孫曉君，劉曉慧，秦 智，馮玉杰

(1.哈爾濱理工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，150040哈爾濱，sunxjhit@yahoo.com.cn; 2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)城市水資源與水環(huán)境國家重點實驗室，150090哈爾濱)

殼聚糖(β－(1，4)－2－氨基－2－脫氧－D－葡聚糖)是甲殼素脫乙酰化反應(yīng)生成的產(chǎn)物，它是一種含有氨基多糖的高分子化合物，無毒且具有獨特的生物兼容性、顯著的蛋白質(zhì)親和性及易與金屬離子螯合等優(yōu)點，在藥物控制釋放、細(xì)胞培養(yǎng)及微反應(yīng)器、人體器官和基因運載工具以及分離介質(zhì)等多個領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景［1－3］.但因分子內(nèi)和分子間氫鍵的作用，殼聚糖水溶性很差，限制了其進(jìn)一步應(yīng)用［4－5］.對殼聚糖進(jìn)行化學(xué)改性，引入功能性基團(tuán)，進(jìn)而增加其溶解性和功能性，是殼聚糖化學(xué)研究的熱點領(lǐng)域之一.Li等［6］采用微波輻照法制備了可溶于水的低分子量殼聚糖.Avadi等［7］為了增加殼聚糖的溶解性能，通過改進(jìn)兩步法制備出了具有抗菌作用的N－二乙基－甲基殼聚糖.Park等［8］制備了殼聚糖與Carbopol的高分子聚合物IPC.該聚合物有望成為藥物釋放的基礎(chǔ)材料，并且有良好pH依賴性.本文首次提出了將檸檬酸引入殼聚糖并成功制備出檸檬酸化殼聚糖.檸檬酸是一種含羥基的多元有機酸，將其引入殼聚糖中，會大大提高殼聚糖產(chǎn)物的溶解性能，對拓展殼聚糖的應(yīng)用領(lǐng)域具有重要意義.

1 實驗

1.1 試劑和儀器

殼聚糖(浙江玉環(huán)縣化工廠，脫乙酰度99.56%，摩爾質(zhì)量為 160.09 g/mol);檸檬酸(AR);無水乙醇(AR);PHS－3C型酸度計;烏式黏度計(D=0.5～0.6 cm);80－2型離心機;紅外光譜儀(Nicolet Avator370型);GZX－9070MBE型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱.

1.2 檸檬酸化殼聚糖的反應(yīng)原理

殼聚糖和檸檬酸進(jìn)行羧基化反應(yīng)，主要發(fā)生在氨基上，反應(yīng)式如下:

1.3 檸檬酸化殼聚糖的制備

稱取一定量的殼聚糖，按一定摩爾配比加入檸檬酸，在乙醇介質(zhì)中，于一定溫度下攪拌進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物離心提純，再用蒸餾水溶解、無水乙醇洗滌3次，于55℃恒溫干燥至恒重.

1.4 取代度測定

準(zhǔn)確稱取0.200 g已干燥的反應(yīng)產(chǎn)物于錐形瓶中，用移液管量取25 mL 0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻.以酚酞為指示劑，用0.1 mol/L HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定過量的NaOH，至微紅色消失30 s內(nèi)不再現(xiàn)，即為終點.檸檬酸化殼聚糖產(chǎn)物的取代度［9］

式中:0.203為與1 mol NaOH反應(yīng)后的每個乙酰氨基葡萄糖殘基的毫克數(shù);0.193為與1 mol NaOH反應(yīng)的毫克數(shù);A為取代基的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%);n為取代因子;c1為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度(mol/L);V1為消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL);c2為HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度(mol/ L);V2為消耗HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL);W為試樣的質(zhì)量(g).

1.5 溶解性的測定

用移液管取100 mL蒸餾水注入錐形瓶中，準(zhǔn)確稱取定量的檸檬酸化殼聚糖，逐漸加入錐形瓶中，加熱至完全溶解，記下產(chǎn)品的溶解溫度［10］.

1.6 粘均分子量的測定

稱量已干燥的檸檬酸化殼聚糖樣品溶于0.1 mol/L氯化鈉水溶液中，用烏氏黏度計在(30±0.5)℃下測得其特性粘數(shù)［η］，平行測定3次，用方程［η］=6.58×10－3M0.88計算得到粘均分子量［11］.

1.7 檸檬酸化殼聚糖的紅外表征

將殼聚糖和最佳工藝條件下制備的檸檬酸化殼聚糖研細(xì)，KBr壓片，在4 000～400 cm－1進(jìn)行紅外波譜掃描.

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳工藝參數(shù)的確定

選取檸檬酸和殼聚糖的投料摩爾比、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度為主要影響因素，分別考察各種因素對產(chǎn)物取代度的影響，實驗結(jié)果如圖1～3所示.

圖1是在20℃下反應(yīng)16 h，檸檬酸和殼聚糖投料摩爾比對產(chǎn)品取代度的影響.可以看出，隨著檸檬酸和殼聚糖投料摩爾比的增加，檸檬酸化殼聚糖的取代度逐步增大.這是因為殼聚糖分子中的活性中心一定，而隨著檸檬酸用量增加，此活性中心與檸檬酸碰撞發(fā)生反應(yīng)的幾率增加，這說明適量增加檸檬酸的量有利于殼聚糖進(jìn)行羧基化反應(yīng).實驗中發(fā)現(xiàn)當(dāng)檸檬酸和殼聚糖投料摩爾比小于0.5時，反應(yīng)不徹底，產(chǎn)品不能全部溶解于水;當(dāng)檸檬酸和殼聚糖投料摩爾比大于0.5以后，隨著檸檬酸用量的增大，取代度最初增加較快而后增加趨勢變緩并逐漸趨于平衡.

圖2是在檸檬酸和殼聚糖投料摩爾比為1.5∶1、反應(yīng)溫度為20℃條件下反應(yīng)時間對取代度的影響.可以看出，在反應(yīng)的前4 h，產(chǎn)物的取代度提高較快，之后產(chǎn)物的取代度有所下降.這是因為開始時反應(yīng)進(jìn)行得不完全，故取代度較低;隨著反應(yīng)時間的延長，取代度逐漸增加;但當(dāng)產(chǎn)物的取代度達(dá)到一定值后，取代基之間會產(chǎn)生位阻效應(yīng)，阻礙檸檬酸的進(jìn)一步取代;同時，隨著取代度的增加，取代基自身的水解等副反應(yīng)也會發(fā)生，故在反應(yīng)4 h后，取代度又有所下降.

圖1 檸檬酸和殼聚糖投料摩爾比對取代度的影響

圖2 反應(yīng)時間對取代度的影響

圖3 反應(yīng)溫度對取代度的影響

圖3是反應(yīng)溫度對產(chǎn)品取代度的影響.可以看出，隨著反應(yīng)溫度的升高，檸檬酸化殼聚糖的取代度逐步增大，但當(dāng)溫度高于60℃時，取代度開始下降.這是因為檸檬酸基取代反應(yīng)為親電取代反應(yīng)，溫度的升高促進(jìn)正碳離子的進(jìn)攻，使活性中心發(fā)生反應(yīng)的幾率提高，故使取代度隨溫度升高而增加;但溫度過高會加劇殼聚糖在弱堿性介質(zhì)中的降解作用，增加副反應(yīng)和物料的黏附，使產(chǎn)物的取代度下降.綜合以上因素并結(jié)合后續(xù)改性殼聚糖水溶性實驗(表1)確定制備檸檬酸化殼聚糖的最佳工藝參數(shù)為:反應(yīng)溫度為20℃，檸檬酸和殼聚糖摩爾比為2∶1，反應(yīng)時間為0.5 h.

2.2 產(chǎn)品性能測定

2.2.1 取代度和粘均分子量的測定

按照最佳工藝參數(shù):θ=20℃，檸檬酸和殼聚糖投料摩爾比為2.0，t=0.5 h，制備檸檬酸化殼聚糖.按照1.4的方法測其取代度，平行測3次取平均值，測得檸檬酸化殼聚糖取代基的質(zhì)量分?jǐn)?shù)A=3.78，代入計算，)取代度DS=1.45.按照1.6的方法測產(chǎn)品的粘均分子量，平行測3次取平均值，測得檸檬酸化殼聚糖的特性粘數(shù)［η］=451.7 mL/g，代入［η］= 6.58×10－3M0.88計算，產(chǎn)品的粘均分子量為28.5萬.

2.2.2 溶解性的測定

準(zhǔn)確稱取殼聚糖和不同取代度的檸檬酸化殼聚糖各0.030 g，分別溶于10 mL蒸餾水中，加熱并隨時記錄溶液的溫度，記下檸檬酸化殼聚糖完全溶解時的溫度，考察不同的取代度對檸檬酸化殼聚糖溶解性的影響，并平行做殼聚糖的溶解性對照實驗，結(jié)果見表1.

表1 檸檬酸化殼聚糖和殼聚糖溶解性對照

從表1可以看出，檸檬酸化殼聚糖打破了殼聚糖不溶于水的限制，檸檬酸化殼聚糖完全溶解時所需的溫度隨取代度變化.這是由于當(dāng)取代度較低時，取代度的增加會使殼聚糖產(chǎn)物分子中的親水基團(tuán)—COOH增多，進(jìn)而會使檸檬酸化殼聚糖的溶解性能也隨之增大.但當(dāng)取代度大于1.4時，隨著檸檬酸化殼聚糖取代度的逐步增大，接到殼聚糖上的親水基團(tuán)—COOH會發(fā)生聚合，形成二聚體，使其溶解性能又開始下降，進(jìn)而導(dǎo)致其溶解于水的溫度又逐漸升高.本實驗結(jié)果表明，取代度在1.4左右的檸檬酸化殼聚糖是溶解性較好的殼聚糖改性產(chǎn)品.

2.2.3 紅外表征

圖4為檸檬酸化殼聚糖與殼聚糖的FTIR譜圖，可以看出，檸檬酸化殼聚糖在3 400 cm－1處出現(xiàn)的強吸收是產(chǎn)物形成氫鍵后的—OH和—NH的伸縮振動吸收峰;在3 200～2 500 cm－1區(qū)出現(xiàn)的寬而散的吸收峰是形成氫鍵后羧基中O—H的伸縮振動峰，1 723 cm－1的較強吸收峰為羧基中伸縮振動吸收峰，這兩組峰表明檸檬酸已接枝到殼聚糖上;1 577 cm－1附近較強、較寬的吸收峰是酰胺Ⅰ峰、II峰，1 394 cm－1處為酰胺III吸收峰，這3組峰的出現(xiàn)說明是N上取代，即殼聚糖中氨基與檸檬酸的羧基反應(yīng)生成了酰胺.

圖4 檸檬酸化殼聚糖與殼聚糖的紅外譜圖

3 結(jié)論

1)以殼聚糖和檸檬酸為原料首次在溫和的條件下合成了水溶性較好的改性殼聚糖產(chǎn)物.

2)紅外光譜測試結(jié)果證明所合成的產(chǎn)物為檸檬酸化殼聚糖.

3)制備檸檬酸化殼聚糖的適宜工藝參數(shù)為:檸檬酸/殼聚糖投料摩爾比為2∶1，反應(yīng)溫度為20℃，反應(yīng)時間為0.5 h.

4)在殼聚糖分子上引入檸檬酸，其水溶性得到很大程度的改善，有助于擴(kuò)大殼聚糖產(chǎn)品的應(yīng)用范圍.

［1］WANG C，SUN S L，XIAO H N，et al.Release model of water－soluble chitosan nanoparticles for protein delivery［J］.Agricultural Science and Technology，2009，10(3):144－147.

［2］HUANG G L，YANG C，ZHANG K，et al.Adsorptive removal of copper ions from aqueous solution using cross－linked magnetic chitosan beads［J］.Separation Science and Engineering，2009，17(6):960－966.

［3］ZHANG M，REN H X.Structural modification and application of chitosan［J］.Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research，2007，11(48):9817－9820.

［4］蔣挺大.殼聚糖［M］.2版.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2007.

［5］車小瓊，孫慶申，趙凱.甲殼素和殼聚糖作為天然生物高分子材料的研究進(jìn)展［J］.高分子通報，2008 (2):45－49.

［6］LI P C，XING R，LIU S，et al.Low molecular weight chitosan oligosaccharides and it separation method［J］.Poultry Science Association，2007(86):1107－1114.

［7］AVADI R M，MAHDAVINIA G，SADEGHI A M，et al. Synthesis and characterization of N－diethyl methyl chitosan［J］.Iranian Polymer Journal，2004，13(5):431－436.

［8］PARK S H，CHUN M K，CHOI H K.Preparation of an extended－release matrix tablet using chitosan/carbopol interpolymer complex［J］.International Journal of Pharmaceutics，2008(1):39－44.

［9］吳友吉，宋慶平，李慶海.高取代度羧甲基殼聚糖的制備［J］.合成化學(xué)，2006，14(5):506－509.

［10］SHAW M T.Studies of polymer－polymer solubility using a two－dimensional solubility parameter approach［J］.Journal of Applied Polymer Science，2003，18 (2):449－472.

［11］陳魯生，周武，姜云生.殼聚糖粘均分子量的測定［J］.化學(xué)通報，1996(4):57－58.