李 巖， 田維麗， 謝恩俊， 岑 露， 趙德剛,2

(1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院,山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山地生態(tài)與農(nóng)業(yè)生物工程協(xié)同創(chuàng)新中心, 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院國(guó)家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部DUS中心貴陽(yáng)分中心,貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所， 貴陽(yáng) 550006)

茶樹(shù)[Camelliasinensis(L.) O. Ktze.]為山茶科山茶屬多年生木本植物，起源于我國(guó)西南地區(qū)，異花授粉，喜溫濕氣候。貴州省有茶園面積46.2萬(wàn)hm2，是我國(guó)茶樹(shù)栽培面積最大的省份，作為貴州省的特色優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)，茶產(chǎn)業(yè)是縱深推進(jìn)農(nóng)村產(chǎn)業(yè)革命的12個(gè)主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)之一。貴州屬亞熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候，適宜茶樹(shù)的栽培和生長(zhǎng)，但冬季氣溫低，年極端最低氣溫為-12.1～-4 ℃，均值為-7.7 ℃[1]，且每年3—4月份往往會(huì)有4 ℃以下的倒春寒現(xiàn)象，茶樹(shù)受低溫脅迫輕則造成芽葉葉尖變紅，嚴(yán)重時(shí)葉緣及芽變成黑褐色，葉片失水卷縮或脫落嚴(yán)重影響茶葉品質(zhì)和產(chǎn)量。茶樹(shù)品種間遺傳差異大，抗低溫脅迫能力也有較大差異，因此，選育抗寒性強(qiáng)的優(yōu)良品系對(duì)抵御茶園凍害和促進(jìn)貴州茶葉提質(zhì)、增收具有重要的意義。

低溫脅迫能夠引起茶樹(shù)的膜系統(tǒng)、細(xì)胞滲透壓、原生質(zhì)膠體特性、物質(zhì)代謝和保護(hù)酶系統(tǒng)等發(fā)生一系列改變，影響茶樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育，嚴(yán)重時(shí)將導(dǎo)致植株死亡。一些植物長(zhǎng)期在低溫逆境中已形成抗寒能力，如改變植物體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、酶活性等方式以增加對(duì)低溫脅迫的抗性[2]。宋緒忠研究認(rèn)為，茶樹(shù)葉片的顏色及色素組成對(duì)抗寒性影響較大，葉綠素a和葉綠素b比值與抗寒性有較大關(guān)系[3]?？扇苄蕴呛颗c抗寒性之間呈正相關(guān)[4]。保護(hù)酶活性與抗寒性有著密切的關(guān)系，對(duì)藍(lán)莓[5]、核桃[6]、胡椒[7]等植物的研究表明，抗寒性強(qiáng)的品系抗氧化酶活性下降幅度小。低溫脅迫后超氧陰離子和過(guò)氧化氫會(huì)有所增加[8]。丙二醛(MDA)含量與茶樹(shù)抗寒性之間的規(guī)律不明顯[9]。茶樹(shù)葉片中保護(hù)酶活性、可溶性糖含量、丙二醛含量等主要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可作為茶樹(shù)抗寒性評(píng)價(jià)的參考指標(biāo)[10-11]。本研究以貴州地區(qū)規(guī)?；N植且具有代表性茶樹(shù)黔茶1號(hào)、黔茶8號(hào)、福鼎白茶、紫魁為研究對(duì)象，通過(guò)低溫脅迫處理，測(cè)定等葉齡葉片的葉綠素(Chl)、可溶性糖、丙二醛(MDA)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化物酶(POD)等生理生化指標(biāo)，并進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，為抗寒性茶樹(shù)選育提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料黔茶1號(hào)(湄潭苔茶群體N-61栽培種)、黔茶8號(hào)、福鼎白茶和紫魁(N-61紫化芽變材料)均種植于貴州大學(xué)南校區(qū)農(nóng)業(yè)生物工程研究院茶樹(shù)種質(zhì)資源圃。

1.2 方 法

1.2.1低溫脅迫處理

根據(jù)李葉云等[12]的研究方法，對(duì)盆栽茶樹(shù)黔茶1號(hào)、黔茶8號(hào)、福鼎白茶和紫魁進(jìn)行低溫脅迫處理，采用4 ℃和-4 ℃2個(gè)溫度處理24 h，每個(gè)處理重復(fù)3次，以常溫(28 ℃)未處理為對(duì)照組(ck)。盆栽茶樹(shù)樹(shù)苗在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)和低溫處理，光照強(qiáng)度20 000 lx，光周期12 h·d-1。

1.2.2測(cè)定指標(biāo)

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究采用Microsoft Excel軟件和SPSS Statistics 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、分析及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對(duì)葉綠素含量的影響

測(cè)定4種茶樹(shù)4 ℃和-4 ℃低溫脅迫下的葉綠素含量，結(jié)果表明，處理前(28 ℃)紫魁與黔茶1號(hào)的葉綠素含量較高，而黔茶8號(hào)與福鼎白茶較低。4 ℃處理后，4種茶樹(shù)葉片的葉綠素含量均降低，此時(shí)，紫魁的葉綠素含量最高，福鼎白茶次之，而黔茶8號(hào)和黔茶1號(hào)的葉綠素含量較低分別為1.315 mg·g-1和1.221 mg·g-1。-4 ℃處理后，紫魁的葉綠素含量仍然最高，為1.550 mg·g-1，福鼎白茶的葉綠素含量降低幅度最(見(jiàn)表1)。

表1 不同溫度下4種茶樹(shù)葉片葉綠素與可溶性糖含量

在4 ℃和-4 ℃處理后紫魁葉片的葉綠素含量一直保持最高，特別是在-4 ℃處理后其明顯高于其它3種材料，可見(jiàn)紫魁在2種溫度下均較好地保持了較高的葉綠素含量，福鼎白茶在4 ℃處理時(shí)保持了較高的葉綠素含量，但在-4 ℃處理后含量迅速下降，可能是從4 ℃降低溫度到-4 ℃后，葉綠素大量降解所導(dǎo)致。

2.2 低溫脅迫對(duì)可溶性糖含量的影響

可溶性糖是植物滲透調(diào)節(jié)的重要物質(zhì)。由表1和圖1可見(jiàn)，處理前，紫魁的可溶性糖含量最高，福鼎白茶含量次之，黔茶1號(hào)和黔茶8號(hào)的可溶性糖含量較少；4 ℃處理后，4種茶樹(shù)可溶性糖含量均增加，說(shuō)明4種茶樹(shù)在4 ℃下通過(guò)增加可溶性糖含量來(lái)抵抗低溫，此時(shí)黔茶8號(hào)可溶性糖含量增加最多，福鼎白茶和紫魁次之，而黔茶1號(hào)最低。-4 ℃處理后福鼎白茶和紫魁的可溶性糖含量繼續(xù)增加，在-4 ℃下仍然能夠通過(guò)合成更高的可溶性糖來(lái)抵抗低溫，而此時(shí)黔茶1號(hào)和黔茶8號(hào)含量相較4 ℃處理出現(xiàn)了明顯的下降(見(jiàn)圖1)。

圖1 不同溫度下4種茶樹(shù)葉片可溶性糖含量變化

紫魁和福鼎白茶在4 ℃和-4 ℃均保持持續(xù)上升，提高低溫脅迫抗性。而黔茶1號(hào)和黔茶8號(hào)-4 ℃出現(xiàn)下降，失去了持續(xù)提高可溶性糖的能力。

2.3 低溫脅迫對(duì)保護(hù)酶酶活性的影響

2.3.1低溫脅迫對(duì)CAT酶活性的影響

CAT是植物體內(nèi)清除過(guò)氧化氫能力的重要指標(biāo)。由表2和圖2可見(jiàn)，處理前，紫魁的CAT酶活性最高，顯著高于福鼎白茶和黔茶8號(hào)，而最低為黔茶1號(hào)。4 ℃處理后，4種茶樹(shù)葉片的CAT酶活性均增加且均達(dá)到最大值，紫魁最高，福鼎白茶次之，而黔茶8號(hào)增幅最小。-4 ℃時(shí)，4種茶樹(shù)葉片的CAT酶活性均下降，此時(shí)紫魁CAT酶活性仍然最高，福鼎白茶次之，黔茶8號(hào)和黔茶1號(hào)的CAT酶活性較低。

圖2 不同溫度下4種茶樹(shù)葉片CAT酶活性變化

紫魁在4 ℃和-4 ℃均具有最高的CAT酶活性，能夠更有效的清除過(guò)氧化氫。而福鼎白茶、黔茶8號(hào)、黔茶1號(hào)次之。

2.3.2低溫脅迫對(duì)SOD酶活性的影響

SOD是植物體內(nèi)清除超氧陰離子能力的重要指標(biāo)。隨著處理溫度的下降，4種茶樹(shù)葉片的SOD酶活性變化差異顯著(見(jiàn)表2，圖3)。28 ℃時(shí)紫魁的SOD酶活性最高，其次為黔茶8號(hào)和福鼎白茶；黔茶1號(hào)最低。4 ℃低溫處理后，黔茶1號(hào)、黔茶8號(hào)和福鼎白茶葉片的SOD酶活性均出現(xiàn)下降，而紫魁的SOD酶活性升高；-4 ℃處理后，紫魁SOD酶活性繼續(xù)提高，此時(shí)黔茶1號(hào)、黔茶8號(hào)和福鼎白茶也出現(xiàn)提高，但仍然低于紫魁。

圖3 不同溫度下4種茶樹(shù)葉片SOD酶活性變化

表2 不同溫度下4種茶樹(shù)葉片保護(hù)酶含量

紫魁在4 ℃和-4 ℃的SOD酶活性均最高，能夠更有效的清除超氧陰離子。其次為黔茶8號(hào)、福鼎白茶和黔茶1號(hào)。

2.3.3低溫脅迫對(duì)POD酶活性的影響

POD也是植物體內(nèi)清除過(guò)氧化物能力的重要指標(biāo)。測(cè)定結(jié)果顯示，未處理前，福鼎白茶的POD酶活性最高，黔茶8號(hào)和紫魁次之，而黔茶1號(hào)的POD酶活性最低。4 ℃處理時(shí)，黔茶1號(hào)、黔茶8號(hào)、福鼎白茶和紫魁的POD酶活性均降低。-4 ℃處理時(shí)，黔茶8號(hào)、福鼎白茶和紫魁的POD酶活性均增加，而黔茶1號(hào)的POD酶活性卻減少(見(jiàn)表2，圖4)。

圖4 不同溫度下4種茶樹(shù)葉片POD酶活性變化

紫魁在整個(gè)低溫脅迫中POD酶活性增加幅度最大，降低幅度最?。黄浯问歉６Π撞韬颓?號(hào)，而黔茶1號(hào)的POD酶活性在整個(gè)過(guò)程中均減少。并且紫魁在整個(gè)低溫脅迫中酶活性均為最高，能夠更有效的清除過(guò)氧化物。

2.4 低溫脅迫對(duì)含量的影響

圖5 不同溫度下4種茶樹(shù)葉片的含量變化

表3 不同溫度下4種茶樹(shù)葉片含量和CAT含量

2.5 低溫脅迫對(duì)H2O2含量的影響

隨著處理溫度的下降，4種茶樹(shù)葉片的H2O2含量均增加，且變化顯著(見(jiàn)表3，圖6)。未處理前，黔茶8號(hào)的H2O2含量最多，其次為福鼎白茶和黔茶1號(hào)，紫魁最少。4 ℃處理時(shí)，黔茶1號(hào)的H2O2含量增加幅度最大，其次為黔茶8號(hào)和福鼎白茶；紫魁的H2O2含量增加幅度最小。-4 ℃處理時(shí)，黔茶8號(hào)的H2O2含量增加幅度最大；其次為黔茶1號(hào)和福鼎白茶；紫魁的H2O2含量增加幅度最小。

圖6 不同溫度下4種茶樹(shù)葉片的H2O2含量變化

紫魁在4 ℃和-4 ℃處理時(shí)，H2O2含量均為最低，并且增加幅度也是最小，說(shuō)明紫魁的保護(hù)酶系統(tǒng)對(duì)H2O2清除能力較強(qiáng)。其次為福鼎白茶、黔茶8號(hào)和黔茶1號(hào)。

2.6 低溫脅迫對(duì)MDA含量的影響

MDA是膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物的重要指標(biāo)。隨著處理溫度的下降，4種茶樹(shù)的MDA含量變化顯著(見(jiàn)表4，圖7)。未處理前，紫魁的MDA含量最高，其次為黔茶1號(hào)，福鼎白茶和黔茶8號(hào)相較之下較低。4 ℃處理時(shí)，黔茶1號(hào)、黔茶8號(hào)、福鼎白茶、紫魁的MDA含量均增加；-4 ℃處理時(shí)，黔茶1號(hào)、黔茶8號(hào)、福鼎白茶和紫魁的MDA含量均增加，并且整個(gè)過(guò)程中，紫魁增加幅度最??；黔茶8號(hào)的增加幅度最大。

圖7 不同溫度下4種茶樹(shù)葉片MDA含量變化

紫魁在未處理與處理時(shí)MDA含量均為最高，但增加幅度卻最小，說(shuō)明紫魁的保護(hù)酶系統(tǒng)的清除能力較強(qiáng)。其次為福鼎白茶、黔茶1號(hào)和黔茶8號(hào)。本研究中紫魁28 ℃時(shí)MDA含量較高，其原因有待于進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論與討論

低溫脅迫處理下，4種茶樹(shù)葉片的各項(xiàng)生理生化指標(biāo)變化不同反映了不同茶樹(shù)的抗寒性。茶樹(shù)是貴州省重要的經(jīng)濟(jì)作物，但是每年都會(huì)因極端低溫天氣造成一定損失。選育抗寒性強(qiáng)的茶樹(shù)品系具有重要意義。

Chl具有吸收與傳遞光能的作用。在一定范圍內(nèi)，光合速率與葉綠素含量呈正相關(guān)關(guān)系。另外，葉綠素含量與植物生長(zhǎng)狀態(tài)有著密切的關(guān)系，低溫、元素缺乏、干旱等都會(huì)影響葉綠素的含量，導(dǎo)致植物不能正常進(jìn)行光合作用，進(jìn)而影響植物正常生長(zhǎng)[14]。本研究利用低溫脅迫處理4種不同品系茶樹(shù)，結(jié)果表明，不同茶樹(shù)的葉綠素含量均下降，與劉凱歌等[15]的研究結(jié)果一致。

可溶性糖是植物細(xì)胞中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，與植物抗寒性密切相關(guān)。低溫脅迫下，細(xì)胞通過(guò)積累可溶性糖來(lái)提高細(xì)胞液濃度，冰點(diǎn)降低，緩減細(xì)胞質(zhì)過(guò)度脫水，保護(hù)細(xì)胞質(zhì)膠體不至遇冷凝固，利于抗凍[16]。本研究表明，低溫處理下4種茶樹(shù)葉片中可溶性糖含量都顯著上升。黔茶1號(hào)和黔茶8號(hào)在4 ℃處理時(shí)，可溶性糖含量達(dá)到峰值后出現(xiàn)下降，可能是-4 ℃低溫處理下膜系統(tǒng)受害，增加量相對(duì)減少。福鼎白茶和紫魁葉片的可溶性糖含量一直處于上升趨勢(shì)，可能是細(xì)胞內(nèi)通過(guò)增加可溶性糖含量來(lái)調(diào)節(jié)抗寒能力的生理響應(yīng)較晚，這與趙洪春等[17]的研究結(jié)果一致。

CAT、SOD、POD是植物防止膜脂過(guò)氧化酶促防御體系中重要的保護(hù)酶。低溫脅迫下，植物通過(guò)增加抗氧化酶活性清除過(guò)剩的活性氧自由基，防止膜質(zhì)過(guò)氧化，降低細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)的破壞程度，維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和完整性，在提高植物的抗性方面起到關(guān)鍵作用[18]。本研究中，隨著處理溫度的降低，4種茶樹(shù)葉片的CAT酶活性先上升后下降，與嚴(yán)岳華等[19]對(duì)柑桔的研究結(jié)果一致。SOD和POD酶活性隨處理溫度的降低均先降低后上升，這是因?yàn)榈蜏孛{迫下活性氧自由基產(chǎn)生和消除平衡遭到破壞，加劇膜脂過(guò)氧化，蛋白質(zhì)合成受阻。同時(shí)清除H2O2的酶類(lèi)(CAT、POD)不協(xié)調(diào)，導(dǎo)致-4 ℃處理時(shí)SOD和POD酶活性增加，這與崔強(qiáng)旺等[20]的研究結(jié)果一致。

MDA是膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物，反映植物細(xì)胞膜受傷害的程度。低溫脅迫引起植物細(xì)胞內(nèi)活性氧的增加，最直接的作用是使膜脂的過(guò)氧化程度增加，產(chǎn)生大量膜質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA[22]。膜質(zhì)的過(guò)氧化程度越低，MDA積累降低，植物抗寒性就越強(qiáng)。本研究中，低溫脅迫下4種茶樹(shù)葉片的MDA含量隨處理溫度的降低均上升，上升幅度越小，說(shuō)明抗寒性越強(qiáng)，這與劉國(guó)宇等[23]對(duì)觀賞植物的耐寒性研究結(jié)果一致。