殷秀杰，胡寶忠，崔國文，李鳳蘭，李景欣，王明君，洪銳民

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 哈爾濱 150030）

白三葉（Trifolium repens L.）是豆科三葉草屬多年生牧草，是世界上非常著名的優(yōu)良栽培牧草，同時(shí)作為溫帶地區(qū)混播人工草地和觀賞性草坪建植的主要草種，將會(huì)隨著我國畜牧業(yè)和城鎮(zhèn)綠化的迅速發(fā)展而發(fā)揮越來越重要的作用，國內(nèi)白三葉的研究應(yīng)注重其耐鹽堿性及持久性等方面的改良，提高其生態(tài)適應(yīng)性，以利其在北方地區(qū)的推廣和生產(chǎn)，尤其是在鹽堿地難綠化的情況下，意義更為突出。

國內(nèi)外關(guān)于逆境脅迫對(duì)植物細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化的研究亦有報(bào)道，大量研究發(fā)現(xiàn)逆境脅迫對(duì)植物細(xì)胞的膜脂過氧化有促進(jìn)作用，主要表現(xiàn)在電解質(zhì)滲漏率增大，葉綠體、線粒體等細(xì)胞器的超微結(jié)構(gòu)破壞和葉綠素降解等[1-8]。目前，白三葉對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)能力的研究還比較少，尤其是鹽脅迫對(duì)白三葉超微結(jié)構(gòu)的影響未見報(bào)道。本研究觀察了鹽堿脅迫下白三葉葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，為其在鹽脅迫下出現(xiàn)的生理變化和耐鹽性提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)

用長20 cm寬13 cm的塑料盆裝2/3體積的珍珠巖，加500mL的Hoagland培養(yǎng)液至其表面濕潤，將白三葉種子均勻地播撒其上，于室內(nèi)培養(yǎng)。待幼苗長至3葉期時(shí)，模擬黑龍江省大慶地區(qū)鹽堿土的成分及鹽量，配制相應(yīng)鹽溶液，進(jìn)行梯度鹽脅迫處理如表1所示，未脅迫組為對(duì)照組，處理時(shí)用漏斗將溶液加至塑料盆底部，處理5 d后取幼苗倒數(shù)第2葉片中部進(jìn)行透射電鏡樣品制備。

1.2 透射電鏡樣品制備與觀察

取下的樣品迅速放到2.5%戊二醛中進(jìn)行前固定，真空泵抽氣使材料下沉，并置于4℃冰箱中保存固定2 d。用pH 7.2磷酸緩沖液沖洗3次，每次10 min，再用2%四氧化鋨固定1.5 h，用pH 7.2磷酸緩沖液再?zèng)_洗3次，每次10 min。分別用濃度為50%、70%、80%、90%、100%的乙酯進(jìn)行脫水，每次10～15 min，100%的3次，其他濃度各1次。然后用100%乙醇∶丙酮=1∶1、純丙酮各置換1次，每次10 min。用純丙酮∶環(huán)氧樹脂812包埋劑按1∶1、1∶2、1∶3各1 h、2 h、2～3 d浸透，浸透后將樣品置于恒溫培養(yǎng)箱中，40℃17 h、45℃24 h、60℃24 h聚合，用ULTRACUTE型超薄切片機(jī)進(jìn)行切片,用醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛在25℃下分別對(duì)樣品染色15～20 min，用雙重蒸餾水沖洗干凈后放入培養(yǎng)皿中待檢。在JSM25610LV透射電鏡下觀察拍照。

表1 試驗(yàn)含鹽量及鹽成分Table1 Salinity and salt composition of experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)照組白三葉葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

對(duì)照組白三葉的葉肉細(xì)胞排列疏松，各種細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整，清晰可見。中央液泡膜完整，液泡充盈呈膨脹狀態(tài)，與周圍的細(xì)胞質(zhì)緊密相貼。細(xì)胞核明顯可見，細(xì)胞核核膜清晰，內(nèi)部的染色質(zhì)均勻分布。線粒體呈比較規(guī)則的球形或橢球形，在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中少量分布，雙層被膜結(jié)構(gòu)完整，嵴清晰可見，呈隨機(jī)排列（見圖版Ⅰ-1）。葉綠體緊貼細(xì)胞壁，葉綠體內(nèi)部片層清晰，排列有序，葉綠體外形為長橢圓形，并且具有少量的高電子密度的小球形脂質(zhì)球，含少量的淀粉粒，葉綠體被膜和類囊體結(jié)構(gòu)清楚（見圖版Ⅰ-2、3）。

2.2 鹽脅迫對(duì)白三葉葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

輕度鹽脅迫下，葉綠體結(jié)構(gòu)正常，基本不受影響，表現(xiàn)了白三葉對(duì)鹽脅迫有一定的耐性（見圖版Ⅰ-4）。隨著鹽脅迫強(qiáng)度的提高，葉綠體結(jié)構(gòu)受到不同程度的影響（見圖版Ⅰ-5～7）。中度鹽脅迫下，葉綠體基粒類囊體膨脹，間質(zhì)片層空間增大（見圖版Ⅰ-5）?；Ｅ帕形蓙y，隨機(jī)分布于葉綠體中，此時(shí)部分葉綠體形狀開始發(fā)生變化，由原來的長橢圓形變成球形，葉綠體中出現(xiàn)了大量的淀粉粒（見圖版Ⅰ-6、9）。表明中度和重度鹽脅迫對(duì)葉肉細(xì)胞中葉綠體結(jié)構(gòu)的破壞較大，葉綠體結(jié)構(gòu)的破壞與鹽脅迫下葉肉細(xì)胞最終死亡密切相關(guān)。高度鹽脅迫下，細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生許多膜狀結(jié)構(gòu)，觀察到有些葉肉細(xì)胞被泡狀結(jié)構(gòu)所充滿，看不到線粒體等細(xì)胞器（見圖版Ⅰ-7），表明液泡和內(nèi)膜系統(tǒng)在葉肉細(xì)胞器降解過程中起了重要作用。

2.3 鹽脅迫對(duì)白三葉葉片基粒片層超微結(jié)構(gòu)的影響

對(duì)照組白三葉基粒片層排列有序、緊密，基粒片層與葉綠體的長軸方向平行排列，基粒片層比較厚（見圖版Ⅰ-8），表明植物進(jìn)行光合作用的能力強(qiáng)。鹽脅迫下白三葉葉片葉綠體內(nèi)部的基粒片層膨脹溶解，排列疏松，部分模糊不清，基粒片層層數(shù)減少（見圖版Ⅰ-9、10）；細(xì)胞內(nèi)部分片層排列疏松，部分片層排列模糊不清，基粒片層膨脹溶解，外部被膜部分?jǐn)嗔?，一些片層?nèi)部膨脹（見圖版Ⅰ-10），表明葉片細(xì)胞已受到嚴(yán)重?fù)p傷，光合作用受阻。

2.4 鹽脅迫對(duì)白三葉葉片線粒體結(jié)構(gòu)的影響

輕度鹽脅迫對(duì)線粒體的影響較?。ㄒ妶D版Ⅰ-12、13），線粒體具有清晰的被膜和管狀的脊，隨著鹽脅迫的加強(qiáng)，部分線粒體開始發(fā)生變化，主要表現(xiàn)為線粒體嵴消失，線粒體腫脹，同時(shí)出現(xiàn)了葉綠體和線粒體彼此嵌合的現(xiàn)象。高度鹽土培育下，線粒體被膜結(jié)構(gòu)所包圍，最終降解消失（見圖版Ⅰ-14）。

圖版Ⅰ 白三葉葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)PlateⅠ Ultrastructure of mesophyll cells in white clover

3 討論

葉肉細(xì)胞中葉綠體是感受鹽脅迫最敏感的細(xì)胞器，據(jù)報(bào)道，其結(jié)構(gòu)的變化隨鹽濃度的不同而不同[1]，低鹽濃度下，葉綠體的變化不明顯，隨著鹽濃度的升高，葉綠體結(jié)構(gòu)開始出現(xiàn)不同程度的破壞。目前關(guān)于鹽脅迫對(duì)葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響，已經(jīng)在枸杞[2]、小麥[3]、葡萄[4]、蘆薈[5]、雜交酸模[6]、水稻[7]、蘆葦[9]、星星草[10]、馬鈴薯[11]等植物上進(jìn)行了相關(guān)研究，研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫導(dǎo)致類囊體排列紊亂、膨大，基粒排列方向改變，基粒和基質(zhì)片層界限模糊不清，被膜破損或消失，甚至解體等。輕度鹽脅迫下，白三葉葉綠體能維持其結(jié)構(gòu)和膜的完整性；而重度鹽堿脅迫后，葉綠體膜溶解，與韋存虛等在星星草中的研究得到的結(jié)論基本相似[10]。重度鹽脅迫下白三葉草葉綠體及類囊體，基粒片層和基質(zhì)片層明顯變形。

重度鹽脅迫下白三葉葉肉細(xì)胞葉綠體中出現(xiàn)較大顆粒的淀粉粒，與侯江濤對(duì)扁桃砧木[12]、劉吉祥對(duì)蘆葦[9]和朱宇旌等對(duì)小花堿茅[13]研究發(fā)現(xiàn)的結(jié)果一致。淀粉粒的積累是由于鹽脅迫導(dǎo)致細(xì)胞代謝水平降低，生理活性降低，同化物的運(yùn)輸系統(tǒng)遭到破壞造成[14-16]。淀粉是細(xì)胞的重要能源之一，生長在鹽生環(huán)境中的植物，由于受到了鹽分的影響，各細(xì)胞器在鹽分的影響下可能難以充分發(fā)揮各自的功能，會(huì)使植物生長受阻，光合產(chǎn)物以淀粉形式累積下來，提供能量，保證植物很好生長，這也許是適應(yīng)生境的表現(xiàn)，可能是一種抗鹽形式，也可能與高濃度鹽堿阻礙了淀粉的水解和向外運(yùn)輸有關(guān)[17]。

4 結(jié)論

白三葉葉肉細(xì)胞的細(xì)胞器對(duì)鹽脅迫的敏感性和耐受性是不同的。所有細(xì)胞器都能耐受輕度鹽脅迫，但對(duì)中度和重度鹽脅迫，卻表現(xiàn)出不同程度的傷害，重度鹽脅迫下白三葉草細(xì)胞膜系統(tǒng)、葉綠體、線粒體、細(xì)胞核等結(jié)構(gòu)上都有著明顯變形。鹽脅迫下白三葉葉綠體結(jié)構(gòu)的破壞與葉肉細(xì)胞最終死亡密切相關(guān)。

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