張 楠,朱維寧,蘇君藝,張林生

(西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100)

植物在受到干旱、寒冷、鹽堿等非生物脅迫時(shí)體內(nèi)會(huì)被誘導(dǎo)產(chǎn)生多種轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子直接結(jié)合或間接作用于基因啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)控一系列相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)植物體產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng)[1-2]。自從Paz-Ares等[3]首次克隆了玉米(Zeamays)的轉(zhuǎn)錄因子基因C1 以來(lái)，已有多種調(diào)控干旱、鹽漬、低溫等相關(guān)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子基因被分離克隆。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中，已經(jīng)有超過(guò)50個(gè)家族至少1 700個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因被克隆出來(lái)[4-8]，其中一部分基因是與干旱脅迫相關(guān)[9-10]。例如：bZIP家族的AREB/ABF基因可以對(duì)干旱產(chǎn)生響應(yīng)[11]，NAC基因家族的轉(zhuǎn)錄因子ANAC019、ANAC055和ANAC072則被干旱、高鹽和ABA誘導(dǎo)表達(dá)[12]，而AP2/ERF基因家族的DREB1亞家族轉(zhuǎn)錄因子通常被低溫誘導(dǎo)[13]。大量研究表明，轉(zhuǎn)錄因子在植物對(duì)干旱、低溫、鹽堿、高溫等脅迫響應(yīng)時(shí)啟動(dòng)自身體內(nèi)自我保護(hù)系統(tǒng)方面有著重要的作用[14-17]。

扁穗冰草(Agropyroncristatum)是分布于干旱、半干旱及高寒地區(qū)的多年生牧草。扁穗冰草具有較強(qiáng)的抗旱、抗寒性，可作為干旱地區(qū)水土保持和綠化植物，生態(tài)價(jià)值較高[18-19]。目前，轉(zhuǎn)錄因子在整個(gè)冰草屬中的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，本研究對(duì)已報(bào)道的一些禾本科植物的轉(zhuǎn)錄因子基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，根據(jù)核酸序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR技術(shù)、半定量RT-PCR技術(shù)來(lái)研究扁穗冰草遇寒冷及干旱脅迫時(shí)的相關(guān)基因表達(dá)趨勢(shì)，以期為深入研究轉(zhuǎn)錄因子在逆境脅迫下的細(xì)胞信號(hào)應(yīng)答及作用機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1供試材料 扁穗冰草種子由西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2試劑 RNA提取試劑Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，購(gòu)自大連寶生物(TaKaRa)公司；pGEM-T Easy Vector 購(gòu)自Promega公司；DNA分子Marker、凝膠回收試劑盒等購(gòu)自北京天根公司；Taq DNA 聚合酶(2×taqmix)購(gòu)自沃爾森公司，其他試劑均為分析純。

1.3RT-PCR克隆目的基因及半定量RT-PCR

1.3.1冷脅迫 扁穗冰草種子在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)25 ℃蛭石培養(yǎng)，稱重法控制含水量，至地上部分高約20 cm時(shí)，分別置于4 ℃ 12 h、4 ℃ 24 h、4 ℃ 36 h、4 ℃ 60 h，后恢復(fù)至25 ℃12 h，采集各脅迫時(shí)期的冰草葉片。

1.3.2干旱脅迫 扁穗冰草種子在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)25 ℃蛭石培養(yǎng)，稱重法控制含水量，至地上部分高約20 cm時(shí)，自然干旱至含水量為20%，然后分別在第1天、第3天、第5天、第7天及復(fù)水1 d時(shí)，采集各脅迫時(shí)期冰草葉片。

1.3.3RNA提取及半定量RT-PCR 參照Trizol 試劑的操作說(shuō)明提取各脅迫處理時(shí)期的扁穗冰草葉片RNA,以提取的RNA為模板，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。RT產(chǎn)物于-20 ℃下保存。利用DNAMAN 對(duì)已報(bào)道在GenBank中的禾本科植物的cbf,dreb,myb轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行比對(duì)，針對(duì)其保守區(qū)，使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)3對(duì)引物(引物由上海生工合成)。選用扁穗冰草肌動(dòng)蛋白基因ACβ-actin(GenBank登錄號(hào)：JN007031)作為內(nèi)標(biāo)基因。通過(guò)預(yù)試驗(yàn)探索確定半定量試驗(yàn)條件(表1)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析和回收純化后的目的產(chǎn)物與pGEM-T Easy Vector 連接,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109中,經(jīng)藍(lán)白斑篩選及菌落PCR鑒定后,送至上海桑尼公司測(cè)序。將目的片段在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行nBlast并分析。

表1 半定量RT-PCR中基因名稱、引物序列、PCR程序及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度

2 結(jié)果與分析

2.1扁穗冰草轉(zhuǎn)錄因子cDNA的克隆與測(cè)序 將提取的扁穗冰草總RNA反轉(zhuǎn)錄后,用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，3個(gè)擴(kuò)增片段大小與預(yù)期大小一致(圖1)。因此，初步認(rèn)定是扁穗冰草中的目的基因片段，將其分別命名為ACcbf,ACdreb,ACmyb,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)回收，連接轉(zhuǎn)化并克隆測(cè)序。序列分別為548,862,319 bp, 測(cè)序結(jié)果如圖2所示。將這3個(gè)序列上傳GenBank，登錄號(hào)分別為：JF957078，JF957079，JF957080。3個(gè)基因片段在NCBI 網(wǎng)站上的nBlast結(jié)果表明，各基因片段的序列與相應(yīng)同源基因序列的相似度基本都能達(dá)到90%以上(表2)，因此，認(rèn)為得到的序列是目的基因。

圖1 目的基因片段擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 扁穗冰草中ACcbf,ACdreb,ACmyb基因序列

2.2不同冷脅迫程度下扁穗冰草轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的半定量RT-PCR分析 不同冷脅迫程度下各基因的半定量RT-PCR結(jié)果表明(圖3)，ACcbf基因隨冷脅迫程度的增強(qiáng)表達(dá)量增加，恢復(fù)到室溫后，表達(dá)量開(kāi)始降低。ACdreb與ACcbf基因的表達(dá)趨勢(shì)基本一致，這說(shuō)明兩者對(duì)低溫脅迫能夠產(chǎn)生響應(yīng)。而ACmyb基因在脅迫前后表達(dá)量變化不大,說(shuō)明該基因?qū)囟茸兓幻舾小?/p>

2.3不同干旱脅迫程度下扁穗冰草轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的半定量RT-PCR分析 不同干旱脅迫程度下各基因的半定量RT-PCR結(jié)果表明(圖4)，ACcbf 基因在脅迫前未表達(dá)，脅迫后表達(dá)量增加，而在復(fù)水1 d后，表達(dá)量降低，說(shuō)明該基因?qū)Ω珊得{迫能產(chǎn)生響應(yīng)。但由于整體表達(dá)量較低，認(rèn)為該基因?qū)τ诟珊抵挥幸欢ǔ潭鹊捻憫?yīng)，不敏感。ACdreb基因在脅迫后表達(dá)量增加，復(fù)水1 d后，表達(dá)量降低，說(shuō)明該基因是受到干旱脅迫調(diào)控的。而ACmyb基因出現(xiàn)了和前兩個(gè)基因一樣的趨勢(shì)，復(fù)水后仍然比對(duì)照組中表達(dá)量高，推測(cè)該基因是一種干旱應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子基因，并且其表達(dá)有一定的延續(xù)性。

綜合低溫和干旱兩種脅迫下的結(jié)果，認(rèn)為ACcbf基因是一種低溫敏感基因，同時(shí)對(duì)干旱脅迫產(chǎn)生一定的響應(yīng)，但不明顯。ACdreb基因是一種對(duì)低溫和干旱脅迫都能夠產(chǎn)生應(yīng)答的基因，推測(cè)這是該基因?qū)Ω珊岛秃涠寄軐?dǎo)致的植物脫水所產(chǎn)生的響應(yīng)。ACmyb基因?qū)Ω珊得{迫能產(chǎn)生響應(yīng)，對(duì)低溫脅迫不敏感。

表2 ACcbf，ACdreb，ACmyb與其他植物中同源基因的相似度

圖3 不同冷脅迫程度下扁穗冰草轉(zhuǎn)錄因子半定量RT-PCR

圖4 不同干旱脅迫程度下扁穗冰草轉(zhuǎn)錄因子半定量RT-PCR

3 討論

本研究首次在扁穗冰草中克隆出3個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄因子基因片段并對(duì)這3個(gè)基因在冷脅迫和干旱脅迫下的表達(dá)進(jìn)行研究，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)各基因的表達(dá)與逆境脅迫程度成正相關(guān)，這與已報(bào)道的研究結(jié)論基本一致[20-23]。由于各種逆境之間的交叉效應(yīng)對(duì)于研究的影響和植物抗逆信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的復(fù)雜性，不能簡(jiǎn)單地判斷某一基因?qū)τ谔囟婢趁{迫能產(chǎn)生特異的響應(yīng)。例如，干旱、寒冷、鹽堿都能導(dǎo)致植物脫水，因此，在冷脅迫及干旱脅迫下出現(xiàn)同樣的表達(dá)趨勢(shì)是正常的。這為試驗(yàn)結(jié)果的分析帶來(lái)了難度。為了進(jìn)一步研究該基因的表達(dá)調(diào)控模式，下一步還須通過(guò)RACE技術(shù)克隆這3個(gè)基因的全長(zhǎng)序列，尋找其CDS并進(jìn)行轉(zhuǎn)基因等功能研究，以明確其表達(dá)調(diào)控模式。

目前對(duì)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控表達(dá)的研究主要側(cè)重于對(duì)單一逆境條件的調(diào)控, 對(duì)其在不同信號(hào)途徑相互作用過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制還沒(méi)有深入的研究。在轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)中也出現(xiàn)了很多大田研究和實(shí)驗(yàn)室研究不吻合的結(jié)果[24]。因此，欲將轉(zhuǎn)錄因子應(yīng)用于作物的轉(zhuǎn)基因或者遺傳育種，對(duì)于這類基因表達(dá)過(guò)程的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及轉(zhuǎn)錄、翻譯的調(diào)控還需要進(jìn)一步的研究。本研究對(duì)扁穗冰草中的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了初步探索，為設(shè)計(jì)相應(yīng)的核酸探針、深入分析這類基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)機(jī)制進(jìn)而應(yīng)用于作物遺傳育種提供參考。

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