喬 俊,馬淑梅,李英普,宋志恒,易賀慶,侯吉光,賈立立,譚哲峰,劉曉冬*,王鐵君*

（1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 腫瘤放療科,吉林 長春 130021;2.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生部放射生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林長春 130021;3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 骨科,吉林 長春 130021;4.吉林省大唐長山電廠職工醫(yī)院,吉林 松原 138000）

自噬（autophagy）是細(xì)胞通過溶酶體來降解和消化自身受損、衰老以及喪失功能的蛋白、細(xì)胞器和部分細(xì)胞質(zhì)等生物分子的過程。自噬過程是真核細(xì)胞特有的,為細(xì)胞的再生與修復(fù)提供原料,實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的再循環(huán)與再利用[1]。但自噬在腫瘤中起保護(hù)還是抑制作用還不明確,腫瘤在電離輻射誘導(dǎo)下是以自噬為主還是凋亡為主還有待研究。近年研究表明P53與自噬與凋亡都有關(guān)系。P53在正常細(xì)胞是短壽命的,含量極少,但在哺乳動(dòng)物細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)時(shí)起主要作用,通過調(diào)控細(xì)胞周期,DNA損傷的修復(fù),衰老,血管生成和細(xì)胞凋亡的基因轉(zhuǎn)錄活性而發(fā)揮作用[2]。近來研究表明,P53也對(duì)Caveolin-1,TSAP6,CHmp4C,和DRAM產(chǎn)生影響從而對(duì)自噬發(fā)揮作用[3]自噬被PI3K嚴(yán)格調(diào)控,哺乳動(dòng)物的自噬過程通常被認(rèn)為PI3KⅠ通過激活A(yù)kt-mTOR激酶抑制自噬,而PI3KⅢ通過調(diào)節(jié)P-tdIns（3）P促進(jìn)自噬,但是缺乏PI3KⅠ調(diào)節(jié)自噬的直接證據(jù)[4]。有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,Akt的激活可以有效的促進(jìn)MDM2入核,從而與P53相互作用而抑制P53的轉(zhuǎn)錄活性[2]。最近研究發(fā)現(xiàn)MDM2蛋白是P53主要的負(fù)向調(diào)節(jié)蛋白,抑制P53-MDM2交聯(lián)可以在結(jié)構(gòu)與生物水平有效激活P53[5]。本研究通過對(duì)電離輻射后不同P53狀態(tài)的H1299細(xì)胞的自噬、凋亡相關(guān)蛋白的變化,來探討P53在電離輻射誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞死亡中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器 試劑:AKT、GAPDH、發(fā)光試劑盒（ECL）等均購自美國Santa Cruz公司,MDM 2購自Millpore公司,兔抗LC3購自cell signaling公司;二抗羊抗鼠購自中山金橋公司,二抗羊抗兔購自博士德公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與照射 人類肺腺癌細(xì)胞株（H1299）由本實(shí)驗(yàn)室保存,使用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),0.25%胰酶消化傳代。照射條件:美國VARIAN 3000ix醫(yī)用直線加速器,單次照射源皮距100cm,吸收劑量率3Gy/min,照射劑量分為0、4、8Gy。

1.3 H1299-P53和H1299-175H細(xì)胞模型的建立質(zhì)粒PcDNA3.1-175H/PcDNA 3.1-p53為本課題組構(gòu)建并保存,轉(zhuǎn)入 H1299細(xì)胞,分別加800 g·L-1/950μg/m lG418篩選,2周后G418耐藥性克隆形成,標(biāo)記H1299-175H/H1299-P53細(xì)胞。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡 將處理組細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化置于離心管中1 500 r/min離心5 min,棄上清,加入 1×PBS,1 500 r/m in,5min洗兩次。將細(xì)胞按1×105/ml密度加入400μl loading buffer置于流式管中,后加入Annexin V/PI各 5μl,4℃避光30min后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡情況。

1.5 免疫印跡 細(xì)胞加入50-200μl的細(xì)胞裂解液（Tris-HCI,NaCL,Triton X100）。4℃,12 000 r/m in離心5min。收集上清,定量后分裝于-70℃冰箱保存。蛋白煮沸5 min進(jìn)行變性,SDS-PAGE電泳。電泳后濕式轉(zhuǎn)印NC膜上（100V 90min）;5%脫脂奶粉封閉1.5 h,加1∶1 000稀釋的一抗于4℃搖床過夜;TBS洗膜3次;加1∶1 000稀釋二抗反應(yīng)90 min,TBS洗膜3次,ECL顯色并記錄結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 LC3,AKT,MDM 2,Caspase-3,GAPDH基因與蛋白檢測(cè)結(jié)果采用Quantity One軟件進(jìn)行電泳條帶灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 H1299-P53,H1299-175H細(xì)胞模型檢測(cè)

將構(gòu)建的H1299-P53,H1299-175H細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)室保存的H1299細(xì)胞提取總蛋白,采用western bolt檢測(cè)轉(zhuǎn)染P53基因及Psuper-175H突變子的H 1299是否成功,經(jīng)western bolt檢測(cè),在相對(duì)分子量53 KB的位置檢測(cè)到蛋白表達(dá),證明構(gòu)建成功.由于P53是短壽命蛋白,檢測(cè)到微量表達(dá)。（見圖1）

圖1 P53基因檢測(cè)結(jié)果

2.2 P53基因?qū)?xì)胞凋亡的影響

采用Annexin V/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,H1299,H1299-P53,H1299-175H分別經(jīng)過電離輻射0GY,4GY,8GY,照射后16小時(shí)后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè),結(jié)果如圖2所示結(jié)果顯示,H1299（P53-/-）細(xì)胞凋亡率隨著照射劑量的增加而降低,而H1299-P53、H1299-175隨著照射劑量的增加而增加,H1299-P53凋亡增加顯著。

2.3 照射后 LC3,Ak t1,MDM 2,Caspase-3蛋白的變化

采用western bolt方法檢測(cè)AKT1,Caspase-3,MDM 2,LC3的變化,如圖3所示,灰度分析顯示,LC3在H1299呈現(xiàn)劑量正向依賴性,在H1299-175H呈現(xiàn)劑量負(fù)向依賴性,在H1299-P53中,0GY表達(dá)最高,4 GY表達(dá)最低,8GY表達(dá)低于假照組但比4GY高。AKT在H1299細(xì)胞隨著照射劑量的增加表達(dá)逐漸降低,在H1299-P53在4 GY表達(dá)量升高而在8 GY又降低,在H1299-175H細(xì)胞中AKT隨著照射劑量的增加表達(dá)逐漸降低。MDM 2在H 1299的表達(dá)呈劑量正向依賴性,在H 1299-P53細(xì)胞中呈現(xiàn)與AKT相同的變化趨勢(shì),在H 1299-175H細(xì)胞中4 GY時(shí)表達(dá)量最高8GY最低。Caspase-3在H1299細(xì)胞中隨著照射劑量的增加變化不明顯,在H1299-P53細(xì)胞中呈現(xiàn)劑量正向依賴性,在H1299-175H細(xì)胞中,0GY表達(dá)最高,4GY表達(dá)最低,8GY低于假照組但高于4 GY組。

圖2 照射后細(xì)胞流式分析結(jié)果

圖3 W estern bolt檢測(cè)凋亡白噬相關(guān)蛋白結(jié)果

3 討論

目前,肺癌已經(jīng)成為導(dǎo)致人類死亡的第二位癌癥[6]。放療是臨床上常用的肺癌治療手段,但是目前常用的放療方案難以完全殺滅腫瘤細(xì)胞,能否運(yùn)用放射治療與特定靶點(diǎn)基因聯(lián)合治療就成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率顯示,在H1299（P53-/-）細(xì)胞中,照射后凋亡率降低,結(jié)果提示電離輻射誘導(dǎo)H1299（P53-/-）的死亡方式不是以凋亡為主。在H1299-P53、H1299-175H細(xì)胞中,細(xì)胞凋亡率隨著劑量增加而增加,H1299-P53凋亡率增加更顯著,結(jié)果說明P53基因促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

我們進(jìn)一步檢測(cè)自噬相關(guān)基因及凋亡相關(guān)基因在相同電離輻射條件下的蛋白表達(dá)情況。LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表達(dá)是自噬的特異性指標(biāo),LC3的表達(dá)強(qiáng)度與自噬活性密切相關(guān)[7]。在H 1299細(xì)胞中,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值隨著照射劑量的增加而升高,表明自噬在照射后升高。而H1299-P53細(xì)胞中4GY照射組相對(duì)于假照組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低,8GY照射組相對(duì)于4GY照組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高,表明自噬在照射后降低,說明 P53抑制自噬的發(fā)生。在H1299-175H,4 GY照射組相對(duì)于假照組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低,8GY照射組相對(duì)于4GY照組LLC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值也降低,提示P53基因在電離輻射誘導(dǎo)下抑制細(xì)胞發(fā)生自噬。而三組假照組細(xì)胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ依次升高提示P53基因在沒有電離輻射條件下促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生自噬。

Akt是一個(gè)PI3KI下游重要的靶激酶,具有絲-蘇氨酸激酶活性Akt的活化可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白的各項(xiàng)功能,包括促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄與增殖、加強(qiáng)細(xì)胞的能動(dòng)性/粘附性、細(xì)胞周期進(jìn)程加速、加速腫瘤血管生成使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化[8]。AKT下游有一系列亞基包括FOXO,BAD,MDM 2,TSC2和GSK3,它們來促進(jìn)細(xì)胞增殖、生長與存活[9]。已有文獻(xiàn)證實(shí),電離輻射是通過抑制PI3K/AKT而發(fā)生自噬[8]。在H1299中AKT的表達(dá)量隨著照射劑量的增加而降低,表明電離輻射抑制了AKT的表達(dá),從而促進(jìn)自噬的發(fā)生。在H1299-P53細(xì)胞中AKT表現(xiàn)呈現(xiàn)劑量正向依賴性,而三組假照組細(xì)胞的AKT表達(dá)依次降低,說明P53在沒有電離輻射條件下抑制AKT的表達(dá)促進(jìn)自噬的發(fā)生,三組4GY照射組細(xì)胞AKT的變化不顯著。

MDM2維持細(xì)胞一系列基本功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子,也是癌癥治療的很有希望的藥物作用靶點(diǎn)。引起人們對(duì)MDM2廣泛的關(guān)注是其與腫瘤抑制蛋白P53的關(guān)系[10]。MDM2已經(jīng)被證實(shí)是腫瘤抑制子P53的一個(gè)負(fù)向調(diào)控子,主要通過兩種機(jī)制:（1）MDM2直接與P53的N末端結(jié)合抑制P53的轉(zhuǎn)錄激活[10];（2）MDM 2的E3泛素連接酶通過26S蛋白酶來修飾及降解P53[11]。在H1299細(xì)胞MDM2的表達(dá)呈現(xiàn)劑量依賴性升高,在H1299-P53細(xì)胞4G表達(dá)最高0GY最低,在H1299-175H細(xì)胞中4GY表達(dá)最高,8GY回落至最低。三組假照細(xì)胞H1299-175H細(xì)胞MDM 2增加最明顯。4GY照射組依次升高,8GY照射組依次降低。結(jié)果提示電離輻射通過激活MDM 2而負(fù)向調(diào)控P53。

凋亡的特征性指標(biāo)Caspase-3在H1299細(xì)胞中照射后變化不大,說明凋亡不是電離輻射誘導(dǎo)H1299細(xì)胞死亡的主要方式。在H1299-P53細(xì)胞中,caspase-3呈現(xiàn)劑量正向依賴性,說明p53在電離輻射條件下促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生自噬.而突變子H1299-175H在照射后凋亡降低,表明突變子已經(jīng)不具有正常P53的功能。

本課題研究選證實(shí)X射線引起H1299 P53（-/-）的死亡主要是以自噬性死亡為主,而引起H1299-P53及H1299-175H的死亡則以凋亡為主,從而為臨床尋求新的治療方案提供理論依據(jù)。

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