張偉杰,別良玉,陸士新,王瑞林,趙培榮,王留興1,#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科鄭州 450052 2)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所北京 100021 3)鄭州大學(xué)腫瘤中心鄭州 450052

#通訊作者,男,1952年2月生,本科,教授、主任醫(yī)師,研究方向:惡性腫瘤的內(nèi)科治療,E-mail:wlx2246@yahoo.com.cn

前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。在西方國家,其在 40歲以上男性惡性腫瘤死亡原因中居第 2位,僅次于肺癌[1];在我國該病的發(fā)病率也有逐年上升的趨勢。前列腺癌發(fā)病原因復(fù)雜,已有研究[2]證實在前列腺癌中,有許多基因存在異常高甲基化。作者觀察了前列腺癌與前列腺增生組織中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase 1,DNMT1)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶P1(glutathione S transferase P1,GSTP1)與結(jié)腸腺瘤性息肉病基因(adenomatous polyposis coli,APC)的表達(dá)情況,并進(jìn)一步探討了它們之間的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 對象 收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科2008年1月至2010年 1月收治的 56例前列腺癌確診患者的臨床和病理資料。其中前列腺癌切除標(biāo)本4例,經(jīng)尿道電切標(biāo)本 19例,穿刺活檢組織標(biāo)本 33例。年齡 50～93歲,中位年齡 77歲。病理分級:根據(jù)Gleason評分標(biāo)準(zhǔn)分為高分化腺癌9例,中分化腺癌17例,低分化腺癌 30例;臨床分期:采用美國Jewett-Whitmore-Prout體系進(jìn)行分期,A期4例,B期7例,C期 11例,D期 34例。10例同期行開放手術(shù)切除的前列腺增生患者標(biāo)本作為對照,年齡 55～80歲,中位年齡 68歲。所有患者術(shù)前均未行放、化療或其他針對腫瘤的治療。

1.2 前列腺癌和前列腺增生組織中 DNMT 1、GSTP1和APC蛋白的檢測

鼠抗人DNMT1單抗(ab54759)購自Abcam公司、鼠抗人GSTP1單抗(sc-66000)和兔抗人APC多抗(sc-896)購自美國Santa Cruz公司。SP-9000免疫組織化學(xué)檢測試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

標(biāo)本經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醛溶液固定,石蠟包埋,4μm厚連續(xù)切片。所有操作步驟均按免疫組織化學(xué)SP檢測試劑盒說明書進(jìn)行。一抗稀釋比例為1∶200。同時用PBS代替一抗作陰性對照,已知前列腺癌陽性切片作陽性對照。結(jié)果判定采用雙盲法,每張切片由 2名病理科醫(yī)師分別判斷,二者結(jié)果不一致時重新判斷。

每張切片選取 5個具有代表性的高倍視野,計數(shù) 500個細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù),按陽性細(xì)胞所占比例:＜10%計0分,10%～計1分,51%～計2分,≥75%計 3分。按著色程度:染色與背景相似者為 0分,著色淺、略高于背景者為 1分,中度著色、明顯高于背景者為 2分,強染、著深棕色者為 3分。取兩項評分的乘積為總分,0分為陰性,≥1分為陽性。1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0進(jìn)行分析。采用確切概率法比較前列腺癌與前列腺增生組織中DNMT1、GSTP1及APC蛋白的陽性表達(dá)率;采用列聯(lián)系數(shù)分析前列腺癌組織中 DNMT1的表達(dá)與GSTP1、APC表達(dá)的關(guān)聯(lián)性。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 前列腺癌和前列腺增生組織中 DNMT1、GSTP1和APC蛋白的表達(dá) 見圖1。不同組織中DNMT1、GSTP1和APC蛋白的表達(dá)見表1。

2.2 前列腺癌組織中DNMT1蛋白與GSTP1、APC蛋白表達(dá)的關(guān)聯(lián)性分析 結(jié)果見表2。

圖1 前列腺癌(A)和前列腺增生(B)組織中DNMT 1、GSTP1和APC蛋白的表達(dá)(SP,×400) 1:DNMT1;2:GSTP1;3:APC。

表1 不同組織中DNMT1、GSTP1和APC蛋白的表達(dá)例(%)

表2 前列腺癌組織中DNMT 1蛋白的表達(dá)與GSTP1、APC蛋白表達(dá)的關(guān)聯(lián)性 例

3 討論

近年來的研究[2]證實,腫瘤細(xì)胞中許多基因啟動子CpG島表現(xiàn)的異常高甲基化是腫瘤抑制基因除突變、缺失和失活的第 3種機制,在某些情況下甚至是惟一機制。與甲基化有關(guān)的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)有3種:DNMT1、DNMT3a和DNMT3b,其中DNMT1是 DNA復(fù)制后維持甲基化的關(guān)鍵酶[3]。趙先蘭等[4]報道在宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌組織 DNMT1 mRNA的陽性率高于正常組織。該研究結(jié)果示在前列腺增生及高、中、低分化前列腺癌組織中DNMT1蛋白的陽性表達(dá)率逐漸升高,表明DNMT1的活性越高,前列腺癌的惡性程度亦越高。

GSTP1通過參與細(xì)胞的新陳代謝、解毒及清除可能損害基因的外源性化合物,從而保護(hù)細(xì)胞免受DNA損傷和癌變。扈清云等[5]報道正常前列腺、前列腺增生、高級別的上皮內(nèi)瘤變及前列腺癌組織中GSTP1的表達(dá)呈逐漸降低的趨勢。杜穩(wěn)斌等[6]報道,超過90%的前列腺癌組織中GSTP1的CpG島存在高甲基化現(xiàn)象,而正常人和前列腺增生癥患者的前列腺組織中未發(fā)現(xiàn)。Woodson等[7]報道此現(xiàn)象可以作為前列腺癌的早期診斷標(biāo)志。該研究結(jié)果亦證實在前列腺增生及高、中、低分化前列腺癌組織中GSTP1蛋白的陽性表達(dá)率逐漸降低,提示可進(jìn)一步通過使用去甲基化劑抑制DNMT1的活性,使部分因高甲基化而失活的基因(如GSTP1)恢復(fù)表達(dá),為前列腺癌的治療開辟一條新的途徑。

APC蛋白是Wnt信號通路的重要組成部分,參與了β-catenin蛋白胞質(zhì)內(nèi)降解。APC失活后βcatenin積聚于胞質(zhì)內(nèi)并易位入細(xì)胞核,激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄,如c-myc、CyclinD1和c-jun,最終導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化,形成惡性腫瘤[8]。目前有關(guān)APC在前列腺癌組織中表達(dá)的研究甚少,該研究結(jié)果顯示在前列腺增生及高、中、低分化的前列腺癌組織中APC蛋白的陽性表達(dá)率逐漸降低,說明APC表達(dá)的缺失與前列腺癌惡性程度的增加有關(guān)。

此外,該研究還顯示前列腺癌組織中DNMT1的表達(dá)和GSTP1、APC的表達(dá)均呈負(fù)關(guān)聯(lián),提示抑癌基因失活的機制也許與啟動子高甲基化有關(guān),且在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

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[3]王志剛,吳建新.DNA甲基轉(zhuǎn)移酶分類、功能及其研究進(jìn)展[J].遺傳,2009,31(9):903

[4]趙先蘭,饒燕玲,孟志英,等.宮頸癌組織中 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1mRNA的表達(dá)[J].鄭州大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版, 2009,44(1):120

[5]扈清云,朱金玲,張東東,等.GSTP1在前列腺癌組織中的表達(dá)及其甲基化檢測[J].解剖學(xué)研究,2009,31 (1):31

[6]杜穩(wěn)斌,侯建國,武旗,等.前列腺癌組織中谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P1基因啟動子區(qū)域甲基化序列分析[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2008,29(7):762

[7]Woodson K,O'Reilly KJ,Hanson JC,etal.The usefu lness of the detection of GSTP1methylation in urine as abiomarker in the diagnosis of prostate cancer[J].J Urol, 2008,179(2):508

[8]陸以霞,祝喜萍,盧艷紅,等.胃癌及胃癌前病變中APC、bcl-2和c-met基因的表達(dá)及意義[J].吉林大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2007,33(2):314