李建武

（甘肅省農業(yè)科學院馬鈴薯研究所，甘肅蘭州 730070）

簡單重復序列（Simple Sequence Repeat，SSR）又稱微衛(wèi)星DNA（Microsatellite DNA），廣泛分布在真核生物基因組的不同位置，且分布較為均勻，由于其重復次數不同或重復程度不完全而形成每個座位的多態(tài)性。SSR一般是由幾個（多為1～6個）堿基組成的基序（motif）串聯(lián)重復而成的DNA序列，其長度一般較短，在100 bp以內。SSR標記技術作為第2代基于PCR的一種新型DNA分子標記，其原理是根據SSR兩端的特定順序序列設計互補的寡聚核苷酸引物，對SSR進行PCR擴增，經聚丙烯酰胺凝膠電泳，即可顯示SSR位點在不同個體間的多態(tài)性，表現(xiàn)為共顯性。

SSR標記具有多態(tài)性高、重復性好、數量豐富、分布于整個基因組、特異性擴增、發(fā)生頻率高、共顯性遺傳、對DNA數量和質量要求不高、批量操作等優(yōu)點。自該技術于1991年創(chuàng)立以來，被廣泛應用于植物遺傳圖譜構建、基因定位、分子標記輔助選擇育種和遺傳多樣性研究等方面（Bonierbale et al.，1988），同樣在馬鈴薯構建遺傳連鎖圖譜、研究群體遺傳學、進行分子標記輔助育種、系譜分析、品種指紋圖譜繪制、品種純度檢測、目標性狀分子標記篩選等研究方面也得到廣泛應用（Collins et al.，1999；Ghislain et al.，2009）。

1 馬鈴薯SSR的發(fā)展

SSR引物的獲取途徑主要有三條：其一，直接應用已經公開發(fā)表的SSR引物，隨著馬鈴薯基因組測序的不斷深入和完善，公開發(fā)表的SSR標記日益豐富；其二，使用近緣物種的引物，如利用茄科番茄的保守序列作為引物的結合位點完成 PCR（Polymerase Chain Reaction）反應（Frary et al.，2005）；其三，開發(fā)SSR引物，通過核酸數據庫GenBank、DDBJ（DNA Data Bank of Japan）、EMBL（European Molecular Biology Laboratory）篩選簡單重復DNA序列，或從已建立的克隆文庫中獲得簡單重復DNA序列的陽性克隆，然后根據其兩側保守的DNA序列設計特定的SSR引物。

1.1 馬鈴薯基因組SSR引物的開發(fā)

Veilleux等（1995）首次將 SSR標記技術應用在馬鈴薯花藥培養(yǎng)再生二倍體植株的遺傳分析上。馬鈴薯和番茄分子連鎖遺傳圖譜的深入研究證明了馬鈴薯和番茄高度保守區(qū)域的相似性（Bonierbale et al.，1988；Tanksley et al.，1992），隨著番茄SSR引物的不斷開發(fā)，也相應地增加了馬鈴薯SSR引物的數量，促進了SSR標記在馬鈴薯研究中的應用。馬鈴薯SSR的引物開發(fā)與篩選研究始于1996年，Provan等（1996）根據番茄和馬鈴薯的24個功能基因中的簡單重復序列設計了22對SSR引物，其中19對引物具有多態(tài)性。Mibourne等（1998）利用EMBL、cDNA文庫和富集小片段插入DNA文庫中的馬鈴薯簡單重復序列，共設計了112對SSR引物（STM001系列），對4個二倍體和2個四倍體馬鈴薯無性系進行了遺傳分析，其中的98對SSR引物具有多態(tài)性。Ashkenazi等（2001）通過建立的二倍體馬鈴薯栽培種富利哈種（Solanum phurejaJuz.）和野生種恰柯種（S. chacoenseBitt.）的2個基因組文庫，設計了30對新的SSR引物。

1.2 基于EST的SSR標記

SSR標記的傳統(tǒng)開發(fā)涉及一系列繁復的操作過程，效率較低，成本較高，限制了SSR標記在許多馬鈴薯遺傳分析中的應用，長期以來僅在模式植物或者經濟價值較高的作物上得到開發(fā)和應用。隨著表達序列標簽（Expressed Sequence Tags，ESTs）的大量測定，快速增長的EST序列信息為 SSR標記的開發(fā)提供了豐富的資源。截止到 2011年初，NCBI數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的EST數據庫收錄了逾39萬條馬鈴薯EST序列。Ghislain等（2004）根據EST序列設計了48對SSR引物，經過篩選最后得到了13個新的SSR標記（STM5000系列）。Feingold等（2005）通過美國基因組研究所（The Institute for Genomic Research，TIGR）數據庫的馬鈴薯基因組簡單重復序列，設計了94對引物，經合成后擴增馬鈴薯DNA，成功開發(fā)了61個SSR標記（STI系列），這些SSR引物能夠鑒別選自南美的30個馬鈴薯品種。馬鈴薯SSR標記的不斷開發(fā)及引物序列的公開發(fā)表，極大地促進了SSR技術在馬鈴薯品種鑒定及遺傳多樣性等方面的研究。

2 SSR標記在馬鈴薯遺傳育種方面的應用

2.1 品種鑒定與種質資源研究

SSR標記從DNA分子水平上對馬鈴薯品種進行鑒定，準確、高效、批量鑒別出不同的基因型，已成為一種有效的鑒定方法，結合SSR標記的多態(tài)性及其精確的片段大小，即可建立對應于每一品種的標準指紋圖譜，將為品種在分子水平上提供獨特的鑒定特征，以鑒別品種。Kawchuk等（1996）利用3對SSR引物在95個馬鈴薯栽培品種擴增出了851個多態(tài)性位點，區(qū)分了其中的73個品種。McGregor等（2000）利用SSR標記對39個南美當地馬鈴薯栽培品種進行了分析，5對SSR引物有效區(qū)分了其中的24個。Ashkenazi等（2001）利用4對公開的SSR引物和根據基因組文庫開發(fā)的3對新的SSR引物共7對，可以鑒定區(qū)別12個不同的馬鈴薯栽培品種，且其中的2對SSR引物可完全鑒別出這些品種，多態(tài)性位點的等位基因數為3～6，平均等位基因數為5。Norero等（2002）利用SSR標記對來自德國等12個國家的37個馬鈴薯品種進行了分子鑒定，3對引物可將其中的36個品種區(qū)分開，由于Shepody和Achirana INTA兩個品種出現(xiàn)了相似的特異性譜帶，利用另外一對引物將其區(qū)分開，即4對SSR引物可將所有37個品種完全區(qū)分。Ghislain等（1999）利用70個SSR標記對來自國際馬鈴薯中心（CIP）的9個類型（且每個類型不少于4個基因型）的73個馬鈴薯種質材料進行了擴增，篩選了包含18個具有多態(tài)性的SSR標記，這些標記可在7大栽培種中均擴增出該多態(tài)性片段，可以有效地區(qū)分不同品種。Ghislain等（2004）利用156對SSR引物對來自CIP的8個類型的931個馬鈴薯種質材料進行了分析，篩選出的18對SSR引物可高效、準確地鑒定馬鈴薯種質資源。Ghislain等（2009）利用88個SSR標記對來自CIP保存4大類型的742份馬鈴薯種質資源（包含二倍體、三倍體、四倍體、五倍體）進行了分析，建立了含有 51個 SSR標記馬鈴薯遺傳鑒定試劑盒，該試劑盒鑒定區(qū)別742份種質資源的有效性達到98.8%，而含有其中的24個SSR標記的試劑盒鑒定區(qū)別這些種質資源的有效性可達 93.5%，同時明確了標記等位基因片段大小，新的遺傳鑒定試劑盒有助于馬鈴薯種質標準化選擇和分析數據。Rosa等（2010）利用24個SSR標記對巴西的14個馬鈴薯主栽品種進行了分析，篩選出可以鑒定這些品種的2個SSR標記，且每一個多態(tài)性位點均為單形態(tài)帶型。

我國在馬鈴薯品種鑒定、指紋圖譜及遺傳多樣性方面的研究近幾年發(fā)展較快，段艷鳳等（2009）利用SSR標記構建了中國2000～2007年審定的88個馬鈴薯品種的指紋圖譜并進行了遺傳多樣性分析，從138對SSR引物中篩選出6對引物構建了88個品種的SSR指紋圖譜。王紹鵬等（2009）利用4對SSR引物對黑龍江省7個主栽品種進行遺傳多樣性分析，共獲得144條多態(tài)性條帶，其中3對引物完全可以區(qū)分7個馬鈴薯品種，剩余1對引物可以區(qū)分6個馬鈴薯品種，相似度分析表明，荷蘭15與克新1號遺傳距離較遠，荷蘭15與早大白、早大白與黃麻子間遺傳距離較近。滕長才等（2009）利用30對SSR引物對青海省12份馬鈴薯主栽品種進行了遺傳分析，擴增出359條多態(tài)性條帶，12個品種的遺傳距離介于0.238 5～0.480 1 cM之間，平均值為0.397 6 cM，品種遺傳多樣性水平較低。唐銘霞等（2010）從110對引物中篩選出16對SSR引物對四川省現(xiàn)有及引進的42份馬鈴薯材料進行遺傳分析，共擴增出130個位點，其中多態(tài)性位點 116個，占總擴增位點的 89.2%，聚類分析表明，四川省栽培的馬鈴薯品種遺傳多樣性水平較低，品種間的遺傳差異較小。

2.2 構建遺傳連鎖圖譜與基因定位

遺傳圖譜（Genetic map）是通過遺傳重組交換結果進行連鎖分析所得到的基因在染色體上相對位置的排列圖，是植物遺傳育種及分子克隆等應用研究的理論依據和基礎。高密度的遺傳連鎖圖譜是遺傳學家所追求的理想圖譜，也是分子標記輔助選擇育種的前提和基礎。馬鈴薯二倍體野生種和四倍體栽培種遺傳組成上高度雜合，自交退化現(xiàn)象嚴重，很難構建真正意義上的重組自交系，用于遺傳圖譜構建的群體多為 F1，其每粒實生種子都代表完全不同的基因型，通過無性繁殖的方式可以固定下來，相當于其他作物的 F2。自從美國康奈爾大學 Bonierbale 等（1988）利用二倍體S. phureja×（S. tuberosum×S. chacoense）雜交后代構建了第一個馬鈴薯RFLP圖譜以后，國外許多學者以不同的二倍體馬鈴薯材料為作圖群體，采用RFLP、AFLP、CAPS、SCAR、SSR等分子標記技術構建了多張馬鈴薯分子遺傳圖譜，極大地增加了馬鈴薯分子遺傳圖譜密度（Tanksley et al.，1992；Collins et al.，1999）。值得注意的是，荷蘭瓦赫寧根大學van Os 等（2006）發(fā)表的以二倍體SH83-92-488×RH89-039-16雜交后代F1136個基因型為作圖群體，利用AFLP、SSR、RFLP、CAPS、SCAR分子標記技術，構建的馬鈴薯“超密圖譜”（UHD），包含12個連鎖群，總共含有10 365個標記，平均每個厘摩（cM）就有10個以上標記，是目前世界上密度最大的馬鈴薯分子連鎖圖譜。S?rensen等（2008）利用包含 186個基因型的馬鈴薯雙單倍體的BC1群體，借助AFLP和SSR標記對其親本分別構建了含15個連鎖群的分子遺傳連鎖圖譜，獲得分別含有158、137個標記的兩套圖譜，長度分別為882、1 099 cM，其中在Ⅰ染色體上分別含SSR標記為6、5個。

Luo等（2000）創(chuàng)建了根據同源四倍體親本及全同胞子代表現(xiàn)型篩選的遺傳標記預測四倍體個體基因型理論與統(tǒng)計方法，并以蘇格蘭作物研究所四倍體中間材料12601ab1與 Stirling親本及其74個F1基因型為模擬作圖群體，利用一組SSR標記數據模擬構建了一張四倍體馬鈴薯遺傳圖譜。Hackett和Luo（2003）開發(fā)出適用于同源四倍體物種構建連鎖圖譜的Tetraploid Map軟件，為四倍體馬鈴薯分子連鎖圖譜的構建提供了理論支持和技術保障。根據同源四倍體的基因型理論、統(tǒng)計方法與Tetraploid Map軟件，Bradshaw等（2008）以12601ab1×Stirling雜交后代F1227個基因型為作圖群體，利用38對AFLP引物組合和6對SSR引物構建了兩個親本含有514個標記的12個連鎖群的四倍體分子遺傳連鎖圖，其中母本12601ab1遺傳圖譜上有293個SSR標記，父本 Stirling遺傳圖譜上有 221個 SSR標記，通過超高密度圖譜的定位信息，利用 SSR標記STM3160和STM5140、STM3179和STM5148分別對Ⅳ、Ⅴ染色體進行精確鑒定，為準確構建遺傳圖譜提供了重要信息。

我國關于馬鈴薯分子遺傳圖譜的研究較少，金黎平等（2007）利用二倍體08675221×09901201雜交后代F1125個基因型通過AFLP標記技術構建了我國第一張馬鈴薯遺傳連鎖圖譜，母本圖譜含75個標記，12個連鎖群長度為512 cM，父本圖譜含95個標記，12個連鎖群長度為578 cM。單友蛟等（2010）利用上述親本F1167個基因型為作圖群體，應用SSR標記構建了一張二倍體馬鈴薯分子遺傳圖譜，其總長度為645 cM的遺傳連鎖圖譜，該圖譜包含86個SSR標記，且較為均勻分布在各染色體上，每個染色體上的標記數為3～13個，距離為2～128 cM，標記間平均距離為7.5 cM。

較多的遺傳圖譜研究結合AFLP與SSR標記技術，相對于多態(tài)性較強的AFLP，SSR標記只擴增 1個位點，具有通用性，有利于比較以不同遺傳背景構建的多張遺傳圖譜，這對于確定連鎖群所屬的染色體以及基因位點具有重要的意義。

基因定位是篩選與目標基因緊密連鎖的遺傳標記，它是基因圖位克隆和分子輔助選擇育種的前提。近年來，國外開展了許多馬鈴薯抗病蟲和農藝性狀及加工品質性狀QTL定位的研究，如：抗晚疫?。∣berhagemann et al.，1999；Wickramasinghe et al.，2009）、抗蟲（Caromel et al.，2003）、休眠期（Freyre et al.，1994a；?liwka et al.，2008）、產量（Sch?fer-Pregl et al.，1998；Bradshaw et al.，2008）、淀粉含量（Sch?fer-Pregl et al.，1998；Bradshaw et al.，2008）、還原糖含量（Menendez et al.，2002；Li et al.，2005）、花青素含量（Zhang et al.，2009）及油炸顏色（D’hoop et al.，2008；Bradshaw et al.，2008）等。以二倍體馬鈴薯為材料，F(xiàn)reyre和Douches（1994b）將控制塊莖比重的10個QTLs定位在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅺ等染色體上；Schafer-Pregl等（1998）將控制淀粉含量的18個QTLs定位在12個連鎖群上，同時將控制產量的8個QTLs定位在8個連鎖群上；Chen等（2001）將編碼控制淀粉代謝酶的17個QTLs定位在12個連鎖群上。以四倍體馬鈴薯為材料，Li等（2008）將解釋 54.0%的淀粉含量表型變異的 10個 QTLs定位在Ⅲ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅺ等連鎖群上，同時將解釋26.1%淀粉產量表型變異的6個QTLs定位在Ⅲ、Ⅴ、Ⅺ等連鎖群上，其中用SSR標記在Ⅺ染色體上與STM0037緊密連鎖的等位基因對淀粉含量的貢獻率為5.5%，對炸片色澤貢獻率2.7%；Bradshaw等（2008）利用四倍體馬鈴薯親本及其全同胞子代，對干物質含量、抗瘡痂病等16個農藝性狀和加工品質性狀進行了定位分析，總共定位了39個QTL，其中在第Ⅴ染色體上定位了1個貢獻率為56%的熟性QTL，同時在Ⅴ染色體上定位了1個貢獻率為9.7%的干物質含量QTL。Khu等（2008）以四倍體馬鈴薯抗環(huán)腐病與易感環(huán)腐病雜交后代 92個基因型為分離群體，將一個重要的貢獻率為 43%的抗環(huán)腐病 QTL定位在第11號染色體上，同時檢測到了一個較小的貢獻率為12%的抗環(huán)腐病QTL；McCord等（2011）以四倍體馬鈴薯親本及全同胞子代 163個基因型為作圖群體，構建了兩個親本的連鎖圖譜，即易發(fā)生熱壞死生理病害品種大西洋13個連鎖群，抗熱壞死B1829-5品系14個連鎖群，并將抗熱壞死QTL定位在第4、5、7連鎖群上，且1個SSR標記與兩個群體的熱壞死癥狀緊密關聯(lián)。

我國關于馬鈴薯農藝性狀與品質性狀基因定位的研究較少，金黎平（2006）以二倍體為材料，通過AFLP和SSR標記，采用區(qū)間作圖和多QTL復合作圖方法對4種加工及農藝性狀進行了QTL定位及遺傳效應分析，在親本遺傳圖譜的10個連鎖群上，共檢測到39個QTL。其中控制炸片顏色的QTL 19個，控制干物質含量的QTL 13個，控制單株結薯數的QTL 7個，沒檢測到控制單個塊莖質量的QTL。單友蛟等（2010）以二倍體為材料，通過SSR標記與復合區(qū)間作圖法對馬鈴薯塊莖相關的3 個重要農藝性狀進行QTL定位和遺傳效應分析，結果在第5條染色體上檢測到控制3個塊莖性狀的QTL各1個，其中控制單株產量的QTL 遺傳貢獻率為12.3%，控制單薯質量的QTL遺傳貢獻率為16.1%，控制塊莖比重的QTL遺傳貢獻率為11.2%。

2.3 分子標記輔助育種

分子標記輔助育種（Molecular Marker-assisted Selection，MAS）是現(xiàn)代分子生物學與傳統(tǒng)育種相結合，借助分子標記對育種材料在DNA水平上早期有目標地進行選擇，避免了依賴于表型特征間接推斷其基因型，從而達到作物產量、品質和抗性等綜合性狀的高效改良。與傳統(tǒng)的根據基因型反映出來的表型性狀選擇相比，分子標記輔助育種具有在早期世代和植株生長的任何階段進行，SSR分子標記共顯性的特點可以在雜合體階段鑒定隱性基因，對目標基因的選擇不受基因表達和環(huán)境條件的影響等優(yōu)點，尤其是針對處于雜合狀態(tài)的同源四倍體馬鈴薯更為重要。

Bormann等（2004）以易感晚疫病品種Leyla為父本，分別以較強田間抗性的Escort（含有特異基因R1、R2、R3、R10）和 Nikita（至少含有特異基因R1）品種為母本，分別在兩個雜交后代F1分離群體中選取熟性且對晚疫病抗性不同的84、95個基因型，利用定位在連鎖群上（除第10個連鎖群外）的30個基于PCR的標記對篩選，根據田間熟性評價和對晚疫病抗性鑒定結果，認為熟性、抗晚疫病基因標記在Nikita后代群體對表型貢獻率為38%，而對Escort后代表型貢獻率僅為15%，這與其母本的遺傳差異有關，并提出了分子輔助選擇的實驗性方案。Carrasco等（2009）設計了持久抗晚疫病分子輔助選擇育種策略，即通過高通量標記將主效R基因或晚疫病抗性QTL導入骨干育種材料中，其程序主要分為：第一，將對抗晚疫病貢獻率大的數量性狀基因PiXspg精細定位；第二，轉換基于SNP和AFLP標記為易于應用的標記；第三，對存在R基因的子代綜合評價晚疫病抗性和農藝性狀；第四，將新的抗性資源通過回交方式導入馬鈴薯，利用與晚疫病抗性基因Rpi-phu1緊密連鎖的標記GP94對育種材料進行篩選；第五，在田間進行評價馬鈴薯無性系對晚疫病抗性的提高程度；第六，通過倍性培育抗性群體和篩選標記完善分子輔助抗病性育種。Wickramasinghe等（2009）以具有晚疫病抗性的二倍體雜交后代分離群體為研究材料，以3個分子標記OPA17559（距對晚疫病抗性貢獻率為23.4%的QTL 12 cM）、OPA03576、GP198F-1（來源于RFLP標記GP198，與對晚疫病抗性貢獻率為23.4%的QTL緊密連鎖），經篩選發(fā)現(xiàn)它們的存在與晚疫病抗性高度相關，認為這3個標記對分子標記輔助選擇抗晚疫病育種非常有效。Moloney等（2009）將對抗馬鈴薯白線蟲變種Pa2/3貢獻率大的一個數量位點GpaIVsadg定位在第5連鎖群上，在含該位點的C1992/31育種材料和易感品種Record雜交的F1群體中鎖定該目標位點，利用與該位點緊密連鎖SSR標記STM3016和SNP多態(tài)性C237（119）篩選回交子代的 178個基因型，結果表明，分子標記輔助策略對選擇持久、高抗馬鈴薯白線蟲變種Pa2/3品種有效。Sagredo等（2009）在71個育種親本（其中30個具有一定程度的抗性，17個攜帶RYSC3標記）組配雜交組合后代中，利用與高抗馬鈴薯Y病毒Ryadg基因連鎖的序列特異性擴增區(qū)（Sequence-characterized Amplified Region，SCAR）標記RYSC3進行分子標記輔助選擇，發(fā)現(xiàn)在3個不同組合共460個子代中有299個基因型含RYSC3標記且抗Y病毒，除一個選擇不準確外；在不含RYSC3標記其他群體中有22.5%表現(xiàn)為抗Y病毒，可能存在其他R抗性基因。結果表明，在選育高抗馬鈴薯Y病毒品種過程中，采用RYSC3標記輔助選擇含Ryadg基因的子代是有效性的，達到97.7%。

3 展望

栽培馬鈴薯為同源四倍體無性繁殖作物，為四體遺傳，其規(guī)律非常復雜。馬鈴薯育種過程中存在許多困難，包括細胞高度雜合性、基因分離復雜、花粉不育、雜交不親和、現(xiàn)有栽培種基因庫狹窄、缺乏抗病和抗逆基因。馬鈴薯種質資源中 75%以上為二倍體野生種，通過孤雌生殖誘導雙單倍體和2n配子等方法將優(yōu)良品質和抗病基因導入栽培種，再利用分子標記輔助選擇策略豐富拓寬基因庫和加速培育優(yōu)質高抗（抗病、抗蟲、抗逆）品種。與其他分子標記技術相比，SSR分子標記技術是一種較為快捷、簡單、穩(wěn)定的遺傳標記，通過將質量性狀和數量性狀基因的精細定位，開發(fā)出大量與之緊密連鎖的SSR標記，其在馬鈴薯遺傳育種研究中的應用前景將更加廣闊。

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