02

10.3969/j.issn.1005-4847.2011.01.020

低氧性肺血管收縮和重建是低氧性肺動脈高壓癥的兩個主要病理變化，是肺動脈高壓持續(xù)存在的根本原因［1，2］。增殖細胞核抗原 (proliferating cell nuclear antigen，PCNA)在細胞增殖的啟動上起重要作用，是一種反映細胞增殖活性的重要指標。本研究通過建立大鼠肺動脈高壓模型，觀察低氧性肺動脈高壓大鼠肺血管平滑機細胞PCNA表達水平，旨在探討PCNA在低氧性肺動脈高壓發(fā)病中的可能作用，為應用該藥防治肺動脈高壓提供實驗依據(jù)。

廣東省科技計劃項目(2008A060202002)。

鐘海潮 (1986-)，男，助理實驗師，從事實驗動物病理學工作。

王剛(1966-)，男，高級獸醫(yī)師，從事實驗動物和比較醫(yī)學研究工作，E-mail：gdmlac@gmail.com

2009-11-05