張鶴山， 王志勇， 張志飛， 田 宏， 熊軍波， 陸嬌云， 劉 洋

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所， 武漢 430064； 2.信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院， 河南 信陽(yáng) 464006；3. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)， 長(zhǎng)沙 410128)

銅(Cu)是動(dòng)植物生長(zhǎng)發(fā)育的必要微量元素，但是在土壤環(huán)境中的過量積累能夠造成土壤重金屬污染。隨著飼料工業(yè)中高銅制劑的加入，含銅農(nóng)藥、化肥如三氯酚銅、銅鋅合劑、硫酸銅等的使用，工業(yè)廢水、銅礦廢棄場(chǎng)的Cu2+經(jīng)水體在土壤中積累，造成土壤銅含量超標(biāo)。據(jù)報(bào)道，湖北大冶市銅綠山礦區(qū)附近土壤銅含量超過5 000 mg·kg-1，浙江哩鋪銅礦區(qū)土壤中銅含量超過7 000 mg·kg-1[1]。在國(guó)外，許多果園土壤中的銅含量也高于背景值很多倍，如巴西的某可可種植園表層土壤銅含量接近1 000 mg·kg-1，高于對(duì)照50多倍；法國(guó)有些葡萄園中的全銅含量達(dá)到1 280 mg·kg-1[2]。因此，如何修復(fù)銅污染土壤是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。

目前銅污染土壤的修復(fù)措施包括電動(dòng)修復(fù)、固化/穩(wěn)定修復(fù)、動(dòng)物修復(fù)、植物修復(fù)、微生物修復(fù)和農(nóng)業(yè)生態(tài)修復(fù)等措施，而植物修復(fù)技術(shù)因其利用植物及其根際微生物對(duì)土壤污染物吸收、提取、分解、轉(zhuǎn)化和固定，被學(xué)術(shù)界稱為“綠色修復(fù)”，近年來(lái)備受關(guān)注。一些耐銅性或能夠富集Cu2+的植物如海洲香薷(Elsholtziaharchowensis)[3]、蕨類植物[4]、鴨跖草(Commelinacommunis)、星香草(Haumaniastrumrobertii)已經(jīng)在土壤銅污染修復(fù)中得到應(yīng)用；牧草類物種如多花黑麥草(Loliummultiflorum)、葦狀羊茅(Festucaarundinacea)、高丹草(Sorghum.bicolor×Sorghum.sudanense)、雜交狼尾草(Pennisetumamericanum×P.Purpureum)、紫花苜蓿(Medicagosativa)等草種也成功用于土壤重金屬污染的修復(fù)[5-8]。白三葉(Trifoliumrepens)作為一種優(yōu)良的豆科牧草，繁殖力強(qiáng)，生物量大，并能在貧瘠的土壤中生長(zhǎng)，管理成本低；此外白三葉還是常見的草坪草或邊坡綠化草種，在修復(fù)污染土壤的同時(shí)還可以起到美化環(huán)境的作用。因此，在生產(chǎn)中已經(jīng)利用白三葉進(jìn)行銅尾礦區(qū)或養(yǎng)殖場(chǎng)周邊土壤重金屬污染的修復(fù)[9-10]。

高Cu2+濃度脅迫影響植物細(xì)胞滲透壓，使細(xì)胞膜受到氧化損壞[11]。白三葉對(duì)土壤中Cu2+的耐受強(qiáng)度決定著修復(fù)措施的成敗。鑒于此，本研究以鄂牧1號(hào)白三葉為研究對(duì)象，研究不同Cu2+濃度脅迫對(duì)白三葉種子萌發(fā)和根系發(fā)育的影響，旨在探討白三葉對(duì)于Cu2+脅迫的臨界濃度，為在銅污染土壤上進(jìn)行白三葉生產(chǎn)及土壤修復(fù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)品種為鄂牧1號(hào)白三葉，由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所提供。供試試劑為分析純CuSO4·5 H2O。

1.2 試驗(yàn)方法

Cu2+濃度設(shè)0、5、10、50、100、200、400、800 mg·L-1共8個(gè)梯度，pH值5.5；對(duì)照為去離子水處理；每處理4次重復(fù)，每重復(fù)50粒種子。

選取健康飽滿的白三葉種子，用濃度0.1%高錳酸鉀溶液浸泡15 min，用蒸餾水沖洗干凈，然后用濾紙將種子表面水分吸干。采用濾紙發(fā)芽法于人工氣候箱中進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)(20 ℃，16 h，光照/20 ℃，8 h，黑暗)，每個(gè)發(fā)芽盒鋪設(shè)2層濾紙，均勻放置50粒種子，并加入25 mL處理溶液，對(duì)照組(ck)加25 mL去離子水。每隔24 h統(tǒng)計(jì)1次發(fā)芽的種子數(shù)，以胚根突破種皮并長(zhǎng)于種子長(zhǎng)度為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)。記錄10 d內(nèi)白三葉種子的發(fā)芽數(shù)，并在發(fā)芽結(jié)束后選取10顆幼苗進(jìn)行胚芽和胚根測(cè)定。

1.3 測(cè)定指標(biāo)

發(fā)芽勢(shì)(%)=(試驗(yàn)第4天正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽率(%)=(發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽指數(shù)=∑(Gt/Dt)，式中，Gt為處理t日的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)；

活力指數(shù)=發(fā)芽指數(shù)×根長(zhǎng)；

根長(zhǎng)度、根系體積、根系表面積、根系平均直徑等指標(biāo)利用植物根系分析儀進(jìn)行掃描分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素LSD法對(duì)不同處理?xiàng)l件下各指標(biāo)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cu2+對(duì)白三葉種子萌發(fā)的影響

不同Cu2+濃度脅迫下白三葉萌發(fā)特性見表1。隨著Cu2+脅迫濃度的增加，白三葉發(fā)芽率和相對(duì)發(fā)芽率表現(xiàn)出整體下降的趨勢(shì)，但在5 mg·L-1濃度處理下，其發(fā)芽率較對(duì)照增加3.3%，說(shuō)明低濃度的Cu2+脅迫可以促進(jìn)白三葉種子的萌發(fā)，這一現(xiàn)狀在多個(gè)植物種內(nèi)被發(fā)現(xiàn)[12-14]。在Cu2+脅迫濃度達(dá)到10 mg·L-1以后，發(fā)芽率開始降低，在100 mg·L-1濃度時(shí)顯著下降(p<0.05)；此后發(fā)芽率跳躍式下降，在Cu2+脅迫濃度達(dá)400 mg·L-1時(shí)，其發(fā)芽率僅為2.0%，相對(duì)發(fā)芽率也僅為2.2%。

表1 不同Cu2+濃度對(duì)白三葉種子萌發(fā)的影響

在不同Cu2+脅迫下，發(fā)芽指數(shù)表現(xiàn)出與發(fā)芽率一致的變化趨勢(shì)，在Cu2+濃度為100 mg·L-1時(shí)發(fā)芽指數(shù)顯著降低(p<0.05)，而Cu2+濃度在0～50 mg·L-1范圍內(nèi)時(shí)，發(fā)芽指數(shù)在各處理間差異不顯著，但此后每個(gè)Cu2+脅迫濃度間均差異顯著。發(fā)芽勢(shì)和活力指數(shù)在Cu2+脅迫濃度增加時(shí)具有基本一致的變化趨勢(shì)(表1)。Cu2+脅迫顯著影響了白三葉種子的發(fā)芽速度，在濃度為10 mg·L-1時(shí)發(fā)芽勢(shì)即顯著下降(p<0.05)，而活力指數(shù)在Cu2+脅迫濃度為50 mg·L-1時(shí)顯著降低。

2.2 Cu2+對(duì)白三葉根系的影響

根系是植物能夠正常生長(zhǎng)的關(guān)鍵部位，發(fā)育良好的根系可以提高植物的抗逆能力。本研究中，Cu2+脅迫顯著影響了白三葉根系的生長(zhǎng)(表2)。白三葉根長(zhǎng)隨Cu2+脅迫濃度增加而降低，在50 mg·L-1濃度時(shí)達(dá)到顯著差異(p<0.05)，并在50～400 mg·L-1范圍內(nèi)，各處理間根長(zhǎng)度并無(wú)顯著差異。與根長(zhǎng)度的變化趨勢(shì)一樣，根表面積在50 mg·L-1濃度時(shí)也出現(xiàn)顯著下降(p<0.05)，并在此后緩慢下降，處理間無(wú)顯著差異。

表2 不同Cu2+濃度對(duì)白三葉根系的影響

相比對(duì)照，根系體積在5～10 mg·L-1濃度范圍內(nèi)逐漸增加，但隨后大幅度下降；在50 mg·L-1時(shí)根系體積顯著降低(p<0.05)，在Cu2+脅迫濃度為400 mg·L-1時(shí)其根系體積為0.26 mm3，為對(duì)照的50%，但在50～400 mg·L-1范圍內(nèi)各Cu2+脅迫處理間并無(wú)顯著差異。根系平均直徑在Cu2+脅迫下不同程度地增大，其中在10 mg·L-1時(shí)根系平均直徑最大，為0.47 mm，較對(duì)照增加了17.5%，說(shuō)明Cu2+脅迫抑制了根系的生長(zhǎng)，使得根系變粗，變短。

2.3 不同Cu2+濃度下白三葉發(fā)芽率和根長(zhǎng)度的回歸分析

發(fā)芽率和根長(zhǎng)度是白三葉種子受脅迫時(shí)的主要特征指標(biāo)，本研究對(duì)不同Cu2+脅迫下的白三葉的相對(duì)發(fā)芽率和根長(zhǎng)度進(jìn)行回歸分析，結(jié)果(圖1)表明，不同Cu2+濃度與相對(duì)發(fā)芽率和根長(zhǎng)度的回歸模型均呈指數(shù)關(guān)系。根據(jù)相對(duì)發(fā)芽率的回歸模型y=127.7 e-0.01 x(R2=0.968 4)，白三葉Cu2+脅迫半致死濃度(相對(duì)發(fā)芽率為50%)為93.7 mg·L-1，絕對(duì)致死濃度(相對(duì)發(fā)芽率為10%)為254.7 mg·L-1。而根長(zhǎng)度為對(duì)照50%時(shí)的Cu2+脅迫濃度為238.6 mg·L-1，但是在Cu2+脅迫濃度為50 mg·L-1時(shí)，根長(zhǎng)度呈現(xiàn)“斷崖式”降低，嚴(yán)重影響幼苗發(fā)育。

圖1 不同濃度Cu2+脅迫下白三葉相對(duì)發(fā)芽率和根長(zhǎng)度變化趨勢(shì)

3 討 論

植物種子萌發(fā)是幼苗發(fā)育生長(zhǎng)的先決條件。本研究對(duì)白三葉種子在不同濃度Cu2+脅迫下的種子萌發(fā)和發(fā)育特征進(jìn)行了研究。在低Cu2+濃度下(5 mg·L-1)白三葉種子發(fā)芽率略有提高，但并未達(dá)到顯著水平；在Cu2+濃度為100 mg·L-1時(shí)，白三葉種子發(fā)芽率顯著下降，發(fā)芽率為對(duì)照的76%，并且與對(duì)照差異顯著(p<0.05)，這一結(jié)果與趙玉紅等[13]對(duì)重金屬脅迫下的白三葉發(fā)芽率研究結(jié)果一致。但是，關(guān)于白三葉耐受Cu2+脅迫的敏感濃度并沒有一致的結(jié)論，陳雪梅等[15]在研究白三葉Cu2+耐受性時(shí)發(fā)現(xiàn)，Cu2+濃度在20 mg·L-1即可顯著降低白三葉發(fā)芽率；而宋鳳鳴等[16]發(fā)現(xiàn)，Cu2+濃度達(dá)到400 mg·L-1時(shí)才能顯著降低白三葉發(fā)芽率；而本實(shí)驗(yàn)在Cu2+濃度超過100 mg·L-1時(shí)白三葉種子發(fā)芽率才顯著降低，這可能與試驗(yàn)選用的試驗(yàn)材料有關(guān)。

根據(jù)白三葉相對(duì)發(fā)芽率回歸方程，鄂牧1號(hào)白三葉對(duì)Cu2+脅迫的半致死濃度為93.7 mg·L-1，絕對(duì)致死濃度為254.7 mg·L-1；相對(duì)根長(zhǎng)為50%時(shí)的Cu2+濃度為238.6 mg·L-1。白三葉根長(zhǎng)在Cu2+濃度達(dá)到50 mg·L-1時(shí)即顯著下降，并且同時(shí)根表面積和根系體積顯著減少，而根系平均直徑則顯著增加，說(shuō)明白三葉根系對(duì)Cu2+脅迫更為敏感。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，雖然幼苗仍有胚芽生長(zhǎng)，但子葉發(fā)黃，胚根幾乎沒有發(fā)育，幼苗無(wú)法繼續(xù)正常生長(zhǎng)，這一結(jié)果與紫花苜蓿種子在Cu2+脅迫下的表現(xiàn)較為一致[12]。許多研究表明，低濃度的Cu2+對(duì)種子萌發(fā)抑制作用不明顯，但對(duì)根發(fā)育具有顯著抑制作用[17-18]，這也說(shuō)明重金屬Cu2+對(duì)白三葉種子萌發(fā)的影響主要體現(xiàn)在抑制根生長(zhǎng)[19]，并且這種影響是不可恢復(fù)的；另一方面也說(shuō)明白三葉根系發(fā)育對(duì)Cu2+脅迫更為敏感。

盡管本研究中白三葉在Cu2+濃度為50 mg·L-1時(shí)根系即受到顯著抑制，但在實(shí)際生產(chǎn)中銅含量超過這個(gè)值時(shí)白三葉能夠正常生長(zhǎng)[9]，這可能是由于種子萌發(fā)時(shí)為游離態(tài)的Cu2+，而在土壤中還有復(fù)合態(tài)的銅存在。研究證明，白三葉不僅作為單一群落能夠?qū)ν寥楞~污染進(jìn)行修復(fù)，而且還可以促進(jìn)其他植物對(duì)土壤中重金屬的吸收，比如混種白三葉可以有效提高假繁縷(Pseudostellariamaximowicziana)植物對(duì)鉻、銅和鎳等重金屬的吸收[20]，鄂牧1號(hào)白三葉是否可以促進(jìn)其他植物對(duì)重金屬的吸收尚需進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

鄂牧1號(hào)白三葉在Cu2+脅迫下，種子萌發(fā)指標(biāo)和根系指數(shù)均受到不同程度的影響，其中低濃度Cu2+(5 mg·L-1)可以促進(jìn)種子發(fā)芽，在100 mg·L-1濃度時(shí)發(fā)芽率顯著降低，相對(duì)發(fā)芽率半致死濃度為93.7 mg·L-1，絕對(duì)致死濃度為254.7 mg·L-1。這一結(jié)果可作為白三葉幼苗耐銅性研究的篩選濃度。

種子胚根發(fā)育受Cu2+脅迫較為敏感，Cu2+濃度在50 mg·L-1時(shí)即可顯著抑制白三葉根系發(fā)育；在Cu2+濃度達(dá)238.6 mg·L-1時(shí)其相對(duì)根長(zhǎng)為50%。