徐亞英，王 勇，羅 宏，陳 典

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030）

基因定位突變是指將某一克隆基因按預(yù)先設(shè)計好的目標進行定點改造，它僅適用于基因序列已知，蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系比較明確的基因[1]。由于它具有簡單易行、重復(fù)性高等優(yōu)點，現(xiàn)已發(fā)展成為基因操作的一種基本技術(shù)[2]。常見體外定點突變的方法有化學(xué)誘變、寡核苷酸介導(dǎo)的誘變、盒式誘變和基于PCR方法的誘變等[3]，其中基于PCR方法的誘變以其簡單、快速的優(yōu)勢逐漸成為DNA體外修飾產(chǎn)生新型蛋白質(zhì)的最常用方法[4]。

Cre重組酶來源于P1噬菌體[5]，它不僅具有催化活性，而且同限制酶相似，可以識別特異的DNA序列并進行特定的剪切和拼接[6-7]。當其作用序列位點—兩個34bp的loxP位點存在時，它可根據(jù)loxP位點的方向不同發(fā)生倒位、移位和刪除反應(yīng)[8-9]。Cre/1oxP已廣泛應(yīng)用于內(nèi)、外源基因失活或敲除、基因激活等反應(yīng)[10-11]。目前，Cre/1oxP定位重組系統(tǒng)在應(yīng)用中存在兩個主要問題:Cre重組酶的刪除效率較低，其刪除效率僅為50%左右[12]；此前，在我們實驗室的研究工作中發(fā)現(xiàn)，當Cre重組酶與loxP位點共存于一個寄主細胞中時，常由于Cre重組酶的痕量表達而引起loxP位點間序列的非目的性刪除。針對以上缺陷，本試驗設(shè)計了3條引物，利用PCR方法向cre基因內(nèi)部引入一段具有增強基因在真核生物中表達效率的內(nèi)含子序列（pfu1305.1）[13]，以改變其在原核細胞中的通讀序列，完成cre基因的改造，進而達到提高Cre/1oxP定位重組系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因真核生物中的刪除效率的目的同時，也避免了cre基因的滲露表達。為了使cre基因的突變達到最佳效果，本試驗設(shè)計了三種PCR策略，并對每種策略進行了體系優(yōu)化，以確定基因改造的最佳方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒

pMM23、pCAMBIA1305.1均為本實驗室保存，其中pMM23含有Cre序列（1029bp），pCAMBIA1305.1含有需插入到Cre中的內(nèi)含子序列（AF354045.1，190bp）。

1.1.2 試劑

Pfu DNA聚合酶（附帶Buffer及Mg2+）、dNTPs（購自上海生工）；DNAmarker（DL2000，購自寶泰克）。

1.1.3 PCR引物序列

依據(jù)Cre（X03453.1）和intron（AF354045.1）的序列，設(shè)計了如下三條引物用于cre基因的改造，所有引物均由上海生工合成（見表1）。配成100 mmol·L-1的儲存液并稀釋成10 mmol·L-1備用。

1.2 方法

利用三種PCR策略對cre基因進行突變的反應(yīng)體系、條件及檢測。

1.2.1 一步PCR策略

將三條引物08crein1、crein2、cre3與兩個模板pCAMBIA1305.1、pMM23加入同一反應(yīng)體系中，20μL擴增體系中包括:10×PCR buffer 2.0μL；dNTPs（10 mmol·L-1）0.4μL；08crein1（10 mmol·L-1），cre3（10 mmol·L-1） 各 1μL； pMM23（20 ng·μL-1）0.6μL；然后分別對Mg2+、中間引物crein2、內(nèi)含子擴增模板pCAMBIA1305.1、Pfu進行了不同濃度的單因素體系優(yōu)化試驗；Mg2+（25 mmol·L-1）濃度設(shè)置為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0μL；crein2（1 mmol·L-1），0.1、0.2、0.5、0.8、1μL；pCAMBIA1305.1 （20 ng·μL-1），0.06、0.12、0.5μL；Pfu（2.5 U·μL-1），0.2、0.4、0.6μL；加ddH2O補足20μL。當就某一成分進行體系優(yōu)化時，其他成分取中間值。擴增條件:94℃，7 min；30個循環(huán)（94℃，30 s；52℃，40 s；72℃，2 min 30 s）；72℃，7 min。

擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳緩沖液為1×TAE，保持100 V恒壓（4～5 V·cm-1），電泳30 min，紫外燈下檢測擴增結(jié)果。

表1 cre基因改造的引物Table1 Primers of cre gene transformation

1.2.2 二步PCR策略

利用PCR方法分兩步對cre基因進行突變。

①Intron的擴增

20μL擴增體系中包括:10×PCR buffer，2.0μL； MgCl2（25 mmol·L-1），2.0μL； dNTPs（10 mmol·L-1），0.2μL； 08crein1（10 mmol·L-1）、crein2（10 mmol·L-1）各 1μL； pCAMBIA1305.1（100 ng·μL-1），0.2μL；Pfu（2.5 U·μL-1），0.2μL；加ddH2O補足20μL。

擴增條件:94℃，7 min；30個循環(huán)（94℃，30 s；56℃，30 s；72℃，30 s）；72℃，7 min。

電泳分析操作同上，擴增得到的目的片段約為220bp（內(nèi)含子加兩端引物的長度），命名為Pfu1305.1，此步PCR產(chǎn)物作為下一步反應(yīng)引物。

②crein的擴增:以pMM23為模板，以Pfu 1305.1、08crein1、cre3為引物進行擴增反應(yīng)。

20μL 擴增體系中包括:10×PCR buffer 2.0μL； dNTPs（10 mmol·L-1）0.2μL； 08crein1（10 mmol·L-1）；cre3（10 mmol·L-1）各 1μL；pMM23（20 ng·μL-1）0.2μL；Pfu（2.5 U·μL-1）0.2μL；然后分別對Mg2+、單引物Pfu1305.1進行了不同濃度的單因素體系優(yōu)化試驗；Mg2+（25 mmol·L-1）濃度設(shè)置為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5μL；Pfu1305.1（20 ng·μL-1），0.2、0.5、0.8μL；加ddH2O補足20μL。當就某一成分進行體系優(yōu)化時，其他成分取中間值。

擴增條件:94℃，7 min；30個循環(huán)（94℃，30 s；52℃，40 s；72℃，2 min 30 s）；72℃，7 min。電泳分析操作同上。

1.2.3 三步PCR策略:

①同1.2.2中的①；

②以pMM23為模板，以Pfu1305.1為引物對cre基因進行單引物擴增；

20μL 擴增體系中包括:10×PCR buffer，2.0μL； MgCl2（25 mmol·L-1），2.0μL； dNTPs（10 mmol·L-1），0.2μL； Pfu1305.1（20 ng·μL-1），0.5μL；pMM23（20 ng·μL-1），0.2μL；Pfu（2.5 U·μL-1)，0.2μL；加ddH2O補足20μL。

擴增條件如下:94℃，7 min；5 or 10 or 15 or 20（94℃，30 s；52℃，40 s；72℃，2 min 30 s）

③取1μL上述擴增產(chǎn)物（crein基因）為模板，以08crein1、cre3為引物對插入內(nèi)含子序列的cre基因進行PCR擴增。

20μL 擴增體系成分如下:10×PCR buffer，2.0μL；MgCl2（25 mmol·L-1），2.0μL；dNTPs（10 mmol·L-1），0.2μL；08crein1（10 mmol·L-1）、cre3（10 mmol·L-1）各1μL；crein，0.2μL； Pfu（2.5 U·μL-1），0.2μL；加ddH2O補足。

擴增條件:94℃，7 min；30個循環(huán)（94℃，20 s；56℃，30 s；72℃，1 min）；72℃，7 min。電泳分析操作同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 一步PCR策略

將三條引物08crein1、crein2、cre3與兩個模板pCAMBIA1305.1、pMM23加入同一反應(yīng)體系中進行基因擴增，結(jié)果見圖1。

圖1 一步PCR策略基因擴增結(jié)果Fig.1 Amplification result of the gene by one-step PCR

不同模板比例、不同酶加入量、不同中間引物濃度、不同Mg2+濃度下的部分擴增結(jié)果見圖1。如前文所述，改造后的crein基因大小應(yīng)為1200bp左右，但圖中顯示，對不同因素進行優(yōu)化，在1200bp處都無可見條帶，而在270bp處有較暗雜帶產(chǎn)生，說明利用三引物兩模板的一步PCR策略，即便是對PCR反應(yīng)體系進行優(yōu)化，也難以擴增出目的條帶。

2.2 兩步PCR策略

2.2.1 內(nèi)含子的擴增

以pCAMBIA1305.1為模板、08crein1和crein2為引物進行內(nèi)含子的擴增結(jié)果如圖2所示，在220bp處有較亮的目的條帶，且不存在非特異擴增。此步特異擴增效率高，故不必對體系進行優(yōu)化。

2.2.2 crein的擴增

此步反應(yīng)是以pMM23為模板，以Pfu1305.1、08crein1、cre3為引物進行目的條帶的擴增。如圖3所示，不同的Mg2+加入量和不同的Pfu1305.1濃度條件下均在1200bp處擴增出了較亮的目的條帶，也均在約270與2500bp處有較暗的雜帶產(chǎn)生，且不同體系條件下擴增結(jié)果基本一致。結(jié)果表明，應(yīng)用兩步PCR策略可以完成基因的改造，但存在非特異擴增（此步2500bp處的非特異條帶不明顯）。

圖2 Intron的擴增結(jié)果Fig.2 Amplification results of the intron

圖3 不同條件下crein基因的擴增結(jié)果Fig.3 Amplification results of crein gene under different conditions

2.3 三步PCR策略

2.3.1 內(nèi)含子的擴增

結(jié)果同2.2.1。

2.3.2 單引物擴增

此步驟是以pMM23為模板，以Pfu1305.1為引物對cre基因進行單引物擴增，以增大crein基因數(shù)量，并將其作為下步PCR反應(yīng)的模板。在試驗中，對PCR擴增的循環(huán)數(shù)進行了梯度設(shè)置，即分別為5、10、15、20個循環(huán)。設(shè)置循環(huán)的目的在于探討單引物擴增循環(huán)數(shù)的不同是否會對下步crein基因序列的擴增產(chǎn)生影響。由于此步為單引物循環(huán)，循環(huán)數(shù)又較少，故凝膠電泳未顯示出目的條帶，如圖4所示。

圖4 crein基因的單引物擴增Fig.4 Amplification results of crein gene using a single primer

2.3.3 crein基因的擴增

結(jié)果見圖5。

圖5 crein基因的三步擴增結(jié)果Fig.5 Amplification results of crein gene using three-step PCR

分別各取上述不同循環(huán)的PCR產(chǎn)物1μL為模板，以08crein1、cre3為引物進行PCR擴增。結(jié)果如圖5所示，當分別采用5、10、15、20個循環(huán)數(shù)進行模板擴增后，在酶用量分別為0.2和0.4μL條件下，都擴增出了明亮而特異的1200bp左右的目的條帶。說明，單引物擴增后產(chǎn)生的微量產(chǎn)物可以作為本步擴增的模板，擴增結(jié)果并不因循環(huán)數(shù)的不同而產(chǎn)生明顯差異。當DNA聚合酶的用量分別為0.2、0.4μL時，擴增條帶的亮度也沒有明顯差異。為了減少前一步PCR過程對此步驟的影響，前一步單引物擴增循環(huán)數(shù)可取最小值，即5。

3 討論

3.1 不同PCR策略的優(yōu)劣分析

基因突變技術(shù)是蛋白質(zhì)工程中應(yīng)用的重要技術(shù)之一，包括單個堿基或整段序列的替換、基因片段的插入與刪除等類型，可以有目的改變DNA序列中的堿基，使之滿足不同的研究和應(yīng)用需求[14]。近幾年來,以PCR為基礎(chǔ)的定點誘變方法得到不斷的創(chuàng)新和改進，使得定點誘變越來越省時省力，簡單易行，倍受研究者青睞[15]。而在本試驗中，針對三種PCR策略進行比較分析，以確定基因改造的最佳方法，其優(yōu)劣分析如下:

一步PCR策略的優(yōu)點是整個基因改造過程只需一步即可完成，方便快捷，但在其反應(yīng)體系中成分復(fù)雜，共有兩個模板與三個引物，幾個PCR反應(yīng)同時進行，且相互間互相干擾，雖然我們就反應(yīng)各組成體系及反應(yīng)條件都進行了摸索與優(yōu)化，但都沒有得到理想結(jié)果。因此，一步PCR策略對反應(yīng)條件和體系的要求較為苛刻，目的基因的擴增具有一定的難度；相對于一步PCR策略，二步PCR策略是先獨立擴增出了用于基因突變的引物，然后再將其加入體系中，進行改造后基因的擴增。此種策略減少了一定量的基因擴增的干擾因素，但把單引物擴增和雙引物擴增放在一個體系中進行，反應(yīng)過程仍存在其他的干擾，因此，雖能擴增出較清晰的目的條帶，但存在著較多的非目的條帶擴增；而三步PCR策略分解了整個基因改造的全過程，相當于把每一步反應(yīng)都獨立出來，即將體系間的相互干擾降到最小。雖然其擴增步驟為三步，相對較為繁瑣，但由于每一步反應(yīng)都是比較簡單，基本上不必進行任何體系的摸索與優(yōu)化，就可以直接獲得特異、明晰的目的條帶，且反應(yīng)條件較為寬泛，易于進行目的基因的擴增。因此，可認為三步PCR策略是三種基因改造策略中最實用的策略。其基因改造的路線如圖6所示。

圖6 利用三步PCR策略進行基因改造的路線Fig.6 Schematic diagram of three-step PCR approach for improving crein gene

3.2 三步PCR策略的引申

本試驗針對在基因5′端插入序列的情況進行了探討。當擬在基因中間部位插入序列時，可利用4個引物5步PCR的方法進行。第一步，雙引物擴增得到基因前半段；第二步，單引物擴增獲得含有插入序列的前半段基因；第三步，雙引物擴增以產(chǎn)生基因后半段的部分堿基；第四步，單引物擴增得到目的基因；第五步，雙引物擴增進行目的基因的累積。

4 結(jié)論

本研究以PCR方法在基因起始部位附近進行基因的突變或改造，最佳方法為三步PCR策略:首先是引物1與引物2引導(dǎo)的插入序列的擴增；其次是以擴增后所得序列為單引物進行的擴增，此步驟所得的產(chǎn)物可作為下步反應(yīng)的模板；最后是以第二次PCR產(chǎn)物作為模板，以引物1和引物3所進行的改造后基因的指數(shù)擴增。

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