杜 旭

(天津市藥品檢驗(yàn)所，天津 300070)

高效毛細(xì)管電泳(high performance capillary electrophoresis，HPCE)是上世紀(jì)80年代以來迅速發(fā)展的一種新型分離方法，具有高靈敏度、高分辨率、高速度、樣品用量低、成本低的優(yōu)點(diǎn)[1]。中藥品種繁多，藥材產(chǎn)地廣泛，成分復(fù)雜。高效毛細(xì)管電泳技術(shù)在中藥的定性定量檢測方面有重要的實(shí)用價(jià)值和非常好的應(yīng)用前景[2]。近年來，HPCE在中醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用得到了迅速開展，現(xiàn)將HPCE在中醫(yī)藥領(lǐng)域的最新進(jìn)展和應(yīng)用研究綜述如下。

1 中藥材鑒別中的應(yīng)用

1.1中藥及其炮制品鑒定中的應(yīng)用 古今等[3]采用高效毛細(xì)管電泳法對冬蟲夏草、亞香棒冬蟲夏草、地蠶進(jìn)行鑒別，區(qū)分其偽品，效果良好。劉萍等[4]用高效毛細(xì)管電泳法鑒別熊膽與猴膽和雞膽汁，有極高的市場價(jià)值。

1.2產(chǎn)地差異 白術(shù)為菊科植物白術(shù)的干燥根莖。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，在我國有著悠久的藥用歷史，具有補(bǔ)脾、益胃、燥濕、和中的功效。白術(shù)傳統(tǒng)主產(chǎn)于浙江盤安、新昌、嵊縣及安徽歙縣、黃山、寧國一帶。目前全國20多個(gè)省(自治區(qū))多有栽培，少有野生。左堅(jiān)等[5]通過建立白術(shù)的高效毛細(xì)管電泳指紋圖譜，對不同產(chǎn)地的白術(shù)藥材品種質(zhì)量進(jìn)行了比較，以建立白術(shù)優(yōu)良品種的規(guī)?；N植基地。

2 中藥有效成分測定中的應(yīng)用

HPCE法可用于多種中藥有效成分的分離和含量測定，如生物堿、黃酮類、苷類、有機(jī)酸類、醌類、酚類、香豆素類等。

2.1生物堿 生物堿在緩沖體系中大多帶有部分正電荷，一般可用毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)模式。李俊松等[6]建立了一種同時(shí)測定黃連飲片生品與炮制品中小檗堿、巴馬汀、藥根堿、木蘭堿和黃連堿的方法。王玉文等[7]采用非水毛細(xì)管電泳法測定金果欖中巴馬汀和藥根堿含量。朱金花等[8]采用膠束電動(dòng)色譜中大體積進(jìn)樣法分離測定蓮子心中的蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿，多種生物堿分離結(jié)果良好。王敏等[9]采用電化學(xué)發(fā)光法測定鹽酸小檗堿，分離效率高、分析速度快。

2.2黃酮類 黃酮類化合物有很多重要的生理活性，廣泛存在于植物中，多用毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜(MECC)模式分離。陳興國等[10]建立了一種簡單快速的分離槲皮素、蕓香苷和綠原酸的反向遷移毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜(RF-MEKC)新方法。劉菁等[11]測定絞股藍(lán)中蘆丁和槲皮素的含量, 王敬鵬等[12]采用化學(xué)發(fā)光法測定槐米中蘆丁和槲皮素的含量，具有分析時(shí)間短、樣品前處理簡便、進(jìn)樣量少、有機(jī)溶劑消耗少、操作簡便的優(yōu)點(diǎn)。

2.3蒽醌類 蒽醌類化合物結(jié)構(gòu)中多有羥基和羧基。用CZE和MECC都能分析。如分離大黃中5種蒽醌類化合物，并測定掌葉大黃、唐古特大黃和藏邊大黃中的蘆薈大黃素、大黃素和大黃酸的含量。

2.4苷類 在苷類及其他藥物的分離分析方面，黃寶美[13]等建立了毛細(xì)管電泳-安培檢測法(CE-AD)測定蘆薈苷的含量。方法檢出限低，靈敏度高，為擴(kuò)大蘆薈資源的應(yīng)用提供了可靠的科學(xué)依據(jù)。曾振興等[14]測定龍膽炮制前后龍膽苦苷的含量變化，結(jié)果表明龍膽經(jīng)過炮制后龍膽苦苷的含量均出現(xiàn)降低，但降低幅度存在較大差異，其原因?yàn)辇埬懪谥七^程中，溫度不易控制恒定，導(dǎo)致炮制效果不同，龍膽苦苷的損失程度也不同。楊慧文等[15]采用毛細(xì)管電泳法測定梔子金花丸中黃芩苷含量，與高效液相色譜法相比，具有樣品用量少、分析成本低等優(yōu)點(diǎn)，并減少了對環(huán)境的污染，可用于梔子金花丸的質(zhì)量控制。

2.5含有機(jī)酸類藥材 有機(jī)酸成分解離后帶負(fù)電荷，以CZE模式分析時(shí)，在中性成分后出峰，分析時(shí)間較長。蒜氨酸是大蒜中重要的生物活性物質(zhì)，是大蒜素的前體，馬曉麗等[16]研究采用高效毛細(xì)管電泳法測定大蒜中蒜氨酸含量，試驗(yàn)中配制了不同pH值的磷酸緩沖液，用以考查pH值對分離效果的影響。隨著pH值的增大，保留時(shí)間延長，選用pH值為6.0的緩沖液，分離時(shí)間短，峰形佳。石雪等[17]采用毛細(xì)管電泳-電化學(xué)檢測(CE-ED)法，對不同品種竹葉和竹葉茶中的活性成分香蘭素、香草酸、順式阿魏酸、對羥基苯甲醛、對羥基苯甲酸、咖啡酸和對香豆酸同時(shí)進(jìn)行定性定量分析，為不同品種竹葉的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

2.6含蛋白質(zhì)多肽類藥材 這類化合物在除等電點(diǎn)以外的pH值條件下帶有電荷，因而可以用CZE模式來分離測定。阮桂平等[18]研究表明冬蟲夏草中化學(xué)成分的高效毛細(xì)管電泳研究主要集中在冬蟲夏草中多糖類、蛋白質(zhì)和核苷類物質(zhì)。定性方面主要是應(yīng)用高效毛細(xì)管電泳指紋圖譜鑒別冬蟲夏草，定量方面主要是對冬蟲夏草中核苷成分進(jìn)行研究。

2.7含多糖類藥材 馬曉麗[19]等實(shí)驗(yàn)首次采用柱前衍生化方法，用毛細(xì)管電泳法研究大蒜多糖的單糖組成，以期為大蒜資源的開發(fā)和利用提供基礎(chǔ)依據(jù)。王艷杰等[20]實(shí)驗(yàn)采用Beckman MDQ型高效毛細(xì)管電泳儀對純化后的五味子多糖進(jìn)行單糖組分的分析，通過五味子多糖圖譜與混合單糖圖譜的比較，可以鑒別出大部分單糖的組成成分，為今后進(jìn)一步深入研究五味子多糖提供實(shí)驗(yàn)參考。

3 中藥復(fù)方制劑的成分分析

中藥復(fù)方制劑由多種藥材組成，成分復(fù)雜。目前控制其質(zhì)量的方法是測定其中一種或多種主要活性成分的含量，常用的分析手段是HPLC。在HPCE成功地用于中藥材成分分析以后，很多分析工作者對多種成分的同時(shí)測定進(jìn)行了深入研究。如羅敏等[21]測定了戊己丸中鹽酸小檗堿與芍藥苷的含量，考查了藥典法、冷浸法和超聲法對鹽酸小檗堿和芍藥苷提取效率的影響，發(fā)現(xiàn)冷浸法提取的含量最低，超聲提取與藥典法提取含量相差不大，由于藥典法的步驟煩瑣，故選用甲醇超聲提取的方法。盧玲等[22]測定了仲草膠囊中槲皮素與綠原酸的含量，結(jié)果表明，在12～20 kV范圍內(nèi)，槲皮素和綠原酸峰高變化很小，遷移時(shí)間和分辨率均隨著工作電壓的升高而降低。劉丹等[23]測定一清顆粒中7種成分的含量，方中大黃的活性成分是蒽醌類化合物，黃芩含有黃酮成分，黃連的有效成分為小檗堿等生物堿。鑒于化合物為弱酸性多羥基化合物，應(yīng)選擇堿性緩沖體系。硼酸鹽能與多羥基化合物形成配位鍵，增加負(fù)電性，是分離這幾種物質(zhì)的良好體系。

4 中藥安全控制

4.1毒性成分質(zhì)量控制 桂附地黃丸為傳統(tǒng)中藥制劑，由肉桂、附子、熟地黃、山茱萸等8味中藥組成，具有溫補(bǔ)腎陽的作用，臨床上主要用于治療腰膝酸軟，肢冷尿頻。方中附子含有痕量成分烏頭堿，現(xiàn)代藥理研究證實(shí)其具有抗炎、免疫抑制、麻醉止痛、抗腫瘤、降血壓等作用。但烏頭堿的毒性很強(qiáng)，人口服烏頭堿0.2 mg即可出現(xiàn)惡心、嘔吐、頭暈、眼花、脈緩、呼吸困難、神志不清、心律紊亂等中毒現(xiàn)象。然而，由于目前附子沒有統(tǒng)一的炮制方法，因此，為控制藥品質(zhì)量，保證用藥安全，李琚沫等[24]采用毛細(xì)管電泳法對桂附地黃丸中痕量毒性成分烏頭堿進(jìn)行質(zhì)量控制。

4.2非法添加化學(xué)成分 劉敏等[25]采用毛細(xì)管電泳的方法檢測中藥制劑舒骨寧中非法添加的西藥雙氯芬酸鉀,建立的CE檢測方法快速、簡便、溶劑用量少、檢測限符合檢測要求，可作為快速打假的一種手段。

4.3配伍禁忌 有文獻(xiàn)表明黃連與黃芩配伍后可拮抗黃連對紅細(xì)胞的損害作用。李偉等[26]通過毛細(xì)管電泳法研究認(rèn)為黃連與黃芩配伍后，共煎液中黃連生物堿和黃芩中黃酮類成分的含量降低的原因，是由于黃連中的生物堿成分與黃芩中的黃酮類化合物形成了沉淀。同樣，黃連和大黃、甘草共煎也會(huì)產(chǎn)生沉淀，而且黃連和甘草共煎產(chǎn)生的沉淀能溶于人工胃液。由于中藥方劑傳統(tǒng)入藥方式為湯劑，其配伍共煎后產(chǎn)生的沉淀大部分以混濁液的形式一起服用，而沉淀一般是兩類成分形成的復(fù)合物，進(jìn)入體內(nèi)，受環(huán)境影響不斷解離，起到緩釋的作用，對臨床療效的影響不大，而對于相關(guān)的成藥，由于制備工藝中的過濾步驟除去了大部分沉淀，勢必對其療效造成較大影響。因此，建議在黃連相關(guān)新藥研制中，應(yīng)該采用分煎方式，盡量避免有效成分的損失；傳統(tǒng)的湯劑入藥也可以考慮分煎的方式，以提高療效，降低費(fèi)用。

5 中藥指紋圖譜的建立

毛細(xì)管電泳非常適合水溶性或醇溶性成分的分離分析，是進(jìn)行中藥質(zhì)量控制的綠色分析方法。其中毛細(xì)管區(qū)帶電泳及毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)的分析對象為可解離的物質(zhì)或帶電荷的物質(zhì)，適用于分離中藥中的生物堿、黃酮及其苷、香豆素類、有機(jī)酸類、氨基酸類、核酸類、多肽類及蛋白質(zhì)類等化合物。采用膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜除了能分析上述物質(zhì)外，還能分析中性分子，因此適用于各類物質(zhì)的分析[27]。

中藥制劑成分復(fù)雜，目前其質(zhì)量控制的方法多是測定其中一種或幾種指標(biāo)成分的含量，但這種方法不能完全體現(xiàn)出中藥制劑的整體質(zhì)量，在尚不清楚全部化學(xué)成分的情況下，通過色譜、光譜、波譜、質(zhì)譜等儀器分析所得物質(zhì)群指紋圖譜展現(xiàn)了這種可能性。目前指紋圖譜已成為國際公認(rèn)的控制中藥或天然藥物質(zhì)量最有效的手段。孫國祥等[28]建立了復(fù)方丹參滴丸的HPCE法，為復(fù)方丹參滴丸制劑的質(zhì)量控制提供了檢測方法。時(shí)存義等[29]建立黃芩的毛細(xì)管電泳指紋圖譜，并對黃芩苷進(jìn)行含量測定，由于雜質(zhì)對毛細(xì)管柱壽命無影響，分辨能力強(qiáng)，能較好地與干擾物分離，精密度高，有機(jī)溶劑消耗少，測定成本低，在中藥有效成分的分離檢測中顯示了較好前景。孫國祥等[30]建立復(fù)方丹參滴丸毛細(xì)管電泳指紋圖譜，結(jié)果表明，HPCE靈敏度高，適于中成藥中多種有效成分的同時(shí)測定。楊宏濤等[31]對苦參的毛細(xì)管電泳數(shù)字化指紋圖譜進(jìn)行了研究，認(rèn)為圖譜特征明顯、專屬性強(qiáng)，為該藥物的質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。林丈津等[32]建立蓮子心提取物的指紋圖譜，并對該方法學(xué)進(jìn)行考查，認(rèn)為該方法可作為控制蓮子心提取物質(zhì)量的方法。劉金丹等[33]對甜瓜蒂進(jìn)行了研究，結(jié)果表明HPCE法分離操作簡便，進(jìn)樣量小，分離完全，峰形正常，線性范圍較寬，重現(xiàn)性好。孫國祥等[34]經(jīng)對通宣理肺丸進(jìn)行方法學(xué)考查，認(rèn)為毛細(xì)管電泳法精密度高、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好。戈早川等[35]研究烏梢蛇的膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜指紋圖譜時(shí)發(fā)現(xiàn)毛細(xì)管易沖洗再生，可保持高效，使各成分的分離較佳。荊國祥等[36]認(rèn)為毛細(xì)管電泳法對玄參有效化學(xué)成分的定量提供了一條新的途徑。

6 中藥藥理研究及新藥開發(fā)

現(xiàn)代藥理學(xué)研究已明確藥物都有其“靶基因”。近年國內(nèi)已有不少學(xué)者開展了中藥干預(yù)基因表達(dá)的調(diào)控研究，初步證明中藥作用原理與其生物活性成分調(diào)控基因表達(dá)有關(guān)，從而為中藥新藥研制提供了新思路。靶基因是中藥作用最本質(zhì)的指標(biāo)，研究中藥能提高那些基因的表達(dá)。許多天然植物提取物中有效成分具有抗癌作用，從中篩選出對DHFR有抑制作用的物質(zhì)，可以降低對人體健康細(xì)胞的副作用和耐藥性[37]。HPCE技術(shù)優(yōu)勢在于對DNA、RNA等生物大分子的快速分析。依據(jù)用藥后相關(guān)組織DNA、RNA所出峰的數(shù)目、相對含量及區(qū)間內(nèi)指紋圖譜，探討中藥對特異性調(diào)節(jié)基因的影響及對肌體自身DNA修復(fù)機(jī)能的作用，從中篩選出療效確切、針對性強(qiáng)、有應(yīng)用前景的中藥。這對于提高我國中藥藥理及新藥研制水平將有積極的意義。

應(yīng)用HPCE的一個(gè)很有前景的方向是：高通量藥物篩選法篩選組合化學(xué)庫或者是傳統(tǒng)中藥中的前體藥物，一些常用藥物篩選技術(shù)僅能提供Ic值，在HPCE的幫助下，能獲得結(jié)合常數(shù)以及化學(xué)計(jì)量數(shù)。一個(gè)更明顯的優(yōu)點(diǎn)在于HPCE分離不要求進(jìn)行樣品純化。因此，單次運(yùn)行HPCE就可以篩選多個(gè)樣品的生物學(xué)活性。隨著微型設(shè)備的迅速發(fā)展，可以在芯片平臺上進(jìn)行超高通量的藥物篩選[38]。

7 中藥藥代動(dòng)力學(xué)方面

利用毛細(xì)管電泳法測定制劑中主要有效成分在體內(nèi)的藥時(shí)曲線，測算其體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，檢測其效果[39]。

8 小結(jié)

高效毛細(xì)管電泳以其高效、快速、簡便且柱不易受污染的特點(diǎn)而優(yōu)于HPLC法，在中藥有效成分的分離、定性定量、中藥材鑒別等方面應(yīng)用越來越廣泛。此外，HPCE法可與其他進(jìn)樣技術(shù)如流動(dòng)注射聯(lián)用，不但可提高測定精度，而且能完成連續(xù)自動(dòng)進(jìn)樣及在線分析，方便大批量樣品的測定，或采用CE-MS、CE-NMR及CE-MS-MS的聯(lián)用技術(shù)，充分利用HPCE的高分離效率和MS或NMR的高靈敏度與定性鑒定能力，快速完成眾多復(fù)雜成分的分離與結(jié)構(gòu)鑒定，大大提高和拓寬CE的性能和應(yīng)用范圍，更適用于中藥復(fù)雜化學(xué)成分的分離與測定。因此，HPCE在中藥制劑質(zhì)量控制及中藥現(xiàn)代化進(jìn)程中必將發(fā)揮巨大作用。

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12 王敬鵬，吳遠(yuǎn)斌，王偉，等.毛細(xì)管電泳、化學(xué)發(fā)光法測定槐米中蘆丁和槲皮素的含量.分析化學(xué)，2009,37(S):133

13 黃寶美，姚程煒，邊清泉.高效毛細(xì)管電泳安培法測定蘆薈中蘆薈苷的含量.應(yīng)用化學(xué)，2009,26(3):302

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15 楊慧文，王曉可，毋福海.毛細(xì)管電泳法測定梔子金花丸中黃芩苷的含量.廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2010,26(2):149

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