王錦，謝遲，董新榮，雷孝

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

分子印跡聚合物（MIPs）是以化合物的分子結(jié)構(gòu)為模板（模板分子或印跡分子）制備的聚合物，是一種具有“記憶”功能的高分子材料。由于MIPs具有選擇性地吸附印跡分子的性能，被廣泛應(yīng)用于各種選擇性分離與檢測(cè)方法中[1-3]。

L-酪氨酸（L-Tyr）是合成多肽類激素、抗生素、L-多巴等藥物的主要原料，還常用作食品添加劑和配制人工昆蟲(chóng)飼料。L-Tyr主要從含蛋白質(zhì)的物質(zhì)（廢絲、酪蛋白和玉米等）的水解液中提取，以葡萄糖為原料，經(jīng)短桿菌出發(fā)誘導(dǎo)的l-酪氨酸生產(chǎn)菌發(fā)酵而得[4-5]。由于產(chǎn)品組成復(fù)雜或L-Tyr含量低，分離純化、富集檢測(cè)都較困難。目前L-Tyr的分離純化及分析檢測(cè)仍沿用傳統(tǒng)方法，試劑用量大，效率低。筆者用本體聚合法制備的L-Tyr印跡聚合物，能從復(fù)雜的體系中選擇性吸附L-Tyr，有利于對(duì)L-Tyr的快速分離純化及檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

L-Tyr （國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；α-甲基丙烯酸（MAA）（天津科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心）；偶氮二異丁腈（AIBN）（天津科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心） ；二甲基丙烯酸乙二醇酯（EDMA）（美國(guó) CIBA公司，交聯(lián)度、雙酯度98.80%，酯度99.70%，酸度0.08%）；甲基丙烯酸羥乙酯（HEMA）（上海華誼丙烯酸有限公司）；4-乙烯基吡啶（4-VP）（Alfa Aesar，Johnson Matthey Company）；氮?dú)猓ê浚?9.5%）。

日立2500熒光分光光度計(jì)（日立公司）；恒溫水浴振蕩器（江蘇大地自動(dòng)化儀器廠）； DL-360A超聲清洗儀（上海之信儀器有限公司）；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；AL-204電子天平（梅特勒-托利多）；索氏提取器；分樣篩（74 μm）；84-1磁力攪拌控溫電熱套（河南鞏義市昌旺儀器廠）。

1.2 方 法

1.2.1 L-Tyr印跡聚合物的合成

稱取0.364 6 g L-Tyr于錐形瓶中，加入功能單體和15 mL溶劑，磁力攪拌3 h。再加入交聯(lián)劑、引發(fā)劑AIBN 0.06 g，在超聲波清洗儀中活化20 min，通氮?dú)? min，抽真空，置于水浴中熱引發(fā)并反應(yīng)24 h，得白色塊狀聚合物固體，攪碎，取出固體，洗滌，干燥，粉碎，過(guò)74 μm分樣篩，得粒徑為74 μm微球，用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液清洗模板分子和未聚合的功能單體和交聯(lián)劑，得到L-Tyr印跡聚合物。

1） 單因素試驗(yàn)?？疾旃δ軉误w[6]（MAA、4-VP）及用量（模板分子與功能單體量比分別為1∶1、1∶2、1∶4、1∶6）、交聯(lián)劑（EDMA、HEMA）[7-8]及用量（模板分子與功能單體和交聯(lián)劑量比分別為1∶4∶10、1∶4∶20、1∶4∶30、1∶4∶40）、反應(yīng)溶劑[9-10]（乙腈、乙醇、氯仿）和引發(fā)溫度[11]（0、20、40、60、80 ℃）變化對(duì)制備L-Tyr印跡聚合物的影響。以印跡聚合物的萃取效率、選擇性吸附L-Tyr的飽和吸附量為指標(biāo)考察聚合物的性能。

2） 正交試驗(yàn)。用3水平4因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)L9（34），以L-Tyr印跡聚合物的萃取效率、選擇性吸附L-Tyr的飽和吸附量為指標(biāo)，考察功能單體MAA用量（4、8、12 mmoL）、交聯(lián)劑EDMA用量（20、40、60 mmoL）、溶劑種類（乙腈、乙醇、氯仿）、溫度（40、60、80 ℃）對(duì)制備L-Tyr印跡聚合物的影響。

1.2.2 L-Tyr印跡聚合物的紅外光譜分析

分別將模板分子L-Tyr、L-Tyr印跡聚合物MIPs及萃取去除模板分子L-Tyr后的聚合物、空白印跡聚合物 NMIPs（不加模板分子 L-Tyr的聚合物）與KBr（質(zhì)量比1∶100）混合壓片，用傅立葉紅外光譜儀在4 000～400 cm-1范圍掃描[12]，繪制透光光譜。

1.3 L-Tyr印跡聚合物的性能評(píng)價(jià)

1.3.1 測(cè)定MIPs模板分子萃取效率

將所制備的74 μm微球聚合物MIPs置于真空干燥箱充分干燥后，準(zhǔn)確稱取其質(zhì)量，用100 mL醋酸-醋酸鈉緩沖溶液于索式提取器中萃取，除去模板分子，每隔24 h取萃取液測(cè)定其熒光強(qiáng)度和熒光值后，更換1次醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，用熒光分析方法測(cè)定L-Tyr的質(zhì)量濃度，待質(zhì)量濃度低于1 μg/mL時(shí)停止萃取，干燥萃取后的固體，并準(zhǔn)確稱取其質(zhì)量，計(jì)算萃取效率。

1.3.2 測(cè)定MIPs飽和吸附量

分別準(zhǔn)確稱取50 mg已萃取的的印跡分子聚合物MIPs放入具塞的小試管中，加入2.5 mL 6 mmol/L的L-Tyr的醋酸緩沖溶液，置于恒溫水浴振蕩器中，25 ℃下振蕩24 h，離心10 min，取上清液，用熒光分析方法測(cè)定L-Tyr的濃度，計(jì)算對(duì)L-Tyr的飽和吸附量（被吸附的L-Tyr的量與吸附前聚合物的量的比值）。

1.3.3 MIPs對(duì)L-Tyr的選擇性吸附

稱取已萃取的50 mg MIPs置于具塞小試管中，分別加入5 mL 0.4、0.8、1.2、1.6、1.8、3.0、4.0、5.0、6.0 mmol/L的L-Tyr和L-Phe醋酸緩沖溶液，置于恒溫水浴振蕩器中，25 ℃下振蕩24 h后，離心10 min，取上清液，用熒光分析方法測(cè)定L-Tyr的濃度，計(jì)算對(duì)L-Tyr的吸附量。

2 結(jié)果與分析

2.1 功能單體對(duì)合成印跡聚合物吸附性能的影響

以4-VP為功能單體時(shí)，萃取效率、飽和吸附量只能達(dá)到36.36%和22.04 μmol/g，而以MAA為功能單體，其用量為8 mmol時(shí)，萃取效率87.78%，飽和吸附量71.87 μmol/g，達(dá)到最大值，因而MAA適于L-Tyr印跡聚合物的制備。

2.2 交聯(lián)劑對(duì)合成印跡聚合物吸附性能的影響

在交聯(lián)劑HEMA的作用下沒(méi)有聚合物生成，而功能單體MAA與交聯(lián)劑EDMA的量比為1∶4∶20時(shí)，生成的L-Tyr印跡聚合物的萃取效率和飽和吸附量分別可達(dá)到為87.46 %和76.01 μmol/g。

2.3 溶劑對(duì)合成印跡聚合物吸附性能的影響

結(jié)果表明，氯仿極性較弱，為溶劑時(shí)所得印跡聚合物的萃取效率、飽和吸附量比另2種溶劑要好，分別為87.73 %和71.87 μmol/g，而乙腈及乙醇為溶劑時(shí)，其萃取效率、飽和吸附量?jī)H為55.41 %、52.59 μmol/g和50.04 %、31.30 μmol/g。

2.4 引發(fā)溫度對(duì)合成印跡聚合物吸附性能的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示，0、20 ℃時(shí)制備反應(yīng)不能進(jìn)行；40 ℃時(shí)制備反應(yīng)進(jìn)行不完全，只生成少量的白色聚合物；80 ℃時(shí)制備得到的聚合物熱穩(wěn)定性差，呈黃色。60 ℃時(shí)制備得到的白色印跡聚合物熱穩(wěn)定好，且萃取效率、飽和吸附量能達(dá)到87.31 %、76.97 μmol/g。

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，在氯仿溶劑中，以MAA為功能單體，EDMA為交聯(lián)劑，AIBN為引發(fā)劑，L-Tyr與MAA、EDMA、AIBN的量比為10∶40∶200∶1.5，在60 ℃水浴引發(fā)聚合制備得到的印跡聚合物萃取效率、飽和吸附量最大。

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果（表1）顯示，影響萃取效率、飽和吸附量的因素大小依次為交聯(lián)劑用量、功能單體用量、溫度、溶劑種類；最優(yōu)化理論條件為B2A2C1D2，即功能單體MAA用量8 mmol，交聯(lián)劑EDMA 40 mmol，其量比為1∶5，溶劑為氯仿，引發(fā)溫度60 ℃，為L(zhǎng)-Tyr印跡聚合物最佳制備條件，與單因素分析結(jié)果一致。

表1 MⅠPs印跡聚合物制備L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 L9 （34） orthogonal result sand analysis of MⅠPs synthesis

2.6 L-Tyr印跡聚合物紅外分析

將模板分子L-Tyr、 萃取前L-Tyr印跡聚合物、萃取后L-Tyr印跡聚合物、空白聚合物進(jìn)行紅外光譜分析[10]并比較（圖1）發(fā)現(xiàn)，模板分子L-Tyr在3 300 cm-1左右處有氨基（-NH2）的N-H伸縮振動(dòng)峰，在1 450、1 580、1 512、1 600 cm-1左右處有苯的4個(gè)特征吸收峰（譜線1）。譜線2為萃取前L-Tyr印跡聚合物的紅外圖譜，3 300 cm-1處也有氨基（-NH2）的N-H伸縮振動(dòng)峰，1 450～1 600 cm-1處也有苯的4個(gè)特征吸收峰，顯示出模板分子L-Tyr已經(jīng)與功能單體MAA結(jié)合形成了聚合物。經(jīng)過(guò)洗脫劑萃取后得到印跡聚合物MIPs（譜線3），3 300 cm-1處沒(méi)有氨基（-NH2）的N-H伸縮振動(dòng)峰，在1 450～1 600 cm-1處也沒(méi)有苯的4個(gè)特征吸收峰，與空白聚合物NMIPs紅外圖譜（譜線4）顯示一致，表明模扳分子L-Tyr已被完全洗脫，得到具有空腔結(jié)構(gòu)的印跡聚合物MIPs。

圖1 L-Tyr、萃取前聚合物、MⅠPs、NMⅠPs的紅外圖譜Fig.1 ⅠR spectra of L-Tyr, the polymer before extracting, MⅠPs and NMⅠPs

2.7 L-Tyr印跡聚合物對(duì) L-Tyr的選擇性吸附及吸附等溫線

用結(jié)構(gòu)與L-Tyr相似的苯丙氨酸L-Phe，考察L-Tyr印跡聚合物特異性吸附情況，如圖2所示。結(jié)果表明，在MIPs 對(duì)L-Tyr的吸附等溫線中，隨著L-Tyr標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的升高，MIPs的吸附量逐漸增大，這表明MIPs有固定排列且大小及空間位置與L-Tyr互補(bǔ)的空穴。這種空穴對(duì)L-Tyr分子具有“記憶” 功能，因而選擇性高，吸附能力強(qiáng)。在MIPs對(duì)L-Phe的吸附等溫線中，L-Phe的吸附量低，這是因?yàn)長(zhǎng)-Phe的結(jié)構(gòu)與MIPs中印跡空穴不互補(bǔ)，不能與空穴上的位點(diǎn)形成較強(qiáng)的作用力，而造成MIPs對(duì)其結(jié)合性不強(qiáng)。在NMIPs對(duì)L-Tyr的吸附等溫線中，隨著L-Tyr標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的升高，NMIPs的吸附量則迅速達(dá)到飽和，對(duì)于相同濃度的L-Tyr標(biāo)準(zhǔn)溶液，MIPs的吸附量均大于NMIPs的吸附量，且二者的吸附量之差隨溶液濃度的增加而增大，這表明組成相同的2種聚合物的空間結(jié)構(gòu)存在明顯的差異，NMIPs的吸附主要是非特異性吸附，沒(méi)有選擇性，吸附能力弱。

圖2 MⅠPs、NMⅠPs的吸附等溫線Fig.2 Adsorptive isotherm of MⅠPs and NMⅠPs

從圖2可以看出，在MIPs對(duì)L-Tyr的吸附等溫線中，印跡分子的吸附等溫線的形狀類似Langumir模型[12]。隨著濃度的增大，MIPs對(duì)L-Tyr的吸附量逐漸增大，且在6 mmol/L附近趨于飽和。MIPs對(duì)L-Tyr的吸附的數(shù)據(jù)可用于Scatchard[13]方程，其中MIPs各點(diǎn)的回歸方程為Q/C=73.81- 0.597 2Q，R2=0.991 2，為一線性方程，說(shuō)明MIPs表面具有均一選擇性的吸附位點(diǎn)。由 Scatchard方程求得Kd=1.674 7 μmol/mL，最大表觀結(jié)合位點(diǎn)數(shù)Qmax=123.593 4 μmol/g。

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英文編輯：易來(lái)賓