陳帥印,張榮光,范清堂,段廣才#

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室;河南省分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室鄭州 450001

#通訊作者,男,1958年 8月生,博士,教授,研究方向:分子流行病學(xué),E-mail:gcduan@public2.zz.ha.cn

乳酸菌中幽門螺桿菌 ureB基因的食品級(jí)表達(dá)與優(yōu)化＊

陳帥印1),張榮光2),范清堂1),段廣才1)#

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室;河南省分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室鄭州 450001

#通訊作者,男,1958年 8月生,博士,教授,研究方向:分子流行病學(xué),E-mail:gcduan@public2.zz.ha.cn

幽門螺桿菌;ureB基因;乳酸乳球菌;食品級(jí)表達(dá)載體;條件優(yōu)化

目的:以乳酸乳球菌 (Lactococcus lactis,L.lactis)為宿主菌構(gòu)建幽門螺桿菌 (Helicobacter pylori,H.pylori)尿素酶B(UreB)的食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)。方法:從重組質(zhì)粒 pMD19-T-ureB上酶切得到 ureB基因片段,與含有篩選標(biāo)記 lacF基因的L.lactis表達(dá)載體 pNZ8149經(jīng)雙酶切后定向連接,應(yīng)用 PCR、酶切和測(cè)序的方法鑒定重組子。重組菌用乳聯(lián)菌肽誘導(dǎo)表達(dá),用正交表實(shí)驗(yàn)進(jìn)行表達(dá)條件的優(yōu)化,通過(guò) SDS-PAGE和Western blot對(duì)重組蛋白進(jìn)行鑒定。結(jié)果:重組菌NZ3900/pNZ8149-ureB經(jīng)鑒定與預(yù)期相符。優(yōu)化結(jié)果顯示在菌體培養(yǎng)到D600nm為 0.40左右時(shí)加入終濃度為 25μg/L的乳聯(lián)菌肽誘導(dǎo) 5 h產(chǎn)量最高,通過(guò)Western blot能檢測(cè)到UreB的表達(dá)。結(jié)論:構(gòu)建了 ureB基因食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng),并得到了表達(dá)的最優(yōu)條件。

1 材料與方法

1.1 菌株及質(zhì)粒 大腸桿菌DH5α由河南省分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存,質(zhì)粒 pMD19-T-ureB和重組工程菌 TB1/pMAL-c2X-ureB由作者所在的課題組前期構(gòu)建[7]。L.lactis表達(dá)載體 pNZ8149及L.lactisNZ3900購(gòu)自荷蘭N IZO研究所。

1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶NcoⅠ、XbaⅠ和 T4 DNA連接酶購(gòu)自美國(guó) Promega公司,質(zhì)粒提取試劑盒和 Taq DNA聚合酶由北京天根生物公司提供, DNA回收純化試劑盒為 Axygen公司產(chǎn)品,乳聯(lián)菌肽(nisin)為 Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化 從大腸桿菌DH5α/ pMD19-T-ureB中提取質(zhì)粒,酶切回收得到 ureB基因。pNZ8149以NcoⅠ、XbaⅠ雙酶切后和回收的ureB用 T4 DNA連接酶 23℃連接 4 h,乙醇沉淀純化。將純化的連接產(chǎn)物與電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞NZ3900混勻后,轉(zhuǎn)入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯 (Bio-Rad公司)中,電擊參數(shù):2.2 kV、25μF、200Ω,4.98 ms。電擊后加入 1 mL預(yù)冷的 G M17MC恢復(fù)培養(yǎng)基,將菌液轉(zhuǎn)入 1.5 mL的離心管中,冰上靜置 5 min,30℃厭氧培養(yǎng) 2 h,取適量菌液涂布于 Elliker培養(yǎng)基, 30℃厭氧培養(yǎng)過(guò)夜,挑取陽(yáng)性菌落培養(yǎng),提取質(zhì)粒。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切、PCR和測(cè)序鑒定。將陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為 pNZ8149-ureB,獲得的陽(yáng)性工程菌命名為NZ3900/pNZ8149-ureB。

1.4 重組乳酸菌 NZ3900/pNZ8149-ureB誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化及表達(dá) 采用L25(53)正交表,取誘導(dǎo)劑 nisin的質(zhì)量濃度 (A)、誘導(dǎo)時(shí)機(jī) (B)和誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間(C)3個(gè)因素,每個(gè)因素設(shè) 5個(gè)水平:A因素為5、25、50、100和 150μg/L,B因素菌液D600nm為0.10～、0.15～、0.20～、0.30～、0.40～0.60,C因素為誘導(dǎo) 1、2、3、4和 5 h。將陽(yáng)性重組菌及空載體對(duì)照菌接種于LM17培養(yǎng)基中,30℃厭氧培養(yǎng)過(guò)夜后,取過(guò)夜培養(yǎng)菌以 1∶25比例接種于LM17培養(yǎng)基中,30℃厭氧培養(yǎng),按照正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的不同組合進(jìn)行誘導(dǎo)。終止培養(yǎng)后菌液 8 000 r/min、4℃離心 5 min收集菌體,用 PBS洗 1次,離心后加入 400 μL Column buffer(20 mmol/L Tris-Cl、200 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA和 10 mmol/Lβ-巰基乙醇)重懸菌體。用溶菌酶破碎菌體,Bradford法測(cè)得各樣品的總蛋白濃度。按每孔 50μg上樣量,計(jì)算上樣體積,加入凝膠加樣緩沖液(含DTT)充分混勻,120 g/L SDS-PAGE進(jìn)行電泳。用 BandScan軟件分析得出UreB蛋白占總蛋白的比例;根據(jù)各樣品的總蛋白濃度計(jì)算出每mL培養(yǎng)基得到目的蛋白的量。

1.5 表達(dá)產(chǎn)物鑒定 重組乳酸菌表達(dá)的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后,用Bio-Rad半干式電轉(zhuǎn)印儀將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,同時(shí)設(shè)空白菌株NZ3900/pNZ8149為對(duì)照。轉(zhuǎn)印結(jié)束后,以制備的小鼠抗 UreB免疫血清為一抗,HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗,聯(lián)苯胺作為底物進(jìn)行Western blot。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒 pNZ8149-ureB的構(gòu)建及鑒定 見圖 1。構(gòu)建的重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果和 GenBank上公布的 Hp-MEL27 ureB基因進(jìn)行BLAST對(duì)比,序列完全一致。

圖 1 重組質(zhì)粒 pNZ8149-ureB的 PCR和酶切鑒定

2.2 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表 1、2?？芍?各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響大小的次序是B>A>C,且只有因素B(誘導(dǎo)時(shí)機(jī))對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,在 B5A2C5條件下,UreB蛋白產(chǎn)率最高,此時(shí)的產(chǎn)量為 12.900 mg/L,占總蛋白的7%左右。

2.3 重組菌表達(dá)的 UreB蛋白活性鑒定 NZ3900/ pNZ8149-ureB各孔均現(xiàn)預(yù)期蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為64 000的條帶,而對(duì)照空菌 NZ3900/pNZ8149無(wú)對(duì)應(yīng)條帶(圖 2)。

表1 正交實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果

表2 3因素各水平邊際均值 mg/L

圖 2 重組菌表達(dá)的 UreB蛋白W estern blot的結(jié)果

3 討論

乳酸菌作為益生菌,在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)醫(yī)藥等領(lǐng)域與人類生活密切相關(guān)。L.lactis是乳酸菌類的一個(gè)屬,近年來(lái)作為一種新型表達(dá)系統(tǒng)成功地表達(dá)了多種外源基因,顯示了很大的發(fā)展?jié)摿?。已有不少的保護(hù)性抗原在乳酸菌中表達(dá),Lee等[9]用L.lactis表達(dá)系統(tǒng)表達(dá) UreB,能夠激發(fā)小鼠的免疫應(yīng)答; Kim等[10]也在L.lactisMG1363中表達(dá)了H.pyloricag12基因,以口服方式免疫小鼠并產(chǎn)生了相應(yīng)的免疫保護(hù)作用。但是構(gòu)建的這些表達(dá)系統(tǒng)均用抗生素抗性基因?yàn)楹Y選標(biāo)記,存在潛在的生物危害,不能廣泛應(yīng)用。因此需要研發(fā)完全的食品級(jí)的表達(dá)載體。目前利用最廣泛的表達(dá)系統(tǒng)是 N I CE(Nisincontrolled expression)系統(tǒng)。該系統(tǒng)中誘導(dǎo)劑 nisin作用于蛋白激酶 nisK基因,隨后通過(guò)磷酸化激活反應(yīng)蛋白 nisR基因,產(chǎn)生的激活蛋白誘導(dǎo)位于 nis A啟動(dòng)子后的目的基因表達(dá)[8]。

該研究采用的宿主菌NZ3900含有 nisK和 nisR基因,表達(dá)載體 pNZ8149含有 nis A啟動(dòng)子。pNZ8149的 nis A啟動(dòng)子的起始密碼子 ATG處有NcoⅠ酶切位點(diǎn),這樣使插入的目的基因與啟動(dòng)子nis A的核糖體結(jié)合位點(diǎn) (SD)區(qū)域構(gòu)成翻譯融合,較轉(zhuǎn)錄融合表達(dá)具有更高的表達(dá)活性[11]。表達(dá)載體pNZ8149含有 lacF基因,轉(zhuǎn)化入 lacF基因缺失的宿主菌NZ3900中,使原來(lái)不能利用乳糖的NZ3900可以發(fā)酵乳糖并產(chǎn)酸;引起周圍 pH值降低,使篩選培養(yǎng)基中的溴甲酚紫由紫色變?yōu)辄S色。這種利用乳糖為選擇標(biāo)記的表達(dá)系統(tǒng),所有的元件都是食品級(jí)的,因此口服具有安全性。

誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)和誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間是影響目的蛋白表達(dá)的主要因素,通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析可以看出,誘導(dǎo)的時(shí)機(jī)最為重要,應(yīng)在菌體達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)(D600nm為 0.40～0.60)加入適量的誘導(dǎo)劑進(jìn)行培養(yǎng),目的蛋白 UreB的最高產(chǎn)量為12.900 mg/L,占總蛋白的 7%左右。

總之,作者成功構(gòu)建了 ureB的乳酸乳球菌食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng),并表達(dá)了UreB蛋白,經(jīng)Western blot反應(yīng)證明,表達(dá)的UreB蛋白有很好的免疫反應(yīng)性。H.pylori的免疫保護(hù)途徑主要來(lái)自黏膜免疫,乳球菌與M細(xì)胞吸收的生物可降解微粒大小相近,能有效激發(fā)黏膜免疫反應(yīng)[12]。因此口服的食品級(jí)乳酸乳球菌表達(dá)載體在H.pylori疫苗的研發(fā)中有重要的前景。

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Food-grade expression ofhelicobacter pyloriureB gene inLactococcus lactisand optimization for its expression conditions

CHEN Shuaiyin1),ZHANG Rongguang2),FAN Q ingtang1),DUAN Guangcai1)1)Departm ent of Epidem iology,College of Public Health,Zhengzhou University;Henan Key Laboratory of M olecularM edicine,Zhengzhou 4500012)Departm ent of Parasitology,College of B asicM edical Sciences, Zhengzhou University,Zhengzhou 450001

Helicobacter pylori;urease subunitB gene;Lactococcus lactis;food-grade expression vector;condition optimization

Ai m:To construct food-grade expression system ofHelicobacter pylori(H.pylori)urease subunitB(UreB) in Lactococcus lactis(L.lactis)using lacF selective marker.Methods:The ureB gene was obtained from the recombinant vector of pMD19-T-ureB by enzyme digestion,and then inserted into pNZ8149 food-grade expression vector.lacF as foodgrade selection for growth on lactose.Then the recombinant plasmid pNZ8149-ureB was electrotransformed intoL.lactisNZ3900.The recombinant protein was detected by SDS-PAGE andWestern blot.Orthogonal design was used to optimize the expression conditions of UreB.Results:Western blot demonstrated that the UreB protein was expressed in theL.lactistransfor mant.The optimized conditionswere determined as follows:induction of expression was carried out at the cells density ofD600nm≈0.40 with 25μg/L nisin,and harvest after5 h.As a result,themaximum yield ofUreB was esti mated to be 7%of total soluble cellular proteins.Conclusion:The food-grade expression vector system of UreB has been constructed and the optimized expression conditions have been obtained. 1983年澳大利亞科學(xué)家Warren和Marshall首次從胃上皮細(xì)胞中分離出幽門螺桿菌 (Helicobacter pylori,H.pylori)[1]。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查[2],全世界成人約 50%攜帶H.pylori,其是慢性胃炎、胃和十二指腸消化性潰瘍的主要病因[3-4]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)了多種H.pylori的有效保護(hù)性抗原成分,如尿素酶 B (UreB)、HspA、Omp11和 CagA[5-6]等。目前對(duì)H. pylori疫苗的研究常以減毒沙門氏菌作為活菌載體,但活的減毒沙門氏菌在人體及動(dòng)物體內(nèi)仍有一定的毒性,故不能用于體質(zhì)弱的群體如嬰幼兒、年老者及免疫缺陷者。以乳酸乳球菌 (Lactococcus lactis,L. lactis)作為活菌疫苗載體,可以避免以上問(wèn)題。作者以L.lactis為宿主菌構(gòu)建H.pyloriUreB的食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng),并用正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行表達(dá)條件的優(yōu)化,以獲得食品級(jí)的H.pylori活菌疫苗。

R183

＊中國(guó)博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目 20070410252

(2010-04-28收稿 責(zé)任編輯徐春燕)