崔新愛 王 玲 孔德領(lǐng) 顧漢卿

1(南開大學(xué)藥學(xué)院和天津市分子藥物研究重點實驗室，生物活性材料教育部重點實驗室，天津 300071)

2(天津市泌尿外科研究所，天津 300211)

引言

缺血性血管疾病包括冠心病和外周血管閉塞性疾病已成為世界上發(fā)病率和死亡率均占主導(dǎo)地位的疾病之一[1]。組織需要周圍的毛細(xì)血管提供氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，供應(yīng)不足就會導(dǎo)致缺氧，引起細(xì)胞凋亡。傳統(tǒng)的血運(yùn)重建治療包括冠狀動脈搭橋術(shù)(CABG)和經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈成形術(shù)(PTCA)，對多數(shù)患者可以增加冠狀動脈灌注，基本實現(xiàn)治療目的，但對冠狀動脈纖細(xì)和病變彌散的患者這些治療手段則難以奏效。以改善缺血為目的，治療性血管新生通過導(dǎo)入促血管生長因子，刺激新血管的形成和成熟，從而增加缺血部位的血液灌注已成為當(dāng)前缺血性血管疾病治療的研究熱點。其中血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是動物實驗和臨床試驗中研究最多的一種促血管生長因子。該生長因子是一種特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的多肽類因子[2]。盡管在缺血狀態(tài)下，機(jī)體組織細(xì)胞中VEGF的表達(dá)會迅速增加，但是這種內(nèi)生性VEGF的表達(dá)增加，常常不足以盡快建立側(cè)支循環(huán)或恢復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞的完整性。當(dāng)給予外源性VEGF后，新生血管則會明顯增加，側(cè)支血流供應(yīng)改善，內(nèi)皮依賴性功能和結(jié)構(gòu)恢復(fù)[3]。

VEGF具有多種生物學(xué)活性，如促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管新生、促進(jìn)多種血管活性物質(zhì)合成、促進(jìn)血管舒張、抑制血栓形成、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、參與卵泡的發(fā)育和成熟等[4-5]，其中促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用具有高度特異性。而且VEGF作為一種局部內(nèi)生性調(diào)節(jié)劑，還起著維持血管的正常形態(tài)和完整性的作用[6]。

然而，與其它生長因子相似，VEGF由于半衰期短而導(dǎo)致體內(nèi)降解速度過快，從而限制了它的臨床應(yīng)用。VEGF大劑量全身給藥雖然可以促進(jìn)局部血管生成，但也可以導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用，常見的風(fēng)險是VEGF可能促進(jìn)腫瘤的血管新生，并且可能促進(jìn)隱匿存在的惡性腫瘤的生長，還可能使增殖性或出血性視網(wǎng)膜病加重，以及反復(fù)性發(fā)作低血壓、非靶向組織血管生成、動脈粥樣硬化等，因此需要采取局部緩釋的給藥方式[7]。研究表明，VEGF緩釋給藥效果明顯優(yōu)于直接給藥[8]。因此，越來越多的研究者利用各種控制釋放載體，使VEGF在體內(nèi)以一個恒定的速率釋放，以保證其在治療過程中在局部缺血組織中的含量，從而增加新生血管的形成。下面將逐一介紹幾種VEGF控制釋放體系在組織工程中的最新進(jìn)展。

1 VEGF控釋體系

1.1 VEGF-微球體系

生長因子緩釋微球是指將生長因子溶解或分散在高分子材料基質(zhì)中形成的粒徑為1～250 μm的骨架型微小球狀實體。緩釋微球載體具有制備工藝簡便、緩釋藥物、靶向輸送，和在保證藥物治療作用的前提下減少給藥劑量，降低藥物毒性等優(yōu)點[9]。

常用于VEGF控釋的微球主要由乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)制備而成，這是因為PLGA降解速率適中，而且PLGA含有帶負(fù)電的羧基能與帶正電的VEGF相互作用。最近，F(xiàn)abio等構(gòu)建了直徑約為5 μm 的 PLGA 微球來負(fù)載 VEGF[10]。該微球可持續(xù)釋放活性 VEGF，每毫克微球載 VEGF為 0.58 μg，包封率約83.8%，可明顯促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的增殖和分化，優(yōu)于單用同等劑量VEGF的效果。分別用載 VEGF微球(2 mg微球)組、單純VEGF注射組(100 ng)和空載微球組來治療大鼠急性心肌梗死，在梗死邊緣四個位點進(jìn)行注射，四周后取材觀察，結(jié)果顯示載VEGF微球治療組不僅促進(jìn)了小口徑血管的明顯生長，對動脈血管的再生也有較大的促進(jìn)作用，血管生成數(shù)幾乎為單純注射VEGF組和空載微球組的一倍。組織中的血管再生促進(jìn)了整個組織的重塑，載VEGF微球治療組與對照組相比大鼠左心室壁有明顯的增厚，表明了該微球緩釋系統(tǒng)在VEGF治療缺血性疾病方面有潛在優(yōu)勢。

Lee等構(gòu)建了PLGA微球和海藻酸鈣水凝膠復(fù)合體系，將包裹人重組血管內(nèi)皮生長因子(rhVEGF)的復(fù)合體系注射到小鼠皮下，觀察新血管的形成[11-12]。3周內(nèi)，rhVEGF從微球中緩慢持續(xù)釋放，并保持活性。復(fù)合體系促內(nèi)皮細(xì)胞增殖效果明顯，且皮下注射后，小鼠心血管肉芽組織形成明顯多于單劑量注射 VEGF。他們對構(gòu)建的下肢缺血裸鼠，分別注射單純 rhVEGF，載 rhVEGF水凝膠和載VEGF 微球-水凝膠復(fù)合體系(1 μg VEGF/mouse)，4周后復(fù)合體系的療效最明顯，裸鼠的后肢再生基本完整。充分表明該體系在治療缺血性疾病方面的優(yōu)勢。Cristina等以Ⅰ型膠原為支架負(fù)載包裹VEGF的PLGA微球[13]，發(fā)現(xiàn)該復(fù)合體系可以長達(dá)10周持續(xù)釋放有活性的VEGF;體內(nèi)雞胚絨毛尿囊膜模型實驗觀察到該體系顯著提高了血管肉芽組織的形成，與直接加入VEGF的膠原支架相比，其新生血管數(shù)提高了2.5倍，且未出現(xiàn)異常性血管增生，表明支架中VEGF的控制釋放對于治療性血管新生的重要性。

微球載體是目前研究相對廣泛也比較理想的藥物載體，其制備方法簡便，且通過化學(xué)或物理修飾與VEGF結(jié)合，載藥量高，體外釋放也均達(dá)到20 d以上。微球載體在體內(nèi)治療下肢缺血和心肌梗死方面有較好的療效，使用載1 μg劑量的VEGF的載體進(jìn)行治療，一個月左右缺血部位即有顯著的血管新生和組織再生;但由于其存在體內(nèi)流動性且容易被巨噬細(xì)胞所吞噬等缺點，越來越多的研究者趨向于將緩釋微球和其他材料(如膠體)復(fù)合，結(jié)合兩者的優(yōu)點達(dá)到更佳的緩釋效果。

1.2 VEGF-納米顆粒體系

生長因子緩釋納米粒是一類以天然或合成的高分子材料為載體的粒徑為10～100 nm的固態(tài)載藥膠體微粒，生長因子溶解在液態(tài)核中或吸附在其表面。與微球相比，納米顆粒的制備技術(shù)相對要求較高，但其具有物理穩(wěn)定性好、生物利用度高、有肝脾和骨髓靶向性、不易阻塞血管等優(yōu)點。

Golub等構(gòu)建了一種載 VEGF的可注射PLGA納米顆粒體系(VEGF-NPs)，建立小鼠股動脈缺血模型測定其對小鼠后肢血運(yùn)重建的作用，小鼠麻醉后將其股動脈和靜脈結(jié)扎并將該區(qū)域切除，分別注射 VEGF-NPs、VEGF 和生理鹽水[14]。4 d 后用三維斷層掃描血管造影觀察血管的生長和形態(tài)，結(jié)果顯示VEGF-NPs處理組的小鼠與其它組相比總血管量和血管連接有明顯增加，其血管形成總量超過VEGF組一個數(shù)量級，表明PLGA負(fù)載VEGF緩釋納米粒的促血管生成作用在組織工程和心血管藥物的應(yīng)用方面有著廣闊的應(yīng)用前景。

因為VEGF分子結(jié)構(gòu)中含有能與肝素結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，因此Chung等開發(fā)了肝素修飾的 PLGA納米粒子用于運(yùn)載 VEGF[15]。他們研究了肝素功能化納米顆粒/纖維蛋白膠復(fù)合物負(fù)載VEGF，對于血管生成的生物學(xué)活性以及治療效應(yīng)[16]，根據(jù)小鼠皮下埋植模型中毛細(xì)血管密度觀察，肝素功能化組有顯著增加的生物學(xué)活性;并且，在小鼠后肢缺血模型中，功能化納米顆粒復(fù)合物明顯提高了治療性血管生成因子的作用，小鼠后肢血壓明顯恢復(fù)，血管生成量和脈絡(luò)密度有明顯增加。

Tan Q等通過物理自組裝法制備了一種肝素/殼聚糖納米顆粒，直徑為 67～132 nm。將該載VEGF納米粒子固定到牛頸靜脈脫細(xì)胞支架上，觀察其對支架的血管化作用[17]。分別用低濃度VEGF組(50 ng/mL)和高濃度 VEGF組(250 ng/mL)評價了支架體內(nèi)和體外的血管化。該固定了載VEGF肝素/殼聚糖納米顆粒的支架在體外可持續(xù)幾周高效緩釋 VEGF，30 d內(nèi)低濃度組 VEGF釋放率約為37.12%，高濃度組釋放約42.17%，并且明顯地刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖;將這種支架埋植到小鼠皮下，分別于4周和8周取材，組織學(xué)分析顯示該載VEGF納米顆粒顯著增加了成纖維細(xì)胞浸潤，細(xì)胞外基質(zhì)的形成，并且在小鼠皮下埋植模型中加速了血管化。這項研究提供了一種新的加速組織工程支架再生的方法，很有應(yīng)用前景。

采用納米顆粒載體技術(shù)，可以提高VEGF的負(fù)載量，顆粒的溶解速率也將隨著顆粒尺度的縮小而顯著提高。此外，顆粒能將VEGF轉(zhuǎn)運(yùn)到特定靶位，在病灶處合理釋放，提高了VEGF利用率的同時，避免了藥物對其他部位的不良刺激，可設(shè)計靶向性載VEGF納米顆粒來治療特定部位的缺血性疾病。但是單獨(dú)使用納米顆粒作為載體，其對VEGF的釋放速率較快，幾天后就基本完全釋放，因此將其與支架或凝膠相結(jié)合，也是提高其釋放及原位固定效果并使其在組織工程領(lǐng)域有著更為廣闊的應(yīng)用前景。

1.3 VEGF-水凝膠體系

由于水凝膠與很多組織細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)相似，可以在相對溫和的條件下制備處理，釋放傳遞過程中可減小感染概率，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用作為藥物和各類細(xì)胞生長因子釋放的載體材料。如前所述，它們也常作為基質(zhì)負(fù)載微球來更好地實現(xiàn)VEGF的原位控釋，以避免載藥微球和納米粒被巨噬細(xì)胞所吞噬。常用的有天然高分子水凝膠包括海藻酸鹽、殼聚糖、瓊脂糖、膠原、明膠和透明質(zhì)酸等形成的水凝膠，以及合成高分子水凝膠：聚氧乙烯、聚乙烯醇和聚丙烯酸膠等[7]。

Silva等制備了一種可注射海藻酸鹽水凝膠體系[18]。他們通過部分氧化聚合物鏈和改變聚合物的相對分子質(zhì)量分布，可以控制海藻酸凝膠的降解速率，從而控制生長因子的釋放速率。將該體系注射到缺血部位，可持續(xù)釋放相對低量的有活性VEGF達(dá)15 d，而單純注射的VEGF在72 h之后全部被清除。小鼠后肢缺血部位的新生血管明顯增加;缺血再灌注影像顯示注射該水凝膠體系28 d之后，組織的血流灌注已接近正常水平，而單純注射VEGF組卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到正常水平。表明該可注射降解可控的水凝膠體系能夠顯著促進(jìn)治療性血管新生。

Tabata等研究了膠原凝膠中VEGF的體內(nèi)釋放，用I125標(biāo)記VEGF包裹于膠原凝膠中，埋植于小鼠背部皮下，膠原凝膠用不同劑量的戊二醛交聯(lián)不同的時間，隨著交聯(lián)濃度和時間的增加，膠原凝膠的降解速率越慢，VEGF的釋放時間也越長;與 VEGF溶液和空膠原凝膠對照組相比，埋植載VEGF的膠原凝膠組周圍有更顯著的血管新生[19]。

與微球和納米粒子相比，水凝膠主要通過物理吸附和包裹負(fù)載 VEGF，因此通常載藥量較低，VEGF易失活，需負(fù)載高于微球和納米粒子的劑量(1～3 μg)，兩周左右基本釋放，且釋放速率較快，一般為兩周左右，但是由于其材料的溫和性，在體內(nèi)常用于缺血部位的原位注射以及美容整形的皮下注射。

1.4 VEGF-組織工程支架體系

尋找適宜的方法將生長因子負(fù)載于支架材料中，達(dá)到緩慢控制釋放，防止生長因子從釋放部位迅速擴(kuò)散，達(dá)到有效刺激細(xì)胞的增殖、分化、生長與組織再生同步的目的，已成為組織工程學(xué)的重要研究內(nèi)容。

采用聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物PLGA等制備的多孔支架，由于其制作過程復(fù)雜，大都要用到有機(jī)溶劑并需要水溶液后處理。從保持生長因子活性和載藥量考慮，很難將生長因子直接加入到聚合物單體原料中共處理?？梢詫⑸L因子包埋于疏水性可降解聚合物的微粒中，在多孔支架的制備過程中加入到基質(zhì)材料中。但這種方法有操作復(fù)雜、載藥量低、生長因子釋放速率不易調(diào)控等問題。而利用生物學(xué)方法對已成型的多孔支架進(jìn)行表面處理，將生長因子負(fù)載在支架上，不但操作簡單，且可以保持生長因子的活性，有一定緩釋效果，是目前一種較好的方法。徐曉峰等通過物理吸附的方法將VEGF負(fù)載于納米羥磷灰石膠原(nano Hydroxyapatite/collagen，nHAC)上，制備成VEGF+肝素/纖維連接蛋白(HP/FN)+nHAC緩釋支架。經(jīng)Elisa方法檢測，證明了該緩釋支架能夠延緩VEGF的釋放，具有一定的緩釋效果[20]。實驗中人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(h MSCs)經(jīng)誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞后種植于該緩釋支架，通過計算細(xì)胞黏附率、支架內(nèi)的細(xì)胞數(shù)及掃描電鏡觀察，證實了 VEGF+HP/FN+nHAC緩釋支架無細(xì)胞毒性，且更有利于細(xì)胞的黏附生長和分化，能使成骨誘導(dǎo)的種子細(xì)胞表達(dá)更強(qiáng)的成骨能力，表現(xiàn)出優(yōu)良的生物相容性。

戴建武和Radisic小組則分別用不同的化學(xué)方法將VEGF共價固定到多孔的膠原支架上，并都證實了這種共價結(jié)合了VEGF的膠原支架能很好的促進(jìn)血管生成和組織再生[21-23]。例如，Radisic小組將VEGF和血管生成素1(Ang1)共價結(jié)合到三維多孔膠原支架上，體外種植內(nèi)皮細(xì)胞，3 d后，VEGF/Ang1修飾支架組的內(nèi)皮細(xì)胞與未修飾支架和游離生長因子對照組相比有明顯的增殖，有較高的乳酸生成率和葡萄糖消耗率;7 d后，修飾了生長因子的支架上由內(nèi)皮細(xì)胞生成的管狀組織增加，并且內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性增強(qiáng)[22]。

孫勇等采用兔橈骨完全性骨缺損模型，將復(fù)合有VEGF或骨形態(tài)發(fā)生蛋白的納米陶瓷人工骨植入動物骨缺損處，比較其修復(fù)骨缺損能力，分析其促進(jìn)骨生成機(jī)制[24]。復(fù)合人工骨中含 VEGF約300 ng/cm3，能有效緩釋約10 d。在術(shù)后8周前，成骨體積、血管數(shù)均是復(fù)合血管內(nèi)皮生長因子組＞復(fù)合骨形成蛋白組，組織學(xué)切片發(fā)現(xiàn)在血管長入、骨生成、骨塑型等方面復(fù)合VEGF組均略早于復(fù)合骨形成蛋白組。證明復(fù)合VEGF的納米陶瓷人工骨修復(fù)材料能滿足骨組織替代的要求，修復(fù)骨缺損的效果確切，其特點是能促進(jìn)人工骨早期血管化和成骨。

支架材料在固定生長因子方面與微球和納米粒子類似，載藥量相對較高，釋放速率也可達(dá)到移植部位組織修復(fù)的要求，由于支架的穩(wěn)定性和可加工成型特性，雖然其有效緩釋時間不到兩周，但其在早期的促血管化作用影響了之后長達(dá)數(shù)周的血管新生和組織再生，在血管移植尤其是骨組織修復(fù)方面有著不可替代的作用。

1.5 VEGF基因載體

為克服單純蛋白質(zhì)治療的缺點，人們考慮應(yīng)用VEGF基因治療，即將外源VEGF基因?qū)肽康募?xì)胞并有效表達(dá)，從而達(dá)到治療目的。

基因治療需要合適的載體，目前被研究應(yīng)用最多的是腺病毒載體[25]。腺病毒載體能有效感染多種細(xì)胞，不整合入宿主細(xì)胞基因組，在增殖緩慢或靜止型的細(xì)胞中仍可轉(zhuǎn)錄，因而得到廣泛應(yīng)用[26]。ZHANG等構(gòu)建了攜帶VEGF和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)的重組腺病毒(adeno-associated virus，AAV)載體，并轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，7 d后綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的表達(dá)明顯增加，28 d后仍可檢測到;在大鼠后肢缺血模型中，GFP的表達(dá)從注射后第四周開始增加，在第八周仍可檢測到?；蜣D(zhuǎn)然后8周，AAV-VEGF/BMP組的平均血流量明顯增加[27]。該研究表明：腺病毒載體介導(dǎo)的VEGF和BMP基因轉(zhuǎn)染可刺激血管生成和骨再生，可能為股骨頭缺血性壞死的治療提供新的策略。

由于病毒載體具有潛在的致癌毒性和免疫原性，非病毒載體作為其替代物在基因治療方面有著較快的發(fā)展，非病毒轉(zhuǎn)基因載體能夠濃縮質(zhì)粒，被細(xì)胞內(nèi)吞并進(jìn)入細(xì)胞核，從而使質(zhì)粒表達(dá)它們，且制備簡單，費(fèi)用低，易于大規(guī)模生產(chǎn)等，但有轉(zhuǎn)染效率低，一過性表達(dá)等缺點。Zhou等以pcDNA3質(zhì)粒為載體介導(dǎo)VEGF基因轉(zhuǎn)染大鼠MSCs，以縫扎左冠脈前降支起始部方式構(gòu)建大鼠心肌缺血模型，2周后以心肌內(nèi)注射方法移植轉(zhuǎn)染VEGF基因干細(xì)胞，并設(shè)對照組、基因組、干細(xì)胞組[28]。4周后以免疫組化染色及測定毛細(xì)血管密度檢測療效，結(jié)果顯示各治療組不同程度的心功能改善，以轉(zhuǎn)基因干細(xì)胞組心功能改善最為顯著，心肌梗死范圍明顯小于其他組。既保證了血管的新生以促進(jìn)心功能的改善，又不至于引起血管再生的過度或畸形。轉(zhuǎn)染VEGF基因MSCs在抑制心室擴(kuò)張，限制心室重構(gòu)及促進(jìn)心肌細(xì)胞修復(fù)，緩解心功能進(jìn)行性下降等方面優(yōu)于單純的細(xì)胞治療或基因治療。

通過載體介導(dǎo)能表達(dá)VEGF蛋白的基因，并轉(zhuǎn)染干細(xì)胞，可獲得局部持續(xù)、穩(wěn)定、高效表達(dá) VEGF蛋白的能力，并且有利于VEGF濃度的精準(zhǔn)維持和生理性負(fù)反饋調(diào)節(jié)，因此能更好地調(diào)控血管新生的程度，從而加強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因干細(xì)胞對缺血性疾病的療效。與傳統(tǒng)載體微球、納米粒子、支架和水凝膠相比，新型的基因載體從根源上解決了VEGF蛋白的來源，在治療心肌梗死和缺血性壞死方面有著顯著的療效，但其有無長期的副作用還有待進(jìn)一步的考察。

2 問題與展望

近年來，VEGF緩釋體系的研究在取得一定成績的同時也存在著諸多問題。對于蛋白質(zhì)藥物的傳遞及緩控釋放，高分子微球、納米顆粒以及水凝膠體系給藥方便，且廣泛應(yīng)用。但對于組織修復(fù)用各種生長因子，組織工程支架方法則可以達(dá)到很好的控釋和定位治療效果且在組織生長方面有很大優(yōu)勢。但是因為需要手術(shù)植入而造成創(chuàng)口，為其美中不足。目前很多研究工作者致力于改進(jìn)載體制備方法，應(yīng)用不同材料制成混合材料或同時配合微球、水凝膠以及基因載體技術(shù)實現(xiàn)其注射方式給藥。尋求以復(fù)合載體作為解決問題的突破口構(gòu)建緩釋體系，以靶向性高、釋藥平穩(wěn)有效、定量準(zhǔn)確、有利于組織再生為目的不斷改善生長因子緩釋體系的制備方法，從而實現(xiàn)VEGF穩(wěn)定、有效地釋放。

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