謝木林 趙 峰 張宏福 章世元

(1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,揚(yáng)州 225009;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193)

在家禽體外模擬消化過程的研究中,模擬消化液的制備依據(jù)與方法一直是該領(lǐng)域技術(shù)的核心[1]。由于動(dòng)物體內(nèi)消化液中酶的種類較多,而且在飼料底物水解程度的貢獻(xiàn)上也相差較大,因此,探討模擬消化液的制備方法首先需要弄清腸液中主要消化酶的總消化能力,以及其占腸液中所有消化酶總消化能力的權(quán)重。以 Boisen為代表的歐美學(xué)者在模擬腸液的制備上都是根據(jù)一定時(shí)間內(nèi)飼料的水解率達(dá)到最大時(shí)所需要的最低胰液素(酶)量來確定[2-3]。該方法完全不以動(dòng)物體內(nèi)消化液中酶的活性為依據(jù),在其操作規(guī)程中,模擬腸液的制備是將一定質(zhì)量胰液素溶于緩沖液中配制,這導(dǎo)致了不同的實(shí)驗(yàn)室間在模擬消化液的酶活性上相差很大。我國學(xué)者張子儀等[4-6]在上世紀(jì) 80年代通過將豬小腸液凍干然后再加入去離子水還原的方法制備模擬豬腸液。該方法雖然保證了模擬腸液在酶的種類與組成上與體內(nèi)一致,但不同批次的凍干粉劑在酶活上也有一定差異,仍存在模擬消化液組成難以重現(xiàn)的問題。近年來,本研究組提出了以鴨體內(nèi)空腸液主要消化酶活性為基礎(chǔ)參數(shù),以分離純化的試劑級(jí)淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶為酶源,根據(jù)這 4種消化酶活性相等的原則制備模擬消化液[7]。從設(shè)計(jì)思路看,該制備方案有望解決模擬消化技術(shù)中消化液制備的重現(xiàn)性問題。然而,在該設(shè)計(jì)方案中,4種主要消化酶的總消化能力占體內(nèi)腸液所有酶總消化能力的比重是多少?其他一些未知酶是否可以忽略?如果此 4種主要消化酶的總消化能力所占的權(quán)重比較高,那么其他未知酶發(fā)生變化后對測試結(jié)果有多大干擾?弄清這些問題對于模擬消化技術(shù)研究中解決模擬消化液的重現(xiàn)性乃至酶的同源性問題都是非常關(guān)鍵的。為此,本研究通過比較鴨腸液中 4種主要消化酶的消化能力與體內(nèi)腸液消化能力的差異、以及在其他未知酶(除 4種主要消化酶外的統(tǒng)稱)不同水平的條件下對測試結(jié)果的影響,探討鴨模擬腸液在消化酶組成上的適宜方案。

1 材料與方法

1.1 飼料原料與飼糧

選擇 4種常用飼料原料(玉米、豆粕、棉粕、麩皮)和 4種鴨飼糧(表 1)。采用四分法取樣后粉碎,過 40目篩,混合均勻后貯存于樣品瓶中,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 鴨腸液的獲取

選用健康、體重相近的 18周齡成年公北京鴨60只,在空腸中部安裝套管,整個(gè)飼養(yǎng)過程均飼喂基礎(chǔ)飼糧。術(shù)后第 31、33、35天的 09：30—10：30、13：30— 14：30、17：30—18：30用收集瓶在低溫條件下(0～4℃)收集空腸食糜,搖勻后全部轉(zhuǎn)入250 m L離心瓶中,于 4℃條件下 1 250×g離心10m in,取上清液,裝于 1 000 m L樣品瓶中,-20℃保存。共收集 3 000 m L腸液,待整個(gè)腸液收集試驗(yàn)結(jié)束后,將所有腸液混合均勻,經(jīng) 200目尼龍濾布過濾后,分成 2份,1份分裝到 6個(gè)250 m L的樣品瓶中,為鴨內(nèi)源腸液;1份經(jīng)全自動(dòng)蛋白質(zhì)透析純化系統(tǒng)(型號(hào) PFS-1,自主研制)透析去雜質(zhì)后,通過冷凍干燥機(jī)(LGJ-4,北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司)凍干成粉劑,為鴨腸液干粉劑。

表 1 試驗(yàn)原料、試驗(yàn)飼糧、鴨基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of trial ingredients,trialdiets and ducks'basal diet(air-dry basis) %

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

鴨內(nèi)源腸液,酶的組成主要為 4種消化酶(淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶)和其他酶(除4種主要酶外的酶的統(tǒng)稱,含量未知)。采用單因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì),根據(jù)腸液酶組成設(shè) 3個(gè)處理,處理間 4種主要酶的活性一致。處理 1為鴨內(nèi)源腸液,處理 2為鴨腸液干粉劑 +試劑酶,處理 3為試劑酶。每個(gè)處理設(shè)置 5個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù) 1根消化管。分別測定各處理下 4種飼料原料和 4種飼糧的干物質(zhì)和能量消化率。各處理腸液的酶組成見表2。

表 2 3種腸液酶組成及活性Tab le 2 Composition and activities of enzyme in the three intestinal fluid

1.4 模擬消化操作過程

稱取一定量的樣品(豆粕、棉籽粕和飼糧約2.000 0 g,玉米、小麥麩約 1.000 0 g,精確到0.000 2 g)于干凈的 10 m L帶塞玻璃管中;將透析袋(MD44-14,美國 V iskase公司,截留分子量為 14 000 kD)經(jīng)脫鹽脫硫處理后,洗凈裝入模擬消化器 (專利號(hào)：ZL200920105937.X);然后將稱量好的樣品無損失的轉(zhuǎn)移到裝有透析袋的模擬消化管中,再加入 20m L混勻的腸液;將消化管置于仿生消化系統(tǒng)(SDS-Ⅰ型)中,連接消化管路,點(diǎn)擊控制軟件的開始試驗(yàn)菜單,只選擇小腸模擬消化階段,設(shè)置模擬消化的溫度為 42℃,混合強(qiáng)度為180 r/min,緩沖液流速 450 m L/min,小腸消化時(shí)間為 15 h,殘留液排出時(shí)間 2 min,清洗液用量1 200 m L/次,清洗 4次;消化完畢后,取出消化管,將透析袋中未消化的殘?jiān)萌ルx子水小心完全地沖洗到已知絕干重的培養(yǎng)皿中,65℃烘干至無水痕后,再 105℃烘至絕干,稱重。

1.5 測定方法

腸液中主要消化酶活性的測定方法如下：α-淀粉酶(EC.3.2.1.1)根據(jù) Dahlqvist[8]方法以可溶性淀粉為底物測定活性;脂肪酶活性使用脂肪酶試劑盒(13258/64186/1,德國 Diasys)測定;胰蛋白酶根據(jù) W irnt[9]方法以對甲苯磺酰 -L-精氨酸乙酯(TAME,T4626,Sigma)為底物進(jìn)行活性測定;糜蛋白酶根據(jù) W irnt[10]方法以苯甲酰 -L-酪氨酸乙酯(BTEE,B6125,Sigma)為底物進(jìn)行活性測定。

干物質(zhì)、能量測定均參照 AOAC[11],能量測定采用氧彈儀(WZT-1TB,長沙奔特儀器有限公司)。

1.6 數(shù)據(jù)計(jì)算與統(tǒng)計(jì)分析

模擬消化中飼料原料及飼糧的干物質(zhì)與能量消化率按以下公式計(jì)算：

統(tǒng)計(jì)分析采用 SAS 9.0[12]的 MEANS模塊對基本統(tǒng)計(jì)量進(jìn)行分析,結(jié)果以平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用 GLM模塊對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,以 Duncan氏法對不同處理組條件下同一原料和飼糧的干物質(zhì)及能量消化率進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。其中統(tǒng)計(jì)模型為：

式中：Y為消化率,μ為總體平均數(shù),W為干物質(zhì)或能量消化率,ξ為隨機(jī)誤差項(xiàng)。

2 結(jié) 果

2.1 3種鴨腸液對 4種飼料原料的總消化能力

由表 3可知,對于玉米的消化,處理 1與處理2干物質(zhì)消化率無顯著性差異(P＞0.05),且顯著地高于處理 3(P＜0.05);玉米能量消化率兩兩處理間均有顯著性差異(P＜0.05),處理 2＞處理1＞處理 3。對于豆粕的消化,干物質(zhì)和能量消化率兩兩處理間均有顯著性差異(P＜0.05),處理2＞處理 1＞處理 3。對于棉粕的消化,處理 2干物質(zhì)消化率顯著高于處理 3(P＜0.05),其他各組間差異不顯著(P＞0.05);處理 2的能量消化率均顯著地高于其他處理(P＜0.05)。對于小麥麩的消化,兩兩處理間均呈顯著性差異(P＜0.05),處理3＞處理 2＞處理 1。

在 2種模擬腸液處理下,4種飼料原料消化率占內(nèi)源腸液消化率的權(quán)重上(即處理 2或處理 3占處理 1的比例),處理 2的 4種飼料原料的干物質(zhì)平均消化率為處理 1的 101.76%,其中小麥麩相差最大,為 103.14%,玉米相差最小,為100.09%;4種飼料原料的能量平均消化率為處理1的102.22%,其中小麥麩相差最大,為103.52%,玉米相差最小,為 100.82%。處理 3的 4種飼料原料的干物質(zhì)平均消化率為處理 1的 99.27%,其中小麥麩相差最大,為 110.85%,豆粕相差最小,為 89.38%;4種飼料原料的能量平均消化率為處理 1的 99.85%,其中小麥麩相差最大,為115.63%;豆粕相差最小,為 86.39%。

表 3 4種飼料原料在 3種體外腸液中的干物質(zhì)、能量的消化率Table 3 The digestibility of drym atter and energy of the four feed ingredients in the three intestinal fluid in vitro%

2.2 3種鴨腸液對 4種飼糧的總消化能力

由表 4可知,4種飼糧的干物質(zhì)消化率兩兩處理間均呈顯著性差異(P＜0.05),處理2＞處理1＞處理 3。處理 2和處理 1對飼糧 4的能量消化率無顯著性差異(P＞0.05),且都顯著高于處理 3(P＜0.05),其他 3種飼糧的能量消化率在兩兩處理間均呈顯著性差異(P＜0.05),變化與干物質(zhì)消化率一致,也為：處理 2＞處理 1＞處理 3。

在 2種模擬腸液處理下,4種飼糧的消化率占內(nèi)源腸液消化率的權(quán)重上(即處理 2或處理 3占處理 1的比例),處理 2對 4種飼糧的干物質(zhì)平均消化率為處理 1的 101.52%,其中飼糧 3相差最大,為 101.75%,飼糧 4相差最小,為 101.33%;4種飼糧的能量平均消化率為處理 1的 101.28%,其中飼糧 1相差最大,為 102.54%,飼糧 4相差最小,為 100.24%。處理 3對 4種飼糧的干物質(zhì)平均消化率為處理 1的 96.94%,其中飼糧 4相差最大,為 98.00%,飼糧 1相差最小,為 95.91%;4種飼糧的能量平均消化率為處理 1的 93.94%,其中飼糧 2相差最大,為 95.25%;飼糧 3相差最小,為93.23%。

表 4 4種飼糧在 3種體外腸液中的干物質(zhì)、能量的消化率Table 4 The digestibility of dry matter and energy of the four diets in the three intestinal fluid in vitro %

3 討 論

3.1 腸液消化酶組成及與飼料養(yǎng)分消化的關(guān)系

食糜在小腸中消化所處的主要介質(zhì)是腸液,其消化酶一部分來源于胰腺分泌的酶原經(jīng)修飾活化后所形成的各種消化酶,另一部分來源于腸腺的分泌。目前可通過有效方法檢測并了解其酶學(xué)基本特性的消化酶約 19種[13]。腸液中各種消化酶的組成比例仍鮮見報(bào)道,已知的是雞胰腺中淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶所占比例分別占胰液總蛋白含量的 28.9%、10.0%、20.0%[14]。由此可見,家禽腸道內(nèi)這 4種消化酶是最為主要的消化酶。從分泌量和水解能力看,鴨空腸液中淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶的每小時(shí)分泌量分別為 7 235.74、1 780.43、811.43、20.30 U,可水解140 g淀粉、19.9 g蛋白質(zhì)、0.3 g脂肪[15]。從常用飼糧的有機(jī)物組成看,淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪 3者含量的總和占有機(jī)物總量的 80%～90%或更多,因此,根據(jù)以上數(shù)據(jù)推算,鴨體內(nèi)這 4種消化酶的分泌及水解活性完全可以水解飼料中絕大多數(shù)有機(jī)物。本試驗(yàn)條件下,以淀粉酶,胰蛋白酶,糜蛋白酶和脂肪酶組成的模擬消化液對 4種常用飼料原料、4種飼糧的干物質(zhì)及能量的消化率與內(nèi)源腸液的相應(yīng)消化率都存在差異,部分差異達(dá)到顯著性水平,這可能與本分析測試方法的重復(fù)性較高,重復(fù)內(nèi)測定的變異遠(yuǎn)低于飼料或飼糧間的變異所致[16]。但從 4種消化酶的總消化能力占內(nèi)源腸液所有酶總消化能力的權(quán)重看,飼料原料達(dá)到 86%以上,飼糧達(dá)到 93%以上。由此可見,基于本體外模擬消化條件下,4種主要消化酶的總消化能力為腸液中全消化酶總消化能力 86%以上,因此,嚴(yán)格控制腸液中 4種最主要消化酶的活性是保證每批模擬腸液總消化能力可保持相對一致的關(guān)鍵。

3.2 鴨模擬腸液制備方案的探討

在模擬消化技術(shù)的研究中,模擬消化液的制備與模擬消化工具的標(biāo)準(zhǔn)化一直是該領(lǐng)域的核心,也是創(chuàng)新的關(guān)鍵點(diǎn)。長期以來,模擬消化液的制備依據(jù)與方法一直被學(xué)術(shù)界所忽視。目前國際上仍普遍采用丹麥學(xué)者 Boisen提出的以一定質(zhì)量百分比濃度的豬胰液素溶液模擬家禽的小腸消化液[2-3]。以此為基礎(chǔ)制備的模擬消化液既在酶的來源上與家禽內(nèi)源酶不同源,也在活性上存在較大差異。為此,本研究組在成功建立了家禽腸道食糜的連續(xù)采集方法[14],可大量獲得一定純度的小腸混合酶的基礎(chǔ)上,又按同源性與活性接近的原則提出了以鴨小腸液純化酶粉劑為主體,通過調(diào)節(jié) 4種主要消化酶的活性與體內(nèi)腸液的活性一致的原則制備鴨模擬小腸液。從本試驗(yàn)的結(jié)果看,4種主要消化酶的總消化能力已占體內(nèi)腸液所有酶總消化能力 86.39%以上,其他未知酶所代表的水解生物學(xué)信息相對較少。由于鴨腸液干粉劑尚含有一部分未知酶,那么與內(nèi)源腸液相比,未知酶的含量發(fā)生變化后對測試結(jié)果是否有較大干擾,是這種模擬小腸液制備方法是否可行的關(guān)鍵問題。在本試驗(yàn)中,以鴨腸液干粉劑 +試劑酶制備的模擬小腸液水解 4種飼料原料和 4種飼糧的消化能力為鴨內(nèi)源腸液的 100.09%～103.52%。這表明,未知酶的水平對測試結(jié)果的干擾很少,平均值為1.72%,可以忽略不計(jì)。而且這種方法制備的模擬小腸液與鴨體內(nèi)腸液的消化能力非常接近。

4 結(jié) 論

①在鴨空腸液中,淀粉酶,胰蛋白酶,糜蛋白酶和脂肪酶 4種主要酶的消化能力占腸液所有酶消化能力的比例 ＞86.39%,其中其他未知酶發(fā)生改變后對測試結(jié)果的干擾為 1.72%。

②以鴨腸液干粉劑為主體,采用試劑酶調(diào)節(jié)4種主要消化酶活性與內(nèi)源腸液活性等同制備鴨模擬小腸液,是比較理想的制備方法。

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