袁利兵，張琨，彭志紅，任春梅,

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.作物基因工程湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128）

花青素（anthocyanin）作為植物的次級代謝產(chǎn)物，起吸引昆蟲傳粉、提高植物耐寒、抗凍、抗旱及滲透應(yīng)激能力、光保護、清除自由基、抗氧化和抗病蟲害等多重作用[1-4]。花青素的生物合成受多基因控制，環(huán)境因素會造成植物體內(nèi)花青素的積累[5]，糖作為外界環(huán)境信號能誘導(dǎo)植物花青素的積累[6]。擬南芥psc1突變體能夠部分抑制coi1突變體對茉莉素的不敏感反應(yīng)[7]，而COI1基因在蔗糖調(diào)控花青素生物合成中有著重要作用[8]，因此推測psc1突變體可能對蔗糖誘導(dǎo)的花青素積累有影響。筆者以擬南芥野生型Col-0和psc1突變體為材料，研究不同蔗糖濃度下psc1突變體中花青素的積累以及花青素生物合成關(guān)鍵基因DFR[9]的表達，并利用添加表油菜素內(nèi)酯來進一步研究psc1突變體中花青素的積累。

1 材料與方法

1.1 材 料

擬南芥（Arabidopsis thaliana）野生型（Col-0，WT）和psc1突變體，由作物基因工程湖南省重點實驗室植物信號傳導(dǎo)課題組提供。表油菜素內(nèi)酯（epibrassinolide，epi-BL）購自 Sigma公司，TRIzol Reagent購自 Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Kit-ReverTra Ace-α-TM）購自Toyobo公司。

1.2 方 法

1.2.1 植株的培養(yǎng)和生長條件

擬南芥WT和psc1突變體種子用消毒液浸泡10 min后，無菌水清洗5次，播種于含30 mmol/L蔗糖的1/2MS固體培養(yǎng)基上，經(jīng)4 °C暗處理3 d后，轉(zhuǎn)入23 °C光照培養(yǎng)7 d（每天光照16 h）。再將擬南芥幼苗轉(zhuǎn)入新的1/2MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中分別含0、30、60、90、120、150 mmol/L蔗糖，繼續(xù)生長5 d后提取花青素，同時收取幼苗，經(jīng)液氮處理后置－80 °C保存。將23 °C光照培養(yǎng)7 d的psc1突變體幼苗轉(zhuǎn)至不添加或添加10 nmol/L表油菜素內(nèi)酯的含0、90 mmol/L蔗糖[8]的1/2MS培養(yǎng)基，繼續(xù)光照培養(yǎng)，5 d后提取花青素，將幼苗液氮處理后置－80 °C保存?；ㄇ嗨靥崛『秃繙y定參照文獻[10]方法進行。

1.2.2 RNA的提取和RT-PCR分析

Trizol法提取于－80 °C保存的幼苗總RNA。RT-PCR分析按照常規(guī)操作進行，使用 ABI-2720 Thermal Cycler 型PCR儀，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA第1條鏈。DFR基因PCR擴增所用的引物為：5'-ATGGTTAGTCAGAAAGAGA CCG-3'和5'-GTCTTATGATCGAGTAATGCGC-3'；以ACT2基因為參照基因，所用引物為：5'-TTCCGC TCTTTCTTTCCAAGCTCA-3'和5'-AAGAGGCATC AATTCGATCACTCA-3'。反應(yīng)體系（20 μL）為：cDNA 1 μL，10×Buffer 2 μL，dNTPs（10 mmol/L） 0.5 μL，Taq酶（5 U/μL）0.3 μL，引物各0.8 μL，補水至20 μL。對DFR和ACT2基因分別進行PCR擴增， PCR反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共26個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥psc1突變體在不同蔗糖濃度下花青素的積累

從圖1可以看出，WT和psc1突變體的花青素積累量隨著蔗糖濃度升高而增加，當(dāng)蔗糖濃度為30 mmol/L時，WT和psc1突變體中花青素積累量與無糖時相近；濃度為60 mmol/L時，psc1突變體中花青素含量開始低于WT，隨著蔗糖濃度的升高，兩者的差距變得愈發(fā)明顯。蔗糖濃度為150 mmol/L時，花青素積累的差異尤為顯著，psc1突變體中花青素積累已經(jīng)遠(yuǎn)低于WT中的，這說明突變體psc1減少了蔗糖所誘導(dǎo)的花青素積累。

圖 1 不同蔗糖濃度下擬南芥花青素的積累Fig.1 Anthocyanin accumulation of Arabidopsis induction by different concentration of sucrose

2.2 不同濃度蔗糖處理下DFR基因的表達

選取0 mmol/L和150 mmol/L蔗糖處理的擬南芥幼苗RNA進行RT-PCR分析，結(jié)果（圖2）顯示，在無蔗糖條件下，WT和psc1突變體中DFR基因幾乎不表達；當(dāng)蔗糖濃度為150 mmol/L時，DFR基因得到表達，但與WT相比，psc1突變體中DFR基因的表達較弱，這與兩者花青素積累的變化趨勢一致。

圖 2 蔗糖誘導(dǎo)DFR基因RT-PCR檢測結(jié)果Fig.2 RT-PCR anaylsis results of DFR gene induction by sucrose

2.3 表油菜素內(nèi)酯處理下psc1突變體中花青素的積累

在無糖時，添加表油菜素內(nèi)酯，對擬南芥psc1突變體花青素的積累影響甚微；當(dāng)培養(yǎng)基中蔗糖濃度為90 mmol/L時，添加10 nmol/L表油菜素內(nèi)酯，擬南芥psc1突變體的花青素比未添加的有明顯升高。表明表油菜素內(nèi)酯促進了psc1突變體中蔗糖誘導(dǎo)的花青素積累。

圖 3 蔗糖和表油菜素內(nèi)酯處理下擬南芥psc1突變體花青素的積累Fig.3 Anthocyanin accumulation of psc1 mutant with the treatment of sucrose and epi-BL

2.4 表油菜素內(nèi)酯處理下psc1突變體中DFR基因的表達

通過RT-PCR分析（圖4）得出，當(dāng)無蔗糖添加時，psc1突變體DFR基因的表達量都非常低；當(dāng)含有蔗糖處理時，DFR基因得到表達，經(jīng)10 nmol/L表油菜素內(nèi)酯處理后，DFR基因表達強烈。說明表油菜素內(nèi)酯在蔗糖存在情況下促進了psc1突變體中DFR基因的表達。

圖 4 蔗糖和表油菜素內(nèi)酯處理下擬南芥psc1突變體DFR基因RT-PCR檢測結(jié)果Fig.4 RT-PCR anaylsis results of DFR gene of psc1 mutant with the treatment of sucrose and epi-BL

3 討 論

研究表明，糖與花青素的積累密切相關(guān)[11-12]，糖作為一種信號分子，通過特異的信號傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)花青素合成相關(guān)酶基因的表達，進而影響植物花青素的積累[13]。Teng等[14]和Solfanelli等[15]研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖能夠誘導(dǎo)擬南芥花青素生物合成途徑中的某些基因增加其表達量，使植株中花青素的含量增加。本試驗用擬南芥WT和psc1突變體研究不同濃度蔗糖誘導(dǎo)花青素的積累，結(jié)果與Baier等[16]報道的高糖敏感突變體植株對不同蔗糖濃度表現(xiàn)出相應(yīng)花青素積累量的研究結(jié)果一致，即蔗糖濃度影響花青素的積累。由于psc1突變體是DWF4基因的弱突變體，表現(xiàn)出蕓薹素生物合成缺陷型突變體dwf4的部分表型[7]，因此用添加外源蕓薹素表油菜素內(nèi)酯進一步研究psc1突變體中蔗糖誘導(dǎo)花青素積累情況。研究發(fā)現(xiàn)，表油菜素內(nèi)酯對花青素的影響需要蔗糖的參與，這與相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)外源植物激素只有在糖存在時才能誘導(dǎo)花青素生物合成相關(guān)基因的表達[8]一致。

各種植物激素與糖相互作用形成一個復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)，通過綜合作用調(diào)節(jié)花青素的生物合成。不同激素與糖的相互作用對花青素生物合成的影響不同。在擬南芥中，茉莉素和脫落酸對蔗糖有協(xié)同作用，都增強花青素合成途徑中的大部分基因的表達，而赤霉素卻抑制這一類基因的表達[8]。本研究顯示，psc1突變體中蔗糖所誘導(dǎo)的花青素積累減少，并且降低蔗糖誘導(dǎo)的DFR基因的表達。而添加表油菜素內(nèi)酯后能夠促進psc1突變體中蔗糖誘導(dǎo)的花青素積累和DFR基因的表達。這意味著蕓薹素可能與茉莉素和脫落酸一樣，能協(xié)同蔗糖調(diào)節(jié)花青素生物合成的過程。

植物體內(nèi)調(diào)控花青素生物合成的基因除結(jié)構(gòu)基因外，還包括編碼調(diào)控花青素合成的轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)基因[17-18]，因此，激素與糖之間的相互作用對花青素積累的調(diào)控顯得更為復(fù)雜。此外，植物體內(nèi)激素之間彼此也存在著復(fù)雜的相互作用，psc1突變體中DWF4基因的表達缺陷及外源蕓薹素表油菜素內(nèi)酯在與蔗糖相互作用時是否又與內(nèi)源激素系統(tǒng)發(fā)生復(fù)雜的相互作用，從而影響花青素的生物合成，還有待深入研究。

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英文編輯：易來賓