鄭國香，陳忠林，鄭文玲，關(guān)正軍，吳憶寧，任南琪

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)市政環(huán)境工程學(xué)院，150090哈爾濱，rnq@hit.edu.cn;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院，150030哈爾濱)

擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)是結(jié)合 RFLP和RAPD優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項(xiàng)技術(shù).基于其可靠性和PCR技術(shù)的高效性，且具有快速、靈敏、穩(wěn)定、所需DNA量少、多態(tài)性檢出率高、重復(fù)性好、可以在不知道基因組序列特點(diǎn)的情況下進(jìn)行研究等特點(diǎn)，被認(rèn)為是一種十分理想的、有效的、先進(jìn)的分子標(biāo)記方法，現(xiàn)已廣泛用于遺傳圖譜構(gòu)建［1－2］、遺傳多樣性研究［3－5］、基因定位及品質(zhì)鑒定［6－7］等方面.利用AFLP分子標(biāo)記的方法探討產(chǎn)氫突變菌株和野生菌株的基因組DNA之間的遺傳多態(tài)性差異，將為更深入地研究產(chǎn)氫突變菌株的突變機(jī)理提供重要的信息基礎(chǔ).針對(duì)哈爾濱產(chǎn)乙醇菌桿菌屬的分子標(biāo)記研究還未見有報(bào)道，本研究以發(fā)酵產(chǎn)氫細(xì)菌作為研究對(duì)象，建立和優(yōu)化適合于哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌屬基因組AFLP分析的技術(shù)體系，為進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)氫細(xì)菌的遺傳代謝機(jī)理的深入研究提供重要的技術(shù)支撐和信息基礎(chǔ).

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株和培養(yǎng)條件

本實(shí)驗(yàn)所用的出發(fā)菌株分離于CSTR生物制氫反應(yīng)器的活性污泥，為乙醇型厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫細(xì)菌，哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌Ethanoligenens harbinense ZGX4，以其為出發(fā)菌株經(jīng)過誘變篩選獲得突變株Ethanoligenen harbinenseYR－3，以上菌株由哈爾濱工業(yè)大學(xué)市政環(huán)境生物技術(shù)中心提供.

1.2 微生物的保存、激活及厭氧培養(yǎng)條件

［8］方法進(jìn)行.

1.3 DNA的提取

將1 mL已經(jīng)預(yù)先活化的菌液接入10 mL的RZL－2培養(yǎng)基中，37°C進(jìn)行厭氧過夜培養(yǎng)，然后將2 mL的接種液轉(zhuǎn)接入裝有50 mL RZL－2培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，在37°C培養(yǎng)24～28 h.菌液的DNA提取利用華舜細(xì)菌DNA提取試劑盒，提取的DNA用0.8%瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測，并用蛋白質(zhì)核酸分析儀(Beckman Coultor DU800)檢測DNA的質(zhì)量和純度.

1.4 AFLP指紋分析體系的優(yōu)化

1.4.1 酶切與連接

1)酶切:37℃下，采用EcoRI和MseI兩種酶對(duì)細(xì)菌DNA的全基因組進(jìn)行酶切.

2)純化酶切樣品:將1/10體積的醋酸鈉和2.5體積的冰醋酸加入酶切樣品，－20℃條件下保存2 h;然后在4℃，20 000 r/min離心15 min，棄上清液，加70%乙醇溶解沉淀，20 000 r/min離心15 min，棄上清液，干燥，30 μL TE液溶解，置于－20°C下保存.

3)接頭的連接:利用T4 DNA酶連接DNA酶切片段和接頭.(酶切+接頭)混合樣品分別稀釋10、20和30倍，做預(yù)擴(kuò)增的模板.

1.4.2 預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)

94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸80 s.取4 μL樣在0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，樣品稀釋10、20和30倍，做選擇性擴(kuò)增的模板.

1.4.3 選擇性擴(kuò)增反應(yīng)

采用選擇性引物對(duì)進(jìn)行特異性選擇擴(kuò)增.程序:30個(gè)循環(huán)，94℃30 s，65℃→55℃30 s，72℃80 s退火溫度每個(gè)循環(huán)降0.3℃.取PCR樣品3 μL進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測.

2 結(jié)果與討論

擴(kuò)增片段長度多態(tài)性分子標(biāo)記(AFLP)具有在一次實(shí)驗(yàn)中可同時(shí)觀測大量限制性片段的優(yōu)點(diǎn)，是目前最有效的分子標(biāo)記技術(shù).AFLP反應(yīng)程序中模板DNA質(zhì)量及酶切片段擴(kuò)增反應(yīng)的條件是否恰當(dāng)都將影響最終結(jié)果的分析.因此，利用產(chǎn)氫野生菌株和突變菌株作為研究對(duì)象，探討和優(yōu)化AFLP程序中的試驗(yàn)條件將為增加產(chǎn)氫發(fā)酵細(xì)菌的遺傳多態(tài)性和高效性提供重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

2.1 模板DNA的質(zhì)量和純度

AFLP對(duì)樣本的DNA純度要求較苛刻，基因組DNA的純度直接影響AFLP后續(xù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果.使用細(xì)菌DNA抽提試劑盒對(duì)產(chǎn)氫野生菌株ZGX4和突變菌株YR－3進(jìn)行了DNA提取.利用紫外分光法測定DNA的質(zhì)量和純度，結(jié)果表明，DNA質(zhì)量在50～100 ng時(shí)，當(dāng) OD260/OD280小于1.8時(shí)，DNA樣品中存在蛋白質(zhì)污染現(xiàn)象，見圖1的泳道3和4，同時(shí)出現(xiàn)明顯的彌散現(xiàn)象，即DNA降解跡象.而OD260/OD280大于1.9的DNA樣品，存在明顯的RNA污染和DNA降解脫尾現(xiàn)象，如圖1中的泳道5和6所示;選用OD260/OD280在1.8～1.9之間的DNA樣本，經(jīng)瓊脂糖電泳檢測結(jié)果(圖1的泳道1和2)顯示，產(chǎn)氫菌株的DNA帶型整齊，無RNA污染和DNA降解，完全符合AFLP試驗(yàn)要求，進(jìn)行PCR擴(kuò)增可以獲得穩(wěn)定、清晰的帶譜，表明DNA質(zhì)量符合AFLP后續(xù)的試驗(yàn)操作要求.

2.2 基因組DNA的酶切和連接

通常情況下，選用單一限制性內(nèi)切酶對(duì)DNA進(jìn)行酶切，產(chǎn)生的DNA片段較少，體現(xiàn)出來的DNA片段多態(tài)性效果較差［4］.AFLP所使用的限制性內(nèi)切酶一般采用兩種，一種是內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)是6個(gè)堿基，例如EcoRI、PstI和SacI;另一種是4堿基內(nèi)切酶，如MseI、TaqI和SseI.選用兩種酶同時(shí)酶切可以產(chǎn)生比較小的酶切片段，經(jīng)過PCR反應(yīng)擴(kuò)增出的產(chǎn)物范圍可在100～2 000 bp之間.本實(shí)驗(yàn)選用EcoRI/MseI作為產(chǎn)氫細(xì)菌YR－3和ZGX4基因組DNA的限制性內(nèi)切酶.

圖1 產(chǎn)氫細(xì)菌基因組DNA瓊脂糖電泳圖

AFLP片段的多態(tài)性及豐富性是由酶切的多態(tài)性和豐富性決定的，因此，酶切質(zhì)量是決定AFLP成功與否的關(guān)鍵前提條件之一.酶用量過大，首先是造成浪費(fèi)，MseI酶是稀有酶，價(jià)格昂貴，用量過多還會(huì)在相同時(shí)間出現(xiàn)酶切過頭的現(xiàn)象.用量過少，所需要的時(shí)間過長，而且常常會(huì)導(dǎo)致酶切不完全.因此，準(zhǔn)確把握酶的用量及酶切時(shí)間十分重要.

2.2.1 酶切用量

大量實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明，AFLP的兩種限制性內(nèi)切酶的總量不能超過反應(yīng)體積的1/10［9］，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)發(fā)酵產(chǎn)氫細(xì)菌基因組DNA材料，采用EcoRI (20 U/μL)/MseI(10 U/μL)做雙酶切，設(shè)定其用量組合分別為 1，EcoRI(0.5μL)/MseI (0.2 μL);2，EcoRI(1.0 μL)/MseI(0.4 μL); 3，EcoRI(1.5 μL)/MseI(0.6 μL);4，EcoRI (2.0 μL)/MseI(0.7 μL);5，EcoRI(2.5 μL)/MseI (1 μL);6，EcoRI(3.0 μL)/MseI(1.5 μL)，DNA質(zhì)量為60 ng，時(shí)間為3 h.利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，具體的酶切用量對(duì)產(chǎn)氫細(xì)菌基因組DNA產(chǎn)生的酶切效果見圖2所示.

試驗(yàn)結(jié)果表明，利用EcoRI(0.5 μL)/MseI (0.2 μL)對(duì)哈爾濱產(chǎn)乙醇發(fā)酵細(xì)菌的DNA進(jìn)行酶切之后效果很差，如圖2的泳道1，DNA酶切片段多分布在800～2 000 bp，基本沒有切開;利用EcoRI (1.0 μL)/MseI(0.4 μL)和EcoRI(1.5 μL)/MseI (0.6 μL)組合的酶切效果表明，DNA酶切片段分布的范圍在500～2 000 bp，如圖2的泳道2和3所示;而通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，利用 EcoRI(2.0 μL)/MseI (0.7 μL)和EcoRI(2.5 μL)/MseI(1 μL)兩個(gè)酶切組合的試驗(yàn)結(jié)果顯示，在100～2 000 bp都有DNA酶切片段出現(xiàn)，見圖2的泳道4和5，酶切用量都比較理想，鑒于經(jīng)濟(jì)性考慮，在相同酶切效果的前提下，選擇EcoRI(2.0 μL)/MseI(0.7 μL)為哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌屬的最佳酶切用量;當(dāng)繼續(xù)增加酶切用量，即EcoRI(3.0 μL)/MseI(1.5 μL)時(shí)，如圖2的泳道6所示，出現(xiàn)了小于100 bp的DNA酶切片段.可見，限制性內(nèi)切酶用量太少，導(dǎo)致酶切不完全，基因組多態(tài)性不豐富.酶用量過多，既造成了浪費(fèi)，又容易出現(xiàn)酶切過頭現(xiàn)象，產(chǎn)生低于100 bp的DNA片段，導(dǎo)致接頭接不上，PCR反應(yīng)失?。?0］.

圖2 產(chǎn)氫細(xì)菌基因組DNA不同酶切用量的酶切效果

2.2.2 酶切時(shí)間

在確定最佳酶切組合和酶切用量后，選擇最恰當(dāng)?shù)拿盖袝r(shí)間也是影響酶切成敗的必要條件.如果酶切時(shí)間過短，酶切不完全，酶切片段不能覆蓋整個(gè)基因組，影響PCR擴(kuò)增的多態(tài)性［11］.從圖3可以看出，酶切3 h的效果比較理想(泳道3)，酶切片段在100～2 000 bp之間都有分布.而泳道1和2的酶切時(shí)間相對(duì)較短，分別為1 h和2 h，DNA酶切不充分.泳道4(4 h)和5(5 h)顯示酶切時(shí)間過長，出現(xiàn)100 bp以下的片段，酶切過頭將使接頭連接不上，導(dǎo)致PCR反應(yīng)無結(jié)果.因此，通過酶切時(shí)間的試驗(yàn)確定利用EcoRI(2.0 μL)/MseI(0.7 μL)酶切哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌屬的最佳時(shí)間為3 h.將MseI和EcoRI接頭配制成終質(zhì)量濃度為100 μmol/L，T4 DNA酶連接DNA酶切片段和接頭，連接時(shí)間過夜效果最好.

2.3 預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)條件的選擇

AFLP反應(yīng)程序中另一重要的環(huán)節(jié)就是酶切連接產(chǎn)物的預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)，該反應(yīng)起著呈上啟下的作用，既反映酶切連接效果的好壞，又決定后續(xù)選擇性擴(kuò)增反應(yīng)成功與否.預(yù)擴(kuò)增的目的是為選擇性擴(kuò)增提供大量的模板，同時(shí)對(duì)模板起到選擇性純化的作用，以使選擇性擴(kuò)增能產(chǎn)生清晰、穩(wěn)定、易重復(fù)的條帶［12－13］.本試驗(yàn)酶切和接頭的混合樣本分別稀釋10倍(帶1和4)、20倍(帶2和5)和30(帶3和6)倍進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增.圖4顯示，樣品稀釋的倍數(shù)對(duì)預(yù)擴(kuò)增影響的效果不是很明顯，3個(gè)梯度的稀釋效果都較好，擴(kuò)增信號(hào)強(qiáng)，相對(duì)分子質(zhì)量大小在200～1 000 bp之間出現(xiàn)連續(xù)、均勻的彌散帶，表明預(yù)擴(kuò)增效果較好，稀釋后可為選擇性擴(kuò)增反應(yīng)提供理想的模板.

圖3 產(chǎn)氫細(xì)菌基因組DNA不同酶切時(shí)間的酶切效果

圖4 預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)圖譜

2.4 選擇性引物組合的選擇

選擇性引物的篩選很重要，不同的引物組合擴(kuò)增效果明顯不同.而且不同的微生物基因組DNA，同一引物組的擴(kuò)增效果也大不相同.選擇性引物中3＇末端選擇性核苷酸數(shù)目的多少確定了AFLP擴(kuò)增產(chǎn)物的多少，一般選擇性堿基數(shù)目越少，擴(kuò)增的條帶數(shù)越多;選擇性堿基數(shù)目越多，擴(kuò)增的條帶數(shù)越少.條帶太多，不利于分辨;而條帶太少，則不利于多態(tài)性的檢出［14］.因此，根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)材料即基因組DNA的大小確定引物末端所需的選擇性核苷酸數(shù)目.

哈爾濱產(chǎn)乙醇厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫細(xì)菌的基因組較小，所以，采用的擴(kuò)增策略是在兩種限制性內(nèi)切酶的核心序列及識(shí)別序列基礎(chǔ)上分別在3＇增加一個(gè)選擇性堿基(A，C，G，T)進(jìn)行隨機(jī)組合，表1顯示的是擴(kuò)增產(chǎn)氫野生菌株ZGX4和突變菌株YR－3的選擇性引物的序列.選擇稀釋10倍的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)16個(gè)限制性酶切引物組合擴(kuò)增出的DNA片段多態(tài)性進(jìn)行檢測.每一個(gè)引物組合的試驗(yàn)對(duì)象為野生產(chǎn)氫菌株ZGX4(左側(cè))和突變菌株YR－3(右側(cè))，結(jié)果表明，不同引物組合的選擇性擴(kuò)增DNA多態(tài)性分布差異較為明顯，具體見圖5所示.其中以1 (EcoRI－A/MseI－A)、2(EcoRI－A/MseI－C)、5(EcoRI－C/MseI－A)及6(EcoRI－C/MseIC)為選擇性擴(kuò)增引物組合擴(kuò)增酶切片段的PCR效果表現(xiàn)出的差異性不明顯，產(chǎn)氫菌株ZGX4和YR－3的DNA酶切片段的PCR產(chǎn)物集中分布在100～500 bp之間，DNA擴(kuò)增片段太小，表明基因組DNA片段的多態(tài)性豐度不夠，不能很好地表現(xiàn)出基因組酶切片段的多態(tài)性差異，因此，本試驗(yàn)可以確定(EcoRI－A/MseI－A)、(EcoRI－A/MseIC)、(EcoRI－C/MseI－A)及(EcoRI－C/MseIC)引物組合不適合作為哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌屬細(xì)菌ZGX4和YR－3的選擇性擴(kuò)增引物.相對(duì)而言，利用引物組合4(EcoRI－A/MseI－G)、9(EcoRIG/MseI－A)、10(EcoRI－G/MseI－C)、13 (EcoRI－T/MseI－A)、14(EcoRI－T/MseI－C)、15(EcoRI－T/MseI－G)、16(EcoRI－T/MseIT)對(duì)產(chǎn)氫野生菌株ZGX4和突變菌株YR－3的酶切片段進(jìn)行PCR的擴(kuò)增結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段在100～1 800 bp之間呈現(xiàn)出明顯的特異性及多態(tài)性分布.而引物3(EcoRI－A/MseI－G)、7(EcoRIC/MseI－G)、8(EcoRI－C/MseI－T)和 12 (EcoRI－G/MseI－T)組合的DNA擴(kuò)增片段在瓊脂糖凝膠中表現(xiàn)相似的的分布狀態(tài)，野生菌株和突變菌株的DNA酶切片段的擴(kuò)增產(chǎn)物所呈現(xiàn)出的特異性不強(qiáng)，差異微小，因此，不適合作為哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌屬AFLP檢測技術(shù)的選擇性引物組合.

①參見北京市第一中級(jí)人民法院[2001]一中知初字第185號(hào)“白秀娥與國家郵政局、國家郵政局郵票印制局”一案。

表1 選擇性引物的序列

圖5 不同引物組合擴(kuò)增產(chǎn)氫細(xì)菌ZGX4和YR－3的PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳中的多態(tài)性

3 結(jié)論

1)AFLP的反應(yīng)體系為 20 μL，利用EcoRI/MseI作為產(chǎn)氫細(xì)菌YR－3和ZGX4基因組DNA的限制性內(nèi)切酶，最適酶切基因組DNA質(zhì)量和純度(OD260/OD280比值)范圍分別為50～100 ng和1.8～1.9.

2)最佳酶切用量和酶切時(shí)間分別為EcoRI (2.0 μL)/MseI(0.7 μL)和3 h;預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋10倍為模板，以引物組合EcoRI－A/MseIG、EcoRI－G/MseI－A、EcoRI－G/MseI－C、EcoRI－T/MseI－A、EcoRI－T/MseI－C、EcoRI－T/MseI－G和EcoRI－T/MseI－T進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，效果較為理想，可以獲得較為明顯的DNA多態(tài)性分布差異.

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