李強(qiáng),齊楠,楊麗文,李華,王軼南

(大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部海洋水產(chǎn)增養(yǎng)殖學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連116023)

黃海希瓦氏菌多克隆抗體部分特性的分析

李強(qiáng),齊楠,楊麗文,李華,王軼南

(大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部海洋水產(chǎn)增養(yǎng)殖學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連116023)

采用免疫學(xué)方法,以仿刺參Apostichopus japonicus“化皮病”病原菌——黃海希瓦氏菌Shewanella marisflavi AP629福爾馬林滅活疫苗作為免疫原,對新西蘭大白兔進(jìn)行免疫,制備了高效價(jià)的多克隆抗體。通過間接酶聯(lián)免疫、間接免疫熒光和免疫印跡等技術(shù)對多克隆抗體的部分特性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明:獲得的多克隆抗體的效價(jià)為1∶32768;多抗與黃海希瓦氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株存在很強(qiáng)的陽性反應(yīng),與弧菌和氣單胞菌、鏈球菌和大腸桿菌交叉反應(yīng)很弱或不存在交叉反應(yīng);多抗不僅與菌體本身反應(yīng),與菌株表面的分泌物也發(fā)生特異性結(jié)合。免疫印跡結(jié)果顯示,多克隆抗體與黃海希瓦氏菌AP629結(jié)合的抗原決定簇主要蛋白帶有6條,相對分子質(zhì)量分別為131 000、128 000、113 000、62 000、38 000和33 000,其中38 000和33 000蛋白條帶的抗原性最強(qiáng);與胞外產(chǎn)物結(jié)合的抗原決定簇清楚的蛋白條帶主要有3條,相對分子質(zhì)量分別為62 000、38 000和33 000,其中62 000蛋白條帶的信號最強(qiáng)。

仿刺參;黃海希瓦氏菌;多克隆抗體

希瓦氏菌Shewanella是人畜共患的條件性致病菌[1-2],通常分離于淡水和海洋中,但同時(shí)也具有廣闊的工業(yè)和環(huán)境保護(hù)方面的應(yīng)用前景,因此越來越受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注。關(guān)于希瓦氏菌引發(fā)水產(chǎn)動物的疾病報(bào)道很少,陳償?shù)萚3]曾報(bào)道海藻希瓦氏菌Shewanella algae可引起養(yǎng)殖紅擬石首魚Scinenops ocellata發(fā)生潰瘍病;Li等[4]曾報(bào)道黃海希瓦氏菌Shewanella marisflavi可引起養(yǎng)殖仿刺參Apostichopus japonicus發(fā)生化皮病。

關(guān)于黃海希瓦氏菌的研究報(bào)道很少。最早是由Yoon等[5]于2004年從黃海中分離得到,通過生理生化特征鑒定、脂肪酸成分分析、DNA G+C含量、16S rDNA基因序列分析以及DNA-DNA雜交,將分離株SW-117鑒定為新種——黃海希瓦氏菌。2006年,Bharathkumar等[6]報(bào)道了該菌可以分離自土壤中。2004年大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部海洋水產(chǎn)增養(yǎng)殖學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室自患“化皮病”的仿刺參中分離到一株黃海希瓦氏菌AP629,經(jīng)感染試驗(yàn)確定該菌為仿刺參的病原菌[4]。本試驗(yàn)中,作者在前期研究的基礎(chǔ)上,采用免疫學(xué)方法制備了該菌的多克隆抗體,并對其特性進(jìn)行了分析,旨在以該多克隆抗體為工具,建立對該病原菌快速、靈敏的免疫學(xué)檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

黃海希瓦氏菌AP629由大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部海洋水產(chǎn)增養(yǎng)殖學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室提供。黃海希瓦氏菌S.marisflavi(KCCM 41822)、創(chuàng)傷弧菌Vibrio vulnificus(ATCC 29306)、哈維弧菌V.harveryi (ATCC 14126)、溶藻弧菌V.alginolacticus(KCCM 40513)、鰻弧菌V.anguillarum(HUFP 5001)、河流弧菌V.fluvialis(KCCM 40827)、副溶血弧菌V.parahaemolyticus(KCTC2471)、最小弧菌V.minicus(ATCC 33653)、殺鮭氣單胞菌Aeromonas salmonicida(MT 004)、海豚鏈球菌Streptococcus iniae(KCTC 3657)、大腸桿菌Escherichia coli(ATCC 29532)均由韓國釜慶大學(xué)疾病預(yù)防實(shí)驗(yàn)室贈送。健康的成年雌性新西蘭大白兔,體質(zhì)量約2 kg,購自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。弗氏完全佐劑及不完全佐劑、用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗兔IgG、用堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的羊抗兔IgG、對硝基苯磷酸鹽(pNPP)、氯化硝基四唑藍(lán)(NBT)、5-溴-4-氯-3吲哚-磷酸(BCIP)均購自Sigma公司。

1.2 多克隆抗體的制備

1.2.1 抗原的制備 將黃海希瓦氏菌AP629接種于2216E培養(yǎng)基上,28℃下培養(yǎng)24 h;用玻璃刮刀將菌體刮下來,以8 000 r/min離心20 min;去除培養(yǎng)基,以生理鹽水重懸、離心,洗滌兩次,再重懸于體積分?jǐn)?shù)為0.5%的福爾馬林溶液中,于4℃下過夜滅活。用生理鹽水洗滌兩次,離心,收集菌體,所得菌體用生理鹽水重懸。取菌液100 μL涂布于平板上,進(jìn)行活菌檢驗(yàn),檢測無活菌后,置于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 試驗(yàn)動物的免疫 將黃海希瓦氏菌AP629滅活細(xì)菌的數(shù)量調(diào)至108個(gè)/mL,用來免疫純系新西蘭大白兔,共免疫3次。具體免疫程序如下:基礎(chǔ)免疫,將滅活細(xì)菌與弗氏完全佐劑等比混勻,采用皮下注射免疫,共注射6點(diǎn),每點(diǎn)注射0.2 mL; 2周后加強(qiáng)免疫,將滅活細(xì)菌與弗氏不完全佐劑等比混勻,接種方法與基礎(chǔ)免疫相同;1周后再加強(qiáng)免疫1次。在第一次免疫試驗(yàn)前,從兔耳靜脈采血,分離血清,作為陰性對照。

1.2.3 抗血清的采集 對新西蘭白兔進(jìn)行第3次免疫后的第7天,進(jìn)行頸動脈插管放血。將血樣在室溫放置1 h后,于4℃下過夜,次日在4℃下以3 500 r/min離心20 min,分離抗血清,分裝,于-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 多克隆抗體的特性分析

1.3.1 抗體效價(jià)的測定 采用棋盤滴定法測定抗體效價(jià)。將黃海希瓦氏菌AP629用碳酸鹽包被液進(jìn)行10倍梯度稀釋,包被于96孔酶標(biāo)板上,100 μL/孔,4℃下過夜。次日用含體積分?jǐn)?shù)為0.05%的吐溫-磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌3次,每次5 min;每孔滴加200 μL 30 mg/mL的牛血清白蛋白(PBS配制),于37℃下封閉1 h;經(jīng)PBST洗滌3次,加入100 μL按照2倍梯度稀釋的抗血清,37℃下孵育1 h;經(jīng)洗滌,加入100 μL用堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶30 000),37℃下孵育1 h;洗滌后滴加100 μL pNPP應(yīng)用液,在暗處反應(yīng)20 min,在405 nm波長下測定OD值。以正常兔血清作為陰性對照,呈現(xiàn)陽性反應(yīng)的抗體最大稀釋度為待測樣品的效價(jià)。

1.3.2 間接免疫熒光 將黃海希瓦氏菌AP629的數(shù)量調(diào)至5×106個(gè)/mL,取20 μL滴于載玻片上, 37℃下沉降1 h,用丙酮固定20 min。滴加相應(yīng)的抗血清(1∶100)于載玻片上,37℃下孵育1 h,用PBS浸洗3次,每次洗滌5 min。滴加用FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶200),37℃下孵育1 h,再用PBS浸洗3次,每次洗5 min。用甘油封片后,在熒光顯微鏡下觀察,以正常兔血清作為陰性對照。

1.3.3 胞外產(chǎn)物(ECP)的制備及與多抗的交叉反應(yīng) 用平板玻璃紙法[7-8]制備黃海希瓦氏菌AP629的ECP,采用考馬斯亮藍(lán)法[9]測定蛋白質(zhì)的含量,以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)。以間接酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測ECP與多抗的交叉反應(yīng),多抗稀釋度1∶100,酶標(biāo)二抗稀釋度1∶30 000,操作方法同抗體效價(jià)測定。

1.3.4 多抗與其它菌株的交叉反應(yīng) 以間接酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測所獲多克隆抗體與其它菌株的交叉反應(yīng)。測試菌株包括:黃海希瓦氏菌、創(chuàng)傷弧菌、哈維弧菌、溶藻弧菌、鰻弧菌、河流弧菌、副溶血弧菌、最小弧菌、殺鮭氣單胞菌、海豚鏈球菌和大腸桿菌11種標(biāo)準(zhǔn)菌株?？乖粷舛葹?07個(gè)/mL,多抗稀釋度為1∶100,酶標(biāo)二抗稀釋度為1∶30 000,操作方法同抗體效價(jià)的測定。

1.3.5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及免疫印跡(Western-Blot) SDS -PAGE和Western-blot均按照常規(guī)操作方法進(jìn)行[10],電泳凝膠由質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的分離膠和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的濃縮膠組成。簡單描述如下:將黃海希瓦氏菌AP629及其ECP與電泳樣品緩沖液等體積混合,采用Tris-甘氨酸(Gly)電泳緩沖液進(jìn)行電泳,一面膠用考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色,另一面膠用于電轉(zhuǎn)移,轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜(NC膜)按照常規(guī)的免疫學(xué)方法進(jìn)行染色。

2 結(jié)果

2.1 抗體

經(jīng)采血、離心處理后,獲得抗黃海希瓦氏菌AP629的多克隆抗體22 mL。

2.2 抗體的效價(jià)

將多克隆抗體從128倍開始進(jìn)行倍比稀釋,經(jīng)棋盤滴定法測定,當(dāng)抗體稀釋至1∶32 768時(shí),測定的OD405nm值與陰性對照的OD405nm值之比P/N＞2.1,稀釋至1∶65 536時(shí),P/N＜2.1。本試驗(yàn)中制備的抗黃海希瓦氏菌AP629多克隆抗體效價(jià)為1∶32 768,達(dá)到了很高的效價(jià)。

2.3 間接免疫熒光

從圖1可見,細(xì)菌滴片中黃海希瓦氏菌AP629及非菌體部分均呈現(xiàn)明顯的綠色熒光信號,陰性對照中無熒光信號。

圖1 免疫熒光反應(yīng)的試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 The result of immunofluorescence

2.4 多抗與菌株AP629胞外產(chǎn)物的交叉反應(yīng)

采用平板玻璃紙法共獲得菌株AP629胞外產(chǎn)物8 mL,用考馬斯亮藍(lán)測定的蛋白濃度為3 mg/mL。采用間接ELISA法測定多抗與胞外產(chǎn)物反應(yīng)的P/N值為4.2(＞2.1),說明多抗與菌株AP629胞外產(chǎn)物存在交叉反應(yīng)。

2.5 多抗與其它菌株的交叉反應(yīng)

經(jīng)間接ELISA法測定,抗黃海希瓦氏菌AP629多克隆抗體與黃海希瓦氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株存在很強(qiáng)的陽性反應(yīng),與弧菌屬中的創(chuàng)傷弧菌和河流弧菌有微弱的交叉反應(yīng),與弧菌屬中的其它種類及殺鮭氣單胞菌、海豚鏈球菌和大腸桿菌存在極弱或不存在交叉現(xiàn)象(表1)。

表1 交叉反應(yīng)的試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 The result of cross-reactivity

2.6 SDS-PAGE和免疫印跡

SDS-PAGE結(jié)果顯示,菌株AP629與其胞外產(chǎn)物含有很多相同的蛋白帶,但含量存在一定差異。免疫印跡結(jié)果顯示,多克隆抗體與全菌結(jié)合的抗原決定簇主要蛋白帶有6條,相對分子質(zhì)量分別為131 000、128 000、113 000、62 000、38 000和33 000,其中38 000和33 000蛋白條帶的抗原性最強(qiáng);多克隆抗體與胞外產(chǎn)物結(jié)合的抗原決定簇清楚的蛋白條帶主要有3條,相對分子質(zhì)量分別為62 000、38 000和33 000,其中62 000蛋白條帶的信號最強(qiáng)。

圖2 SDS-PAGE和Western-blot結(jié)果Fig.2 The results of SDS-PAGE and Western-blot

3 討論

黃海希瓦氏菌AP629為本實(shí)驗(yàn)室從大連地區(qū)患病仿刺參中分離獲得。感染試驗(yàn)證明,該菌像其它病原菌如燦爛弧菌[11]、假交替單胞菌[12]等一樣可引發(fā)仿刺參成參和幼參出現(xiàn)化皮、腫嘴、吐腸等臨床癥狀,且毒力強(qiáng)于燦爛弧菌和假交替單胞菌。由于黃海希瓦氏菌是近幾年發(fā)現(xiàn)的新種,針對該菌的研究還很不系統(tǒng),關(guān)于該菌的診斷還主要依靠常規(guī)的生理、生化分析和16S rDNA基因等分子生物學(xué)檢測方法,其耗時(shí)久,且需要特殊的專業(yè)技術(shù),這在很大程度上限制了該病的快速診斷,容易延誤治療時(shí)機(jī)。免疫學(xué)方法雖然靈敏度偏低,但其操作簡便,耗時(shí)短,與細(xì)菌的常規(guī)培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合,完全可在短時(shí)間內(nèi)對病原菌進(jìn)行準(zhǔn)確診斷[13-14]。

本試驗(yàn)中通過免疫新西蘭大白兔獲得了抗黃海希瓦氏菌AP629的多克隆抗體22 mL,效價(jià)為1∶32 768,高效價(jià)、高質(zhì)量的抗體為進(jìn)一步應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。多克隆抗體由于具有一定的特異性、靈敏性,且制備相對容易,因此多用來制備二抗,如在雙抗夾心ELISA中就需要多抗[15]。本試驗(yàn)中制備的抗黃海希瓦氏菌AP629的多克隆抗體效價(jià)高、特異性強(qiáng),與弧菌、氣單胞菌和鏈球菌等水產(chǎn)動物病原菌之間交叉反應(yīng)很弱或無交叉反應(yīng)。因此,將本試驗(yàn)中制備的多抗與已制備的單克隆抗體(另文發(fā)表)相結(jié)合,建立針對黃海希瓦氏菌AP629的雙抗夾心ELISA檢測方法,該法可應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐,以適應(yīng)不同層次的需要。

間接免疫熒光結(jié)果顯示,細(xì)菌滴片中黃海希瓦氏菌AP629及非菌體部分均呈現(xiàn)明顯的綠色熒光信號,但陰性對照中無熒光信號。在前期研究中發(fā)現(xiàn),黃海希瓦氏菌AP629菌落非常黏稠,電鏡下顯示菌株表面覆有一層黏稠的分泌物[4]。分析免疫熒光背景著色的原因,可能是多克隆抗體中的部分抗體針對的抗原決定簇位于菌體表面的分泌物上,在制備細(xì)菌懸液的過程中,部分黏附物從菌體表面脫落附著在載玻片上,進(jìn)而使背景著色。用間接ELISA法檢測胞外產(chǎn)物,結(jié)果表明,黃海希瓦氏菌AP629胞外產(chǎn)物中確實(shí)含有與多克隆抗體相結(jié)合的抗原。

免疫印跡結(jié)果顯示,多克隆抗體與黃海希瓦氏菌AP629結(jié)合的抗原決定簇主要蛋白帶有6條,相對分子質(zhì)量分別為131 000、128 000、113 000、62 000、38 000和33 000,其中38 000和33 000蛋白條帶的抗原性最強(qiáng);與胞外產(chǎn)物結(jié)合的抗原決定簇清楚的蛋白條帶主要有3條,相對分子質(zhì)量分別為62 000、38 000和33 000,其中62 000蛋白條帶信號最強(qiáng)。目前有關(guān)黃海希瓦氏菌AP629表面分泌物的組成及與菌株AP629致病性的關(guān)系仍不清楚,本研究結(jié)果雖然不能揭示AP629表面分泌物的蛋白組成,但據(jù)推測相對分子質(zhì)量為62 000、38 000和33 000蛋白很有可能是分泌物中的蛋白組分,結(jié)果有待進(jìn)一步研究。

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Partial characterization of polyclonal antibody against bacterium Shewanella marisflavi

LI Qiang,QI Nan,YANG Li-wen,LI Hua,WANG Yi-nan
(Key Laboratory of Mariculture,Agriculture Ministry,PRC,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

High titer polyclonal antibody(pAb)against bacterium Shewanella marisflavi isolated AP629,a novel pathogen of sea cucumber Apostichopus japonicus,was produced from New Zealand white rabbit with the inactivated vaccine,and partial characterization of the pAb was analyzed with indirect enzyme-lined immunosorbent assay,immunofluorescence assay and western blot.The results showed that the titer of the pAb was 1∶32 768.There was strong reaction of pAb against strain AP629 with S.marisflavi(KCCM 41822),weak or none that with vibrio,Aeromonas salmonicida,Streptococcus iniae,and Escherichia coli.The binding antigens of pAb was located not only in the membrane of the cells but also secretion on the surface of strain AP629.Under reducing conditions in western blotting,the major antigenic determinants of the strain AP629 were 131 000,128 000,113 000,62 000,38 000 and 33 000,respectively,in which the 38 000 and 33 000 had stronger signals than the others did.In addition,three major protein antigens of ECP from strain AP629 in molecular weights of 62000,38000 and 33 000 were recognized in western-blot using above pAb,especially protein of 62 000.

Apostichopus japonicus;Shewanella marisflavi;polyclonal antibody

S917.1

A

2095-1388(2011)04-0376-05

2010-09-23

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30800853);國家“十一五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2006BAD09A01);國家專項(xiàng)(908-01-ZH3);遼寧省海洋與漁業(yè)廳項(xiàng)目(201005)

李強(qiáng)(1979-),男,博士,副教授。E-mail:liqiang@dlou.edu.cn

李華(1958-),女,教授。E-mail:lihua@dlou.edu.cn