張華軍,李卓佳,張家松,郭志勛,文國(guó)樑,曹煜成,吳垠

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,廣東廣州510300;2.大連海洋大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,遼寧大連116023)

凡納濱對(duì)蝦免疫指標(biāo)變化與其養(yǎng)殖環(huán)境理化因子的關(guān)系

張華軍1、2,李卓佳1,張家松1,郭志勛1,文國(guó)樑1,曹煜成1,吳垠2

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,廣東廣州510300;2.大連海洋大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,遼寧大連116023)

選擇兩口凡納濱對(duì)蝦Litopenaeus vannamei養(yǎng)殖土池(305#、301#池),每隔14 d定期采集一次養(yǎng)殖對(duì)蝦和水樣,檢測(cè)對(duì)蝦血清、肝胰臟和肌肉組織中酚氧化酶(PO)、超氧化物歧化酶(SOD)、堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)的活力和抗菌活力(Ua)等免疫指標(biāo),以及水溫、溶解氧(DO)等環(huán)境因子,探討了養(yǎng)殖對(duì)蝦免疫指標(biāo)與環(huán)境因子的相關(guān)關(guān)系。結(jié)果表明:凡納濱對(duì)蝦各組織中免疫指標(biāo)隨亞硝酸鹽氮、總氨氮等濃度的轉(zhuǎn)變有很明顯變化,301#池塘水體中總氨氮和亞硝酸鹽氮由高于305#池轉(zhuǎn)變?yōu)榈陀?05#池,其養(yǎng)殖對(duì)蝦體內(nèi)各組織的免疫指標(biāo)由低于305#池轉(zhuǎn)變?yōu)楦哂?05#池。表明在檢測(cè)的養(yǎng)殖池塘理化因子中,總氨氮和亞硝酸鹽氮是影響?zhàn)B殖對(duì)蝦免疫指標(biāo)最主要的因子,因此,養(yǎng)殖過程中應(yīng)加以嚴(yán)格控制,以提高對(duì)蝦的免疫力和抗病力。

凡納濱對(duì)蝦;免疫指標(biāo);土池;理化因子

近年來,隨著凡納濱對(duì)蝦Litopenaeus vannamei養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大及高密度養(yǎng)殖模式的發(fā)展,病害問題越來越嚴(yán)重。利用抗生素及化學(xué)藥物來治療和預(yù)防蝦類疾病,不僅造成環(huán)境污染和藥物殘留,而且易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。病害的發(fā)生是由病原微生物、機(jī)體自身免疫水平和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果,因此,從生態(tài)學(xué)角度出發(fā),探討?zhàn)B殖環(huán)境因子與養(yǎng)殖對(duì)蝦免疫指標(biāo)的關(guān)系,找出關(guān)鍵因子,并通過調(diào)控關(guān)鍵因子,提升養(yǎng)殖對(duì)蝦的免疫抗病力,對(duì)減少病害的發(fā)生有著重要意義。在實(shí)驗(yàn)室條件下,有關(guān)對(duì)蝦免疫機(jī)理[1-3]及單個(gè)[4-7]或數(shù)個(gè)環(huán)境因子[8-10]對(duì)對(duì)蝦免疫指標(biāo)影響的研究較多,而關(guān)于池塘養(yǎng)殖條件下對(duì)蝦免疫指標(biāo)與水體多個(gè)環(huán)境因子的關(guān)系研究未見報(bào)道。為此,筆者對(duì)粵西土池養(yǎng)殖的凡納濱對(duì)蝦免疫指標(biāo)以及主要環(huán)境因子進(jìn)行了定期測(cè)試,分析養(yǎng)殖中后期養(yǎng)殖理化因子與對(duì)蝦免疫指標(biāo)的關(guān)系,旨在查明影響凡納濱對(duì)蝦免疫指標(biāo)的關(guān)鍵環(huán)境因子,為土池養(yǎng)殖對(duì)蝦免疫抗病力的提高和病害防治提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蝦池的養(yǎng)殖概況

試驗(yàn)于2009年6月15日至8月10日在廣東茂名市電白縣冠利達(dá)生物養(yǎng)殖公司養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行。該養(yǎng)殖場(chǎng)水源為過濾的內(nèi)灣海水與河水的混合水,漲潮時(shí)蓄水。試驗(yàn)選擇大小相同,條件相近的兩口凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘(面積為0.33 hm2)進(jìn)行采樣測(cè)試,編號(hào)為305#和301#。養(yǎng)殖池塘經(jīng)過清除野雜魚蝦、消毒、進(jìn)水消毒,肥水3 d后放苗。2009年5月15日放苗,密度為75萬尾/hm2。

養(yǎng)殖前期,每池配備葉輪式增氧機(jī)一臺(tái)(1.5 kW),中后期增加一臺(tái)。日投餌量為對(duì)蝦體質(zhì)量的2%～5%,具體根據(jù)餌料臺(tái)上的剩余餌料量和天氣情況進(jìn)行調(diào)整,每天投喂兩次,時(shí)間分別為07:00和17:00。試驗(yàn)期間當(dāng)?shù)靥鞖舛嘧?7月上旬和中下旬分別受熱帶風(fēng)暴“蘇迪羅”和強(qiáng)臺(tái)風(fēng)“莫拉菲”的影響,出現(xiàn)大到暴雨天氣,8月上旬至中旬受熱帶風(fēng)暴“天鵝”影響,出現(xiàn)持續(xù)大雨天氣。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集與處理 試驗(yàn)期間,每隔14 d采樣一次?，F(xiàn)場(chǎng)采用pHB-3型便攜式pH計(jì)測(cè)定pH,用YSI 550便攜式溶氧儀測(cè)定溶解氧(DO)及水溫,用WYY-Ⅱ便攜式折射鹽度計(jì)測(cè)量鹽度。同時(shí)采集池塘水樣送華南環(huán)境科學(xué)研究所檢測(cè)總氨氮(TNH-N)、亞硝酸鹽氮(NO-N)、硝酸鹽氮(NO-N)、總氮(TN)、化學(xué)需氧量(COD)和生物需氧量(BOD)。

養(yǎng)殖對(duì)蝦體長(zhǎng)小于10 cm階段,每個(gè)池塘取15尾對(duì)蝦,放入液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室。對(duì)蝦體長(zhǎng)為10 cm左右時(shí),每個(gè)池塘取5～10尾對(duì)蝦,先用1 mL無菌注射器自頭胸甲后部插入心區(qū)采血,將混合血樣放入冰盒中,蝦體放入液氮中,一并當(dāng)天帶回實(shí)驗(yàn)室。血樣于第二天處理,在4℃下以6 000 r/min離心10 min,取上清液,放入超低溫冰箱(-80℃)中保存待測(cè)。將蝦體解凍后,取肌肉與肝胰臟組織各0.1 g,加入5倍體積的PBS緩沖液(pH 7.4)低溫勻漿,4℃下以6 000 r/min離心10 min,取上清液,放入超低溫冰箱(-80℃)中保存待測(cè)。

1.2.2 免疫指標(biāo)的測(cè)試 以L-DOPA(Sigma)為底物,參照Ashida等[11-12]的方法測(cè)定酚氧化酶(PO)的活力;采用鄧碧玉等[13]改良的連苯三酚自氧化法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)的活力;參照Hultmark等[14]改進(jìn)的方法測(cè)定抗菌活力(Ua);采用磷酸苯二鈉法測(cè)定堿性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)的活力[15];采用Bradford[16]的考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。

2 結(jié)果

2.1 凡納濱對(duì)蝦免疫指標(biāo)的變化

2.1.1 酚氧化酶的活力 7月14日305#池對(duì)蝦血清中PO活力為20.8 U/mL,是301#池(3.2 U/ mL)的6.5倍;7月28日301#池對(duì)蝦血清中PO活力已與305#池的接近,到8月11日時(shí)高于305#池(圖1)。試驗(yàn)期間,對(duì)蝦肝胰腺和肌肉組織中的PO活力一直很低,均在1 U/mg以下。

圖1 凡納濱對(duì)蝦血清中酚氧化酶的活力Fig.1 PO activity in the serum of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei

2.1.2 超氧化物歧化酶的活力 對(duì)蝦血清中SOD活力為500～700 U/mL,除7月28日外,301#池對(duì)蝦血清中SOD活力均高于305#池;對(duì)蝦肝胰腺中SOD活力為20～160 U/mg,肌肉中SOD活力為20～50 U/mg,基本呈現(xiàn)采樣前期301#池低于305#池、采樣后期301#池高于305#池的趨勢(shì)(圖2)。

2.1.3 抗菌活力 對(duì)蝦血清中Ua為0.2～0.4 U/mL,肝胰腺中Ua為0.2～1.0 U/mg,肌肉中Ua為0.1～0.7 U/mg(圖2)。7月14日301#池對(duì)蝦血清中Ua低于305#池,之后301#池高于305#池;肝胰腺和肌肉中Ua均基本呈現(xiàn)采樣前期301#池低于305#池、采樣后期則301#池高于305#池的趨勢(shì)。

2.1.4 堿性磷酸酶和酸性磷酸酶的活力 對(duì)蝦血清中AKP活力為0.1～1.2 U/mL,肝胰腺中AKP活力為0.1～0.8 U/mg,肌肉中AKP活力極低,在0.01 U/mg以下(圖3)。血清中AKP活力7月14日301#池低于305#池,7月28日時(shí)差距減小,8月11日301#池高于305#池;肝胰腺中AKP活力總體上逐漸遞減,從7月14日開始301#池均高于305#池。

血清中ACP活力為0.01～0.17 U/mL,肝胰腺中ACP活力為0.01～0.05 U/mg,肌肉中ACP活力極低,在0.01 U/mg以下(圖3)。血清中ACP活力7月14日301#池低于305#池,7月28日開始301#池高于305#池;肝胰腺中ACP活力從7月14日開始,301#池慢慢轉(zhuǎn)變?yōu)楦哂?05#池。

2.2 蝦池水體理化因子的變化

蝦池水體理化因子的變化情況見圖4。

2.2.1 水溫和溶解氧 試驗(yàn)期間,兩口池塘的水溫和溶解氧(DO)的變化趨勢(shì)基本相似。水溫為28～32.2℃,7月28日達(dá)到最高(32.2℃)。受熱帶風(fēng)暴“天鵝”的影響,8月上中旬持續(xù)為陰雨天氣,8月11日測(cè)試時(shí)水溫只有28℃左右。DO為2.31～8.72 mg/L,6月30日達(dá)到峰值,之后持續(xù)下降,到8月11日301#池的DO為3.88 mg/L, 305#池的DO只有2.31 mg/L,這可能與7、8月受臺(tái)風(fēng)影響出現(xiàn)持續(xù)的陰雨天氣有關(guān)。

圖2 凡納濱對(duì)蝦血清、肝胰腺和肌肉中SOD和UaFig.2 SOD,and Ua activities in the serum,hepatopancreas and muscles of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei

圖3 凡納濱對(duì)蝦血清和肝胰腺中AKP和ACP的活力Fig.3 AKP,and ACP activities in the serum,and hepatopancreas of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei

圖4 蝦池水體理化因子的變化情況Fig.4 Variation in water quality in the shrimp ponds

2.2.2 鹽度和pH 養(yǎng)殖中后期受臺(tái)風(fēng)影響持續(xù)降雨,鹽度明顯下降,從采樣開始的10左右一直下降到5左右;301#蝦池pH在養(yǎng)殖過程中先升高后下降,305#蝦池pH總體呈遞減趨勢(shì),養(yǎng)殖水體pH為7.0～8.0。

2.2.3 無機(jī)氮和總氮 無機(jī)氮含量的變化有一個(gè)共同規(guī)律,即7月14日之前301#池高于305#池,7月14日開始301#池低于305#池?？偟獫舛瓤傮w上呈遞增趨勢(shì),整個(gè)過程中301#池總氮濃度除6月16日與305#池較接近外,都遠(yuǎn)低于305#池。

2.2.4 COD和BOD COD和BOD濃度總體上呈遞增趨勢(shì),且整個(gè)過程中301#池濃度低于305#池。COD為4.12～12.0 mg/L,BOD為2.0～11.6 mg/L,兩池塘BOD除8月11日外是逐步遞增的。

3 討論

對(duì)蝦類甲殼動(dòng)物主要以非特異性免疫為主,許多環(huán)境因子都能影響對(duì)蝦的免疫指標(biāo)。PO、SOD、Ua、AKP、ACP在免疫抗病力方面起著重要作用,其活力的高低常用作衡量對(duì)蝦免疫力的參照指標(biāo)。

PO活力是反映對(duì)蝦免疫水平最理想的指標(biāo)。研究表明,水體中總氨氮和亞硝酸鹽氮濃度較高時(shí),對(duì)蝦的PO活力相對(duì)較低[17-19]。這與本試驗(yàn)結(jié)果相似。本試驗(yàn)中,隨著養(yǎng)殖時(shí)間的推移,301#池亞硝酸鹽氮、總氨氮、硝酸鹽氮濃度由略高于305#池到遠(yuǎn)低于305#池,而301#池對(duì)蝦血清中的PO活力由遠(yuǎn)低于305#池轉(zhuǎn)變?yōu)楦哂?05#池。姜令緒等[20]研究發(fā)現(xiàn),水體中總氨氮濃度小于2.5 mg/L時(shí),凡納濱對(duì)蝦血清中的PO活力隨著總氨氮濃度的升高而升高。導(dǎo)致結(jié)果不一致的原因可能是養(yǎng)殖池塘中的環(huán)境條件及對(duì)蝦的生長(zhǎng)階段等存在差異。有研究證實(shí),酚氧化酶以非活化狀態(tài)的酶原形式存在于大顆粒細(xì)胞和小顆粒細(xì)胞的顆粒中[2-3],其它組織沒有[21]。本試驗(yàn)中,在對(duì)蝦的肝胰腺和肌肉組織中檢測(cè)到PO活力,但一直很低,這可能是組織中存留有少量的血細(xì)胞。

SOD是一種重要的抗氧化酶。當(dāng)SOD活性降低時(shí),生物體內(nèi)會(huì)出現(xiàn)自由基過多的現(xiàn)象,勢(shì)必?cái)_亂和破壞體內(nèi)一些重要的生化過程,導(dǎo)致代謝混亂,正常生理功能失調(diào),體內(nèi)免疫水平下降,潛在的病原被激活,因此導(dǎo)致對(duì)蝦發(fā)病[22]。所以SOD常作為機(jī)體免疫指標(biāo)來評(píng)判機(jī)體免疫力[23-24]。本試驗(yàn)中,301#池(亞硝酸鹽氮、總氨氮和BOD濃度較低)對(duì)蝦血清中的SOD活力大體上高于305#池(亞硝酸鹽氮、總氨氮和BOD濃度較高),隨著亞硝酸鹽氮、總氨氮的變化,301#池對(duì)蝦肝胰腺和肌肉中的SOD活力大體上由低于305#池轉(zhuǎn)變?yōu)楦哂?05#池,這與周鮮嬌等[18]的研究結(jié)果一致。

Ua在體液免疫中起著防御病原微生物入侵的作用,這對(duì)于缺乏特異性免疫功能的對(duì)蝦來說至關(guān)重要。康翠潔等[25]已在中國(guó)對(duì)蝦中克隆到一種抗菌肽基因,但目前關(guān)于其免疫機(jī)制還不是很清楚。本試驗(yàn)中,301#池亞硝酸鹽氮、總氨氮由略高于305#池轉(zhuǎn)變?yōu)檫h(yuǎn)低于305#池,而301#池對(duì)蝦血清中的Ua明顯由低于305#池轉(zhuǎn)變?yōu)楦哂?05#池,肝胰腺和肌肉中的Ua大體上也出現(xiàn)相同的變化。這與姜令緒等[20]的研究結(jié)果一致,即隨著總氨氮濃度的升高,Ua也下降,說明亞硝酸鹽氮、總氨氮對(duì)Ua的影響作用是明顯的?？咕暮涂咕鞍资怯裳?xì)胞產(chǎn)生的,而本試驗(yàn)中對(duì)蝦各組織中的Ua相差不是很大。筆者推測(cè),其原因可能是機(jī)體合成的抗菌肽和抗菌蛋白能隨體液到達(dá)機(jī)體各組織。

AKP和ACP是溶酶體酶的重要組成部分,直接參與磷酸化代謝和轉(zhuǎn)移,因此磷酸酶在對(duì)蝦免疫方面具有重要作用。本研究結(jié)果顯示,隨著301#池亞硝酸鹽氮、總氨氮濃度由略高于305#池到遠(yuǎn)低于305#池的變化,301#池對(duì)蝦血清中AKP和ACP活力由低于305#池先后轉(zhuǎn)變?yōu)楦哂?05#池,肝胰腺中AKP和ACP活力的變化大體上如此。這表明亞硝酸鹽氮、總氨氮濃度過高會(huì)導(dǎo)致對(duì)蝦體內(nèi)的磷酸酶活力下降。肌肉中AKP和ACP活力明顯低于肝胰腺,這可能與兩種酶存在的位置(小顆粒細(xì)胞)有關(guān)。

綜上所述,養(yǎng)殖對(duì)蝦各組織的免疫指標(biāo)均隨著蝦池水體中總氨氮和亞硝酸鹽氮濃度的變化而有明顯的變化,301#池總氨氮、亞硝酸鹽氮濃度由高于305#池轉(zhuǎn)變?yōu)榈陀?05#池,其對(duì)蝦免疫指標(biāo)也由低于305#池先后轉(zhuǎn)變?yōu)楦哂?05#池,而試驗(yàn)中兩口池塘的水溫、溶氧等其它理化因子相近。因此,筆者認(rèn)為,本試驗(yàn)中影響凡納濱對(duì)蝦免疫指標(biāo)的關(guān)鍵因子為總氨氮和亞硝酸鹽氮。本試驗(yàn)中,8月11日301#池的DO為3.88 mg/L,305#池的DO只有2.31 mg/L,此時(shí)對(duì)蝦各組織的免疫指標(biāo)都是301#池高于305#池。301#池的鹽度從7月14日開始低于305#池,而對(duì)蝦各組織的免疫指標(biāo)多是301#池高于305#池,故本試驗(yàn)中DO、鹽度在一定程度上也對(duì)對(duì)蝦免疫指標(biāo)造成了影響。因此,生產(chǎn)中要特別注意監(jiān)測(cè)這些理化因子,科學(xué)地調(diào)控養(yǎng)殖水體環(huán)境,減少總氨氮、亞硝酸鹽氮等有毒害物質(zhì)的積累,使對(duì)蝦保持較高的免疫抗病力,以實(shí)現(xiàn)對(duì)蝦的健康高產(chǎn)養(yǎng)殖。

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Changes in non-specific immune parameters and water quality in Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei culture ponds

ZHANG Hua-jun1,2,LI Zhuo-jia1,ZHANG Jia-song1,GUO Zhi-xun1, WEN Guo-liang1,CAO Yu-cheng1,WU Yin2
(1.School of Life Science and Technology,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China;2.South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences,Guangzhou 510300,China)

The activities of phenoloxidase(PO),superoxide dismutase(SOD),alkaline phosphatase(AKP),and acid phosphatase(ACP)and antibacterial activity(Ua)in the serum,hepatapancreas,and muscles and temperature,dissolved oxygen,ammonia,and nitrite were determined in two Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei culture ponds(Pond 305#,Pond 301#)from June to August,2009 to evaluate the relationship between non-specific immunity and water quality.The activity of the non-specificity immune enzymes was significantly changed with change in the ammonia,and nitrite levels in the culture ponds,from higher activity of the non-specificity immune enzymes in Pond 301#with lower concentrations of the ammonia,and nitrite to the lower activity of the non-specificity immune enzymes in Pond 305#with higher concentrations of the ammonia,and nitrite,indicating that the key factors affecting the shrimp non-specific immunity were ammonia nitrogen and nitrite.

Litopenaeus vannamei;immune parameter;earthern pond;physical and chemical factor

S945.4

A

2095-1388(2011)04-0356-06

2010-08-29

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(蝦)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(NYCYTX-46);國(guó)家“十一五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2006BAD09A07, 2007BAD29B06);南海水產(chǎn)研究所中央級(jí)公益性科研院所基本科研專項(xiàng)(2010YD05);公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(nyhyzx07-042,200803012);廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2009B020201001);廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項(xiàng)(A200899A06);廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項(xiàng)(A201001B02);廣東省魚病防治專項(xiàng)(2130108)

張華軍(1984-),男,碩士研究生。E-mail:zhj565784@163.com

李卓佳,女,研究員。E-mail:zhuojiali609@163.com