鐘志超,范洪領(lǐng),尹金寶,鄭原印,許黎娟,常全忠

遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)生理學(xué)教研室珠海 519041

#通訊作者,男,1965年12月生,博士,教授,研究方向:神經(jīng)生物學(xué),E-mail:cqzchang@tom.com

在缺血性腦損傷和多種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中,腦細(xì)胞的程序性死亡是腦功能退化和損傷的主要誘因[1]。目前對(duì)缺血性腦損傷后神經(jīng)元程序性死亡的機(jī)制尚不完全清楚。研究[2]發(fā)現(xiàn),腦缺血后海馬CA1錐體細(xì)胞膜的興奮性持續(xù)降低是觸發(fā)遲發(fā)性神經(jīng)元死亡的一個(gè)重要因素,這種興奮性的改變可能與氯通道的活動(dòng)增強(qiáng)有關(guān)。陰離子通道阻斷劑DIDS對(duì)容積敏感性氯通道有明顯的阻斷效應(yīng)并具有明顯的抗凋亡作用,且具有劑量依賴性[3-4]。對(duì)氯通道在缺血缺氧性神經(jīng)元凋亡中的作用目前報(bào)道較少。作者利用NO誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元損傷,觀察神經(jīng)元膜氯通道電流的變化及氯通道抑制劑 4-乙酰氨基-4'-異氰酸芪-2,2'-二磺酸(SITS)對(duì)電流的影響,探討氯通道與缺血缺氧性腦神經(jīng)元凋亡之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和試劑 新生1 d的SD大鼠由遵義醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;DMEM/Ham's F12培養(yǎng)基以及多聚賴氨酸(PLL)、阿糖胞苷、SITS、3-嗎啉斯德酮胺(SIN-1)等試劑購自美國(guó)Sigma公司;胎牛血清(杭州四季青公司)。

1.2 大鼠海馬神經(jīng)元的培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)[5]取出生1 d內(nèi)的SD大鼠,雌雄不拘,無菌斷頭取腦,在冰冷D-Hank's液里分離雙側(cè)海馬,剪成約1 mm3小塊,2.5 g/L胰蛋白酶37℃消化15 min,加基礎(chǔ)培養(yǎng)基終止消化,機(jī)械吹打分散細(xì)胞,500目篩網(wǎng)過濾,制成單細(xì)胞懸液,1 000 r/min室溫離心10 min,去上清液,加完全培養(yǎng)基,吹打分散細(xì)胞后制成 4× 108L-1的單細(xì)胞懸液,接種在預(yù)先包被有 PLL的培養(yǎng)板內(nèi),于體積分?jǐn)?shù)95%O2、5%CO2,37℃飽和濕度下培養(yǎng),培養(yǎng)液中含有體積分?jǐn)?shù)90%DMEM/ F12、體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺以及1×105U/L青、鏈霉素。接種 48 h后更換培養(yǎng)液,同時(shí)加入1×10-5mmol/L阿糖胞苷作用48 h,以抑制膠質(zhì)細(xì)胞的過度增殖。以后每 3 d更換培養(yǎng)液 1次,每次更換原液體的 1/3。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理 取培養(yǎng) 12 d的海馬神經(jīng)元,隨機(jī)分為正常對(duì)照組、SIN-1處理組和SIN-1處理后加SITS組(SITS組)。SIN-1的作用終濃度是1.0mmol/L,作用時(shí)間是18 h,SITS(0.5mmol/L)的作用時(shí)間是18 h。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用Hoechst33258 DNA熒光染色法。取各組培養(yǎng)神經(jīng)元,用0.1 mol/L pH 7.4的PBS沖洗1次,40 g/L多聚甲醛固定15 min,空氣干燥5 min,DNA熒光素Hoechst33258染色15 min,用0.1mol/L pH 7.4的PBS沖洗2次,倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核形態(tài),每次數(shù) 3個(gè)高倍視野內(nèi)200個(gè)細(xì)胞,計(jì)算細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 6次。

1.5 氯通道電流的檢測(cè) 采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù),所需的主要液體配制方法如下。標(biāo)準(zhǔn)電極外液(SES):NaCl 110 mmol/L,CdCl22.0 mmol/L, EGTA 0.1 mmol/L,TEA-Cl 5.0 mmol/L,D-glucose 10mmol/L,HEPES 10 mmol/L,TTX 0.1μmol/L。用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.3～7.4。標(biāo)準(zhǔn)電極內(nèi)液(SIS):TEA-Cl 115 mmol/L,Na2-ATP 2.0 mmol/L, EGTA 1.0 mmol/L,MgCl21.0 mmol/L,CaCl21.0 mmol/L,D-glucose 10 mmol/L,HEPES 10 mmol/L。調(diào)節(jié)pH至7.3～7.4。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0進(jìn)行分析,3組間神經(jīng)元凋亡率的比較用單因素方差分析,兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)觀察 見圖1。對(duì)照組神經(jīng)元胞核呈卵圓形,熒光顯微鏡下呈均勻的藍(lán)色熒光。SIN-1組神經(jīng)元大量凋亡,凋亡的神經(jīng)元皺縮或變圓、染色質(zhì)濃集或斷裂或出現(xiàn)凋亡小體,呈強(qiáng)亮的藍(lán)色熒光。SITS組凋亡神經(jīng)元明顯少于SIN-1組。凋亡率測(cè)定結(jié)果見表 1。

圖1 3組離體培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)變化(DNA熒光染色,×400)

表1 各組神經(jīng)元凋亡率比較 %

2.2 3組海馬神經(jīng)元氯通道電流檢測(cè)結(jié)果 正常情況下氯通道電流隨膜的逐漸去極化由負(fù)值向正值變化,從膜電壓-100 mV的(-8.19±1.92)A/F升到膜電壓+80 mV的(22.46±1.50)A/F,變化趨勢(shì)呈外向整流特性,膜反轉(zhuǎn)電位約為-70 mV,大致接近氯離子的膜平衡電位;膜電流的變化呈電壓依賴性,與時(shí)間關(guān)系不大。浴槽液中加SIN-1(終濃度為1.0 mmol/L)作用10～15min可增加海馬神經(jīng)元氯通道電流密度,從-100 mV的(1.46±0.20) A/F增加到+80 mV時(shí)的(23.22±1.89)A/F。SITS(0.5mmol/L)在浴槽液中作用5min能部分阻斷通道電流(圖2)。

圖2 3組海馬神經(jīng)元氯通道電流檢測(cè)結(jié)果A:電壓變化曲線;B:電壓-電流密度曲線;1:對(duì)照組;2:SIN-1組;3:SITS組。

3 討論

缺血性腦損傷會(huì)引起腦內(nèi) NO的過量產(chǎn)生而引起毒性損傷作用。為模擬缺血性腦損傷神經(jīng)元凋亡,作者用NO供體SIN-1誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。用DNA熒光試劑對(duì)核染色,結(jié)果顯示,正常離體培養(yǎng)12 d的海馬神經(jīng)元胞核光滑,呈卵圓形,熒光顯微鏡下呈淡藍(lán)色熒光;SIN-1(1.0mmol/L)作用18 h,神經(jīng)元胞核濃縮、變小,折射出強(qiáng)亮的藍(lán)色熒光,凋亡率明顯升高。提示使用SIN-1誘發(fā)缺血性腦神經(jīng)元凋亡模型可靠。0.5mmol/L的SITS可明顯減少凋亡率,提示氯通道的活動(dòng)可能參與了這種類型的神經(jīng)元凋亡的發(fā)生。

氯通道在缺血性神經(jīng)元凋亡中的作用國(guó)內(nèi)外報(bào)道甚少。有報(bào)道[6],是氯離子而不是鉀離子參與了神經(jīng)元凋亡的過程。在NMDA誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡模型中,氯通道阻斷劑SITS和DIDS均可明顯減少神經(jīng)元的凋亡率[7]。作者利用全細(xì)胞膜片鉗記錄模式觀察了在SIN-1處理前后、氯通道阻斷劑使用前后氯通道全細(xì)胞電流密度的變化。結(jié)果顯示:SIN-1處理神經(jīng)元后能明顯增加氯通道的電流密度,這些電流的增加幾乎被氯通道阻斷劑SITS所阻斷,證實(shí)氯通道可能參與了SIN-1誘導(dǎo)的缺血性海馬神經(jīng)元的凋亡。提示:在缺血性腦損傷中,腦內(nèi)過量產(chǎn)生的NO可激活神經(jīng)元上的氯通道,氯通道的活動(dòng)增強(qiáng)可能參與了缺血性腦神經(jīng)元的凋亡過程。氯通道是通過什么機(jī)制參與缺血性神經(jīng)元的凋亡過程有待于進(jìn)一步研究。

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