韓碩,趙前程,吳斌,李葉,王玫

(1.大連海洋大學(xué)食品工程學(xué)院,遼寧大連116023;2.遼寧出入境檢驗檢疫局,遼寧大連116001)

傳染性造血器官壞死病毒毒株核蛋白基因片段的克隆及序列分析

韓碩1,趙前程1,吳斌2,李葉2,王玫2

(1.大連海洋大學(xué)食品工程學(xué)院,遼寧大連116023;2.遼寧出入境檢驗檢疫局,遼寧大連116001)

利用RTG-2細(xì)胞對傳染性造血器官壞死病毒(IHNV)的敏感性對IHNV-DL進行擴增,采用TRIzol法提取病毒RNA,用IHNV核蛋白基因的一對通用引物進行RT-PCR擴增,將擴增出的一條786 bp的基因純化、克隆至pMD18-T載體中進行序列測定,并與國內(nèi)外已公布的病毒核蛋白基因進行比對和分析。結(jié)果表明:此病毒的核酸序列與標(biāo)準(zhǔn)毒株RB-1、代表毒株WRAC的同源性分別為96.3%和93.6%;翻譯出的氨基酸序列與標(biāo)準(zhǔn)毒株RB-1、代表毒株WRAC的同源性分別為96.1%和93.5%。系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果表明,此毒株與中國近期公布的毒株zyx有密切的親緣關(guān)系。

傳染性造血器官壞死病毒;純化;克隆;序列分析

傳染性造血器官壞死病(Infectious haematopoietic necrosis,IHN)是一種主要感染大馬哈魚和虹鱒魚苗及其幼魚的急性、系統(tǒng)性的嚴(yán)重傳染病[1],給全球大馬哈魚和虹鱒的養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[2]。以前IHN只在北美及歐洲的一些國家流行。1968年,IHNV隨紅大馬哈魚魚卵從阿拉斯加傳入日本北海道[3]。近年來,隨著水生動物及其產(chǎn)品進口貿(mào)易的增加,IHN也傳入中國,并在中國一些地區(qū)流行,在自然環(huán)境中也可以爆發(fā)并造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[4]。所以O(shè)IE(Office International Des Epizooties)將IHN命為口岸魚類第一類檢疫病害。

IHN病原即傳染性造血器官壞死病毒(Infectious haematopoietic necrosis virus,IHNV),屬彈狀病毒科、諾拉彈狀病毒屬[5],單鏈負(fù)股RNA,基因組全長為11 kbp。病毒粒子由RNA聚合酶蛋白(L)、磷酸化蛋白(P或M1)、基質(zhì)蛋白(M或M2)、表面糖蛋白(G)和核蛋白(N)組成[6]。其中,N蛋白和病毒RNA緊密結(jié)合,并且此結(jié)構(gòu)域和其它已知的與RNA結(jié)合的蛋白序列間具有高特異性[7]。

本研究中,作者利用RTG-2細(xì)胞對IHNV的敏感性,對凍存并已鑒定的IHNV-DL病毒進行擴增,產(chǎn)生典型的細(xì)胞病變狀態(tài),采用N基因上一段高保守性和高特異性的786 bp片段的一對通用引物,對擴增出的病毒進行RT-PCR鑒定,對其結(jié)果進行純化、克隆進而測序,并將結(jié)果與已公布的各國外毒株和國內(nèi)毒株zyx的相應(yīng)基因及氨基酸進行了比對和分析,構(gòu)建其核酸和氨基酸序列進化樹,從而為IHNV核蛋白基因結(jié)構(gòu)與功能的進一步研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、毒株和菌種 RTG-2細(xì)胞和IHNVDL病毒由遼寧出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心動物檢疫實驗室提供。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α由該實驗室制備保存。

1.1.2 主要試劑 逆轉(zhuǎn)錄酶AMV、RNA酶抑制劑HRP、r-Taq DNA聚合酶、膠回收(小量)試劑盒、pMD18-T Vector、質(zhì)粒(小量)抽提試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.3 引物 本試驗中使用的引物為擴增IHNV核蛋白基因的通用引物,即擴增786 bp的目的片

段。

上游引物F1:

5'-TCAAGGGGGGAGTCCTCGA-3',

下游引物R1:

5'-CACCGTACTTTGCTGCTAC-3'。

引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病毒的擴增 將病毒液按1∶10、1∶100和1∶1 000三個稀釋度接種于長滿單層的RTG-2細(xì)胞上,用含體積分?jǐn)?shù)為2%的胎牛血清MEM培養(yǎng)液于15℃下培養(yǎng),至80%以上細(xì)胞出現(xiàn)CPE現(xiàn)象,收集病毒,于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 提取RNA 按TRIzol法提取病毒RNA。

1.2.3 目的片段的擴增及鑒定 按文獻(xiàn)[8]中的方法進行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4 目的基因的克隆及測序 回收目的片段,并按常規(guī)方法將目的片段與pMD18-T Vector連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中,然后將轉(zhuǎn)化菌涂布于含有氨芐的LB培養(yǎng)基上,于37℃下過夜培養(yǎng)。挑取單菌落進行擴大培養(yǎng)。菌液經(jīng)PCR擴增后將產(chǎn)物進行電泳,用有目的條帶的陽性菌液提取質(zhì)粒。質(zhì)粒經(jīng)內(nèi)切酶EcoR I和Pst I酶切,對電泳后有目的條帶的質(zhì)粒進行測序。

1.2.5 序列分析 質(zhì)粒DNA由寶生物工程(大連)有限公司用M13-47引物完成測序。用DNAS-tar軟件對測序結(jié)果與已公布的核酸序列(15個)、翻譯出的氨基酸序列(15個)進行核酸和氨基酸同源性的分析;用MEGA等軟件對與來自NCBI上nucleotide blast中的高度相似序列(28個)進行核酸和氨基酸進化樹的構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒的擴增

將IHNV-DL病毒接種于RTG-2單層細(xì)胞上,按1∶10、1∶100和1∶1 000稀釋的病毒液分別在42、48 h和96 h使80%以上的細(xì)胞產(chǎn)生病變(圖1)。

圖1 接種IHNV-DL病毒的RTG-2細(xì)胞的病變Fig.1 Pathologic lesion in RTG-2 inoculated with IHNV-DL

2.2 RT-PCR擴增的結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,在786 bp的位置上有擴增條帶,與引物預(yù)期擴增條帶大小相符(圖2)。

2.3 重組質(zhì)粒的鑒定

將獲得的陽性質(zhì)粒進行酶切驗證,得到了接近786 bp大小的條帶和一條大于2 000 bp的條帶(圖3),說明目的基因序列連接到了pMD18-T載體中。

2.4 序列分析

采用NCBI在線nucleotide blast分析,搜索到高相似序列57條,其中有2個完整的病毒基因序列,26個N基因完整序列,其他為N基因部分序列。利用DNAStar軟件將測出的序列IHNV-DL與15條國內(nèi)外報道的核酸序列以及翻譯出氨基酸序列進行比較,結(jié)果顯示(表1):核酸序列同源率為93.3%～99.6%,翻譯出氨基酸同源率為93%～99.6%。與黑龍江省哈爾濱市報道的毒株zyx (NCBIid:HM099906.1)有最高的同源率99.6%。

圖2 PCR產(chǎn)物的電泳圖Fig.2 Electrophoresis for PCR product

圖3 質(zhì)粒酶切產(chǎn)物的電泳圖Fig.3 The electrophoresis of pMD18-T-IHNV

表1 IHNV-DL與國內(nèi)外報道的毒株同源性的比較(右上為核酸同源率,左下為氨基酸同源率)Tab.1 Homological comparison of IHNV-DL among reported IHNV gene all over the world(amio acids in the left below, nucleotide in the top right)%

2.5 堿基的變化

IHNV-DL與NCBI上已公布的標(biāo)準(zhǔn)毒株RB-1 (NCBI接收序列號U50402.1)和代表毒株WRAC (NCBI接收序列號AY442518.1)比較,核酸序列同源性分別為96.3%和93.6%。共有23個堿基突變位點(圖4)。

2.6 氨基酸的變化

IHNV-DL與標(biāo)準(zhǔn)毒株RB-1和代表毒株WRAC翻譯出的氨基酸序列比較,同源性分別為96.1%和93.5%,共有7個氨基酸突變位點(圖5)。

2.7 進化樹分析

對IHNV-DL核酸和翻譯出的氨基酸序列進行遺傳進化樹分析,結(jié)果見圖6。

3 討論

本試驗中,將IHNV-DL核蛋白核酸序列與已公布的其它15種IHNV完整N基因進行比對。結(jié)果表明:其與14種國外毒株同源率為93.3%～96.4%,其中,與IHNV標(biāo)準(zhǔn)毒株RB-1同源率為96.3%,與代表毒株WRAC同源率為93.6%;IHNV-DL翻譯出的氨基酸序列與國外毒株氨基酸序列同源率為93.0%～96.1%,其中,與標(biāo)準(zhǔn)毒株RB-1同源率為96.1%,與代表毒株WRAC同源

率為93.5%。劉葒等[9]將國內(nèi)養(yǎng)殖場患病的牙鲆和虹鱒及國外進境的匙吻鱘魚卵中檢測出的IHNV序列與標(biāo)準(zhǔn)毒株RB-1進行比較,在患病的牙鲆和虹鱒體內(nèi)檢出的IHNV核酸序列同源性都為98.1%,氨基酸序列同源率分別為97%和99%;國外進境魚卵檢出的IHNV序列同源率為92.5%,氨基酸序列同源率為93%。這與本研究中毒株序列的比對結(jié)果相似。

圖4 IHNV-DL核酸序列的比對(框內(nèi)為核酸突變位點)Fig.4 Mutation comparison of nucleic acids(Mutations in the frame)

將IHNV-DL核酸序列與標(biāo)準(zhǔn)毒株RB-1和代表毒株WRAC比對的結(jié)果表明,共有23個堿基突變位點,其中4個位點為T→C,8個位點為C→T; 1個位點為T→G,1個位點為G→T;1個位點為

G→A,3個位點為A→G;4個位點為C→A,1個位點為X→G。Leong等[10]的研究結(jié)果表明,不同毒株之間核蛋白的相對分子質(zhì)量存在差異,這與本試驗結(jié)果相似。對IHNV-DL序列翻譯的氨基酸序列與標(biāo)準(zhǔn)毒株RB-1和代表毒株WRAC進行比對,結(jié)果表明,共有7個氨基酸發(fā)生突變,影響了IH-

NV-DL的疏水性。其中,第117位中性的甘氨酸突變?yōu)樗嵝缘奶於彼?從而影響了IHNV-DL的酸堿性。這是否對病毒的侵染力有影響,有待進一步研究證實。

圖5 IHNV-DL氨基酸序列的比對(框內(nèi)為氨基酸突變位點)Fig.5 Sequnenc comparison of amino acids in IHNV-DL(Mutations in the frame)

圖6 核酸序列和氨基酸序列的進化樹Fig.6 Phylogenetic tree of the nuclecic acid sequence,and the amino acid sequence

本研究中,將IHNV-DL序列翻譯出的氨基酸序列與15種毒株的序列進行比對,結(jié)果與一些毒株的同源率一致。同源率為96.1%的毒株分別為RB-76(AY442516.1)、LB91KI(AY438975.1)和RB -1(U50402.1);同源率為93.9%的毒株分別為LR -73(AY442513.1)、LR-80(AY442514.1)、193-110 (AY442507.1)和HO-7(AY442512.1);同源率為93.5%的毒株分別為WRAC(AY442518.1)和CST-82(AY442511.1);同源率為93%的毒株分別為SRCV(AY442517.1)、Col-85(AY442510.1)和Col-80(AY442509.1)。Morzunov等[11]比較了IHNV標(biāo)準(zhǔn)毒株RB-1和代表毒株WRAC的核蛋白氨基酸序列的同源性,結(jié)果表明,IHNV不同毒株核蛋白氨基序列存在差異,這與本試驗結(jié)果相似。本研究中,將IHNV-DL序列翻譯出的氨基酸序列與28個高度相似毒株氨基酸序列間建立氨基酸進化樹,結(jié)果同樣驗證了IHNV-DL與上述同源率相同的4組毒株分別屬于進化樹的4個分支,IHNV-DL與這4支毒株的親緣關(guān)系十分相近。

IHNV-DL核酸序列和翻譯出來的氨基酸序列與中國毒株zyx(HM099906.1)的同源性均為99.6%,并且構(gòu)建出來的核酸和氨基酸進化樹都表明二者之間有密切的親緣關(guān)系。

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Cloning and sequencing of nucleocapsid protein in infectious hematopoietic necrosis virus strain

HAN Shuo1,ZHAO Qian-cheng1,WU Bin2,LI Ye2,WANG Mei2
(1.School of Food Engineering,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China;2.Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Dalian 116001,China)

The infectious hematopoietic necrosis virus(IHNV-DL)was amplified by RTG-2 cells,and the RNA in IHNV-DL was extracted by the TRIzol method.A gene of 786 bp was amplified from the nucleoprotein gene of IHNV-DL and cloned to the vector of pMD18-T in which the gene was sequenced and compared with the nucleoprotein gene of virus which was published.The results showed that the homology of nucleotide sequence was found to be 96.3%between the amplified products of the samples and IHNV

train RB-1,and 93.6%between the amplified products of samples and IHNV representative strain WRAC,with the homology of 96.1%and 93.5% between the induced amino acids sequence.The phylogenetic tree showed that the strain had a close relationship with the strain zyx published recently.

infectious haematopoietic necrosis virus(IHNV);purification;cloning;sequence analysis

2095-1388(2011)03-0232-06

S941.41

A

2010-07-07

國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局科技項目(2010IK003)

韓碩(1985-),女,碩士研究生。E-mail:hanshuowz@126.com

吳斌(1968-),女,研究員。E-mail:wubin69@163.com