劉云霞 張 衛(wèi) 孫國(guó)新

(中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，北京，100085)

過氧化氫(H2O2)作為一種反應(yīng)活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，是細(xì)胞有氧代謝的產(chǎn)物［1］.因其化學(xué)性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，壽命較長(zhǎng)，較高的跨膜通透性，能在植物細(xì)胞間迅速擴(kuò)散，這些特點(diǎn)使其成為植物體內(nèi)重要的信號(hào)分子［2］.當(dāng)植物受到環(huán)境因素如生物脅迫(病蟲害，病原菌等)［3］，非生物脅迫(干旱，寒冷，鹽，重金屬等)時(shí)［4］，過氧化氫的含量會(huì)增加，調(diào)節(jié)植物生理功能，提高自身對(duì)環(huán)境脅迫的抗性.

強(qiáng)致癌物質(zhì)砷造成的污染已經(jīng)引起了世界各地的廣泛關(guān)注，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一.據(jù)世界衛(wèi)生組織公布，目前全球至少有5000多萬人口正面臨著地方性As中毒的威脅，而中國(guó)正是受砷危害最為嚴(yán)重的國(guó)家之一［5］.由于含砷礦山的開采、冶煉，含砷農(nóng)藥的使用，砷化合物作為養(yǎng)殖業(yè)飼料添加劑的廣泛利用，造成農(nóng)田土壤中砷污染［6-7］.砷不是植物生長(zhǎng)所必須的元素，植物對(duì)砷的吸收和積累可以造成生物毒性，降低糧食作物的產(chǎn)量和品質(zhì).如水稻中砷積累造成其它營(yíng)養(yǎng)元素含量降低［8］.

植物受到重(類)金屬的脅迫，會(huì)產(chǎn)生大量的過氧化氫［9］.砷的脅迫作用也可以造成植物體內(nèi)過氧化氫含量增加［4］.但植物體內(nèi)砷的積累和過氧化氫含量的關(guān)系，不同濃度的砷對(duì)植物體內(nèi)過氧化氫含量的影響，還缺乏深入研究.

本文采用模式植物野生型和水楊酸含量減少的突變體的兩種擬南芥，對(duì)在不同砷暴露濃度下過氧化氫的含量及其相互關(guān)系進(jìn)行了研究.

1 材料與方法

1.1 擬南芥及培養(yǎng)方法

本試驗(yàn)以模式植物擬南芥野生型(Wild Type，WT)和水楊酸含量減少的突變體(SA inductiondeficient，sid2)的兩種類型作為供試材料［10］.兩種擬南芥分別在蛭石和花土(1∶1混合)的介質(zhì)上進(jìn)行培養(yǎng).整個(gè)培養(yǎng)均在光照培養(yǎng)箱［MLR-351H sanyo，Japan］中進(jìn)行.培養(yǎng)箱設(shè)置條件:16 h光/8 h暗;光照強(qiáng)度250 μE·m－2·s－1;溫度22℃;相對(duì)濕度70%.

生長(zhǎng)一個(gè)月后，將擬南芥幼苗移入營(yíng)養(yǎng)液中［11］，營(yíng)養(yǎng)液中五價(jià)砷(Na3AsO4)的濃度分別為0、75、150、300 mmol·L－1.每3 d更換一次營(yíng)養(yǎng)液，以保證營(yíng)養(yǎng)液沒有明顯的其它生物如藻，菌的生長(zhǎng).在培養(yǎng)的第2、4、6天收集擬南芥地上部，用超純水清洗干凈，放入－80℃冰箱冷凍儲(chǔ)存待用.

1.2 測(cè)定總砷樣品的制備及檢測(cè)

將收獲并儲(chǔ)存在－80℃冷凍的樣品，用去離子水洗凈.置于烘箱(70℃)中烘至恒重.烘干的樣品稱量干重后，置于50 mL尖底塑料離心管中，每個(gè)離心管中加入2 mL硝酸(優(yōu)級(jí)純)，放置過夜;用已報(bào)道的微波輔助消解法進(jìn)行消解［5］.消解后的樣品用雙蒸蒸餾水稀釋至50 mL，混勻待測(cè).

擬南芥中砷總量采用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)(7500cs型，安捷倫科技有限公司)進(jìn)行檢測(cè)［5］，銦(In)(m/z 114)作為內(nèi)標(biāo)，檢測(cè)儀器運(yùn)行中的穩(wěn)定性.為了確認(rèn)是否存在生成的Ar40Cl35干擾物，同時(shí)檢測(cè)m/z 77、78、82.在所有檢測(cè)過程中，未發(fā)現(xiàn)存在Cl離子干擾現(xiàn)象.

1.3 擬南芥中水楊酸的檢測(cè)

將0.5 g新鮮擬南芥樣品，在研缽中加液氮并研磨成勻漿，用移液器移入1.5 mL離心管中，之后用1 mL甲醇充分洗滌研缽并轉(zhuǎn)移至同一離心管中，漩渦混合器振蕩，充分混勻.將該勻漿在4℃下離心(10000 g)15 min，取上清液置于2 mL離心管中，氮吹儀吹干.加入5%的三氯乙酸(0.25 mL)進(jìn)行充分溶解.加入乙酸乙酯與環(huán)己烷的混合液(1∶1，V/V)萃取2次，每次加入0.8 mL，將2次萃取的上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移至同一離心管中，氮?dú)獯蹈?，加?.6 mL的液相流動(dòng)相進(jìn)行溶解.過0.45 μm濾膜，置于4℃保存，待測(cè).

下層水相中加入8 mol·L－1鹽酸(0.3 mL)，搖勻，80℃恒溫水浴1 h，使結(jié)合態(tài)水楊酸轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)水楊酸.加入相同的萃取劑(乙酸乙酯與環(huán)己烷的混合液)萃取，氮吹吹干，取0.6 mL液相流動(dòng)相進(jìn)行溶解.用0.45 μm膜過濾，置于4℃保存，待測(cè).

采用高效液相色譜法(HPLC)(Waters 1525)檢測(cè)水楊酸含量［12］.色譜柱采用Agilent Zorbax SB-C18(250 mm ×4.6 mm，3.5 μm);流動(dòng)相為 A:90% 的乙酸鈉(0.2 mol·L－1，pH 5.5)，B:HPLC 級(jí)甲醇(10%)，熒光檢測(cè)器的激發(fā)波長(zhǎng)294 nm，發(fā)射波長(zhǎng)426 nm，流速為0.5 mL·min－1，進(jìn)樣體積為10 mL.

1.4 擬南芥中H2O2的檢測(cè)

根據(jù)已報(bào)道的方法［13］，稱取新鮮擬南芥地上部1.5 g，置于研缽中，加入10 mL預(yù)冷的丙酮溶液，研磨成勻漿，于10000 g下離心10 min.取1 mL上清液轉(zhuǎn)入干凈的離心管，分別加入5%Ti(SO4)2(0.1 mL)和濃氨水(0.2 mL).待沉淀形成后，于10000 g 下離心10 min.棄去上清液，沉淀用 2 mol·L－1的H2SO4(5 mL)溶解，以2 mol·L－1硫酸為空白調(diào)零，用紫外可見分光光度計(jì)(T6新世紀(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，在415 nm處測(cè)定分光光度值.用同樣方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)H2O2標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算H2O2的含量.

2 結(jié)果與討論

在As(V)處理下(圖1)，兩種擬南芥WT、sid2地上部對(duì)砷的積累隨著暴露濃度的提高和暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸提高.其中野生型中砷的濃度明顯高于sid2中砷濃度.最大砷積累濃度為野生型暴露在300 mmol·L－1砷中6 d，地上部砷含量達(dá)到53.4 mg·kg－1;而相同條件下 sid2中砷濃度同樣達(dá)到最大23.4 mg·kg－1，僅為野生型中砷濃度的44%.在相同條件下，野生型中砷的濃度均明顯高于相應(yīng)的sid2中砷的濃度，說明擬南芥對(duì)砷的吸收和積累與水楊酸的產(chǎn)生相關(guān).

圖1 不同砷暴露濃度及暴露時(shí)間下兩種擬南芥地上部對(duì)砷的積累培養(yǎng)基中砷濃度分別為 0、75、150、300 mmol·L －1;暴露時(shí)間為 2、4、6 dFig.1 Arsenic accumulation in two types of Arabidopsis shoots with different As exposure concentrations and different exposure time

在暴露時(shí)間相同的情況下，擬南芥地上部的砷濃度和砷暴露濃度呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系(圖1)，如在暴露6 d的情況下，在砷暴露濃度范圍內(nèi)(0—300 mmol·L－1)，野生型擬南芥體內(nèi)積累濃度相關(guān)性很高R2=0.98;而 sid2中砷積累同樣線性相關(guān)(R2=0.92).因?yàn)樵?00 mmol·L－1砷濃度時(shí)，植物出現(xiàn)中毒癥狀，鮮重降低，說明生長(zhǎng)受到了抑制(數(shù)據(jù)未顯示)，所以試驗(yàn)沒有研究更高濃度砷對(duì)擬南芥的影響.在同一砷暴露濃度下，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)(2—6 d)，擬南芥地上部中砷的濃度也隨之增加.

由于工農(nóng)業(yè)發(fā)展，重金屬的廣泛使用，重(類)金屬會(huì)在植物體內(nèi)積累，對(duì)植物造成傷害.重金屬脅迫已經(jīng)成為植物主要的非生物脅迫［14］.砷不是植物必須元素，高濃度的砷在植物體內(nèi)積累，是一種環(huán)境脅迫.在這種環(huán)境脅迫下，作為一種防衛(wèi)反應(yīng)，植物會(huì)合成較多的水楊酸［15］，也會(huì)產(chǎn)生大量的H2O2［7，16］.在本研究中也觀察到類似的現(xiàn)象(表1).在野生型擬南芥中，2 d的砷暴露隨砷暴露濃度的提高，H2O2含量19.41—25.22 mg·L－1，無顯著差異(p ＞0.05)，而砷暴露 4 d 和 6 d 都出現(xiàn)H2O2降低.Demirevska-Kepova等［17］觀察到大麥在Mn暴露5 d后，體內(nèi)H2O2增加，而Cu沒有引起H2O2的提高.在sid2中，體內(nèi)H2O2沒有明顯的規(guī)律性，但總體含量高于野生型擬南芥.目前，重金屬誘導(dǎo)的植物體內(nèi)H2O2積累的機(jī)制仍不清楚，可能與體內(nèi)茉莉酮酸酯的活性有關(guān)［16］.

表1 在不同砷暴露濃度和不同暴露時(shí)間下擬南芥地上部H2O2濃度(mg·L－1)Table 1 H2O2concentration in the shoots of Arabidopsis with different As exposure concentrations and different time intervals

重金屬脅迫造成植物的另一種反應(yīng)是導(dǎo)致水楊酸(SA)的積累.sid2作為水楊酸合成突變體，即水楊酸合成功能缺失，即使在砷脅迫下，其體內(nèi)水楊酸的積累也很少，在所有砷暴露情況下，sid2地上部體內(nèi)水楊酸含量都 ＜0.5 mg·kg－1(圖2).而野生型(WT)，體內(nèi)水楊酸積累皆 ＞0.5 mg·kg－1(圖2)，與Krantev等人得到的結(jié)果一致［18］.

圖2 在不同濃度As(V)和不同暴露時(shí)間下擬南芥地上部水楊酸的積累營(yíng)養(yǎng)液中 As(V)濃度為 0、75、150、300 mmol·L －1;在砷暴露第 2、4、6 天采樣Fig.2 Accumulation of SA in the shoot of Arabidopsis with the addition of 0，75，150 and 300 mmol·L －1As(V)in the culture medium

擬南芥地上部水楊酸和H2O2的濃度單獨(dú)看來沒有相關(guān)性(圖2)，但SA/H2O2比值與砷暴露濃度存在一定的線性關(guān)系(圖3)，野生型擬南芥SA/H2O2在54.9—257.7范圍內(nèi).在相同的砷暴露時(shí)間內(nèi)，隨著砷暴露濃度的增加而增加，并呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系，第2、4、6天的 R2分別為0.80、0.96、0.84(p值皆＜0.001).而水楊酸突變體sid2中，其SA/H2O2比值沒有明顯變化，在6.6—24.4范圍內(nèi)，這可能是由于該擬南芥產(chǎn)生的水楊酸含量低所致.

圖3 擬南芥地上部SA/H2O2比值及與營(yíng)養(yǎng)液中砷濃度的相關(guān)性Fig.3 SA/H2O2ratio and their correlation in shoots of Arabidopsis(WT and sid2)with the addition of As(V)at 0，75，150，300 mmol·L －1in the medium

越來越多的證據(jù)表明，水楊酸與活性氧(ROS)相互作用，控制植物防衛(wèi)反應(yīng)基因的表達(dá)［19］，而H2O2是反應(yīng)活性氧的一個(gè)重要組成.據(jù)報(bào)道，防衛(wèi)反應(yīng)中水楊酸和ROS形成了正向反饋環(huán)［20］，因?yàn)橐环矫鍴2O2能夠通過基丙酸類合成路徑刺激水楊酸合成［21］.另一方面，高含量水楊酸不僅通過多種途徑產(chǎn)生ROS，而且抑制抗氧化系統(tǒng)酶如過氧化氫酶(CAT)的活性，導(dǎo)致ROS的積累［22］.砷脅迫下，野生型擬南芥體內(nèi)水楊酸和H2O2濃度都增加，可能是這種相互作用的結(jié)果，造成其比值隨著砷脅迫的提高而呈線性關(guān)系，同時(shí)導(dǎo)致了體內(nèi)砷積累.而水楊酸合成功突變體sid2，因其水楊酸合成功能的缺失，只有H2O2濃度調(diào)節(jié)防衛(wèi)反應(yīng)，是該擬南芥體內(nèi)砷積累低于野生型的主要原因.

3 結(jié)論

擬南芥野生型在As(V)脅迫下，地上部體內(nèi)砷積累隨砷暴露濃度的增加而增加，并呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系;同時(shí)其體內(nèi)SA/H2O2比值同樣隨砷暴露濃度的增加而增加并有良好的線性關(guān)系.可能是水楊酸和H2O2相互作用，調(diào)控?cái)M南芥體內(nèi)防衛(wèi)反應(yīng)，造成擬南芥體內(nèi)砷積累.而水楊酸合成突變體sid2中砷濃度明顯低于野生型，可能是因?yàn)槿笔畻钏岫挥蠬2O2調(diào)控防衛(wèi)基因，無法和水楊酸形成相互作用，因此體內(nèi)積累的砷少于野生型.

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