孔曉明，劉勇

蚌埠醫(yī)學院微生物學教研室，安徽省感染與免疫重點實驗室，蚌埠 233030

自然殺傷T細胞(natural killer T cell，NKT細胞)是一類介導天然免疫和獲得性免疫的免疫細胞，它們既表達T細胞受體(T cell receptor，TCR)，又表達NK細胞表面標記CD161(NK1.1)。NKT細胞能特異性識別非經(jīng)典的主要組織相容性復合物(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ類樣分子CD1d呈遞的脂類抗原和蛋白質(zhì)抗原，活化后的NKT細胞能同時分泌T輔助細胞1(T helper cell type 1，Th1)和Th2兩類細胞因子，包括白細胞介素2(interleukin 2，IL-2)、IL-4、γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)等，同時激活下游多種其他免疫細胞，如樹突細胞(dendritic cell，DC)、NK細胞、巨噬細胞、T細胞等，進而調(diào)節(jié)機體多種免疫效應[1]。大量研究表明，NKT細胞在抗胞內(nèi)菌的感染免疫中發(fā)揮著重要作用。

1 NKT細胞的生物學特征

1.1 NKT細胞的分型

NKT細胞可分為Ⅰ～Ⅲ型：Ⅰ型NKT細胞大部分屬CD4+和CD4-CD8-一類，主要特征為CD1d限制性，TCR多樣性有限，只表達1條恒定的Vα14-Jα18鏈(小鼠)或Vα24-Jα18鏈(人)和1條Vβ鏈﹝包括Vβ8.2、Vβ7、Vβ2(小鼠)和Vβ11(人)﹞；Ⅱ型NKT細胞也表現(xiàn)為CD1d限制性，但表達多種TCR Vα鏈；Ⅲ型NKT細胞是CD1d非依賴性的，表達多種TCR Vα鏈，也稱NKT樣細胞[1]。

1.2 NKT細胞的檢測方法

目前對NKT細胞表型的確定仍存有爭議。常借助NK細胞譜系標記(小鼠為NK1.1，人為CD161)及TCRα/β共表達來界定NKT細胞。常用CD161(人)與TCRα/β共表達、NK1.1(僅C57BL/6小鼠表達)與TCRα/β共表達、DX5(NK1.1-小鼠)與TCRα/β共表達來標記。CD1d四聚體的出現(xiàn)對 Ⅰ 型和 Ⅱ 型NKT細胞的研究起了極好的推動作用。α-半乳糖神經(jīng)酰胺 (α-galactosylceramide，α-GalCer)分子是目前與NKT細胞結合效能最強的糖脂抗原，能最大限度刺激NKT細胞產(chǎn)生Th1及Th2細胞因子[2]。應用此糖脂及CD1d建立的CD1d四聚體技術已成為目前檢測NKT細胞的“金標準”[3]。但Ⅲ型NKT細胞即NKT樣細胞，是CD1d非依賴性的，目前多采用DX5與TCRα/β共表達來界定。

1.3 NKT細胞的活化機制

不同于傳統(tǒng)的T細胞，NKT細胞的活化可能有2條途徑[4]：①直接識別微生物的脂類抗原，類似于傳統(tǒng)的MHC限制性T細胞的活化模式，即NKT細胞的TCR識別抗原呈遞細胞表面CD1d呈遞的微生物脂類抗原，如大腸埃希菌的磷酯酰乙醇胺、結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)的脂阿拉伯甘露糖等，經(jīng)信號轉導通路直接被活化。②微生物抗原間接刺激模式，即微生物抗原誘導宿主產(chǎn)生某些因子(如IL-12、IL-18等)，這些因子能與NKT細胞表面的細胞因子受體結合，活化NKT細胞。有時該途徑也同時需要CD1d呈遞糖脂類抗原對TCR進行激活。陳鈺等[5]研究發(fā)現(xiàn)，超抗原金黃色葡萄球菌腸毒素B(staphylococcal enterotoxin B，SEB)也能活化NKT細胞，活化的NKT細胞亞群主要是CD8+NK1.1+和TCRVβ8+NK1.1+。

2 NKT細胞抗胞內(nèi)菌感染的免疫應答作用

胞內(nèi)菌分為兼性胞內(nèi)菌和專性胞內(nèi)菌2類。兼性胞內(nèi)菌進入機體后主要在胞內(nèi)寄居、繁殖；在體外，又能在無生命的培養(yǎng)基中生長。此類細菌有結核分枝桿菌、牛分枝桿菌、傷寒沙門菌(Salmonellatyphi)、布魯桿菌(Brucellasp.)、肺炎軍團菌(Legionellapneumonia)、產(chǎn)單核細胞李斯特菌(Listeriamonocytogenes，LM)等，多引起慢性感染。專性胞內(nèi)菌包括立克次體、柯克斯體、衣原體等，只能在活細胞內(nèi)生長、繁殖。機體抵抗胞內(nèi)菌感染以細胞免疫為主。大量動物實驗研究表明，NKT細胞在多種胞內(nèi)菌感染中發(fā)揮抗感染作用[6]。

2.1 胞內(nèi)菌與NKT細胞的活化

大量研究表明，胞內(nèi)菌能活化NKT細胞。如傷寒沙門菌細胞壁上的脂多糖[7]與DC共培養(yǎng)，能誘導NKT細胞分泌IFN-γ。該過程需DC表達的Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR-4)、IL-4和CD1d參與，表明DC產(chǎn)生的IL-12能與NKT細胞表面的細胞因子受體結合，增強NKT細胞活化。大腸埃希菌脂多糖[8]活化NKT細胞只需IL-12和IL-18存在，而不需CD1d的呈遞。LM通過改變DC和巨噬細胞表面CD1d的表達來活化NKT細胞，該過程需由IFN-β介導[9]。

研究發(fā)現(xiàn)，NKT細胞可識別分枝桿菌并產(chǎn)生相應的免疫應答效應。因為分枝桿菌細胞壁的脂類和磷酯酰膽堿甘露糖苷能激活NKT細胞，分泌IFN-γ的CD4-CD8-NKT細胞還可通過釋放抗微生物的肽段(溶菌素)直接發(fā)揮抗分枝桿菌的作用[10]。傷寒沙門菌細胞壁上的脂多糖也能活化NKT細胞。

2.2 NKT細胞活化后發(fā)揮的抗感染能力

活化后的NKT細胞具有免疫調(diào)節(jié)功能，通過產(chǎn)生大量的IL-4、IFN-γ、IL-10、IL-13等細胞因子，或通過細胞間直接接觸的方式，作用于NK細胞、B細胞、DC和T細胞，從而調(diào)節(jié)整個免疫網(wǎng)絡。

Berntman等[11]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠口服感染沙門菌5 d后，NKT細胞活化，參與早期免疫應答。其中分泌IFN-γ(發(fā)揮抗感染、抗腫瘤等機體保護功能)的CD4-CD8-NKT細胞增多，分泌IL-4(參與免疫調(diào)節(jié)，改善自身免疫性疾病的癥狀)的CD4+NKT細胞減少。Sada-Ovalle等[10]用感染結核分枝桿菌的巨噬細胞與清潔級C57BL/6小鼠的脾臟共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)上清液中IFN-γ分泌增加，且培養(yǎng)液中細菌減少。實驗表明，結核分枝桿菌感染的巨噬細胞能激活NKT細胞，活化后的NKT細胞能抑制結核分枝桿菌的復制，通過分泌IFN-γ識別并殺傷感染細胞。已證實，活化與未活化的NKT細胞均能保護宿主，抵抗結核分枝桿菌。Chiba等[12]發(fā)現(xiàn)，給予C57BL/6小鼠尾靜脈注射卡介苗(bacillus Calmette-Guerin，BGG)感染后，肝臟和脾臟的NKT細胞可活化(CD69表達上調(diào)，但NK1.1+NKT細胞減少)，分泌IFN-γ。該實驗采用BrdU方法(淋巴細胞增生試驗)發(fā)現(xiàn)，在BCG感染早期(感染9 d內(nèi))，NKT細胞被激活并增殖；感染9 d后自適應性應答出現(xiàn)，NKT細胞開始衰落，通過Fas-FasL信號轉導途徑發(fā)生凋亡。Venkataswamy等[13]將NKT細胞活化劑α-GalCer注入到活的BCG中，發(fā)現(xiàn)α-GalCer-BCG能刺激DC成熟，并顯著增強特有的CD8+T細胞反應，從而提高疫苗抗結核分枝桿菌的免疫保護效應。

Emoto等[14]給予C57BL/6小鼠α-GalCer或?qū)φ找禾幚? d后，再通過腹腔注射LM感染1 h，檢測腹腔、肝臟和脾臟中菌落形成單位(colony-forming unit，CFU)發(fā)現(xiàn)，α-GalCer能通過激活器官(不是腹腔)中的NKT細胞產(chǎn)生IFN-γ，從而加強巨噬細胞的殺菌和噬菌作用，減輕LM感染。Emoto等[15]發(fā)現(xiàn)，給予感染LM的小鼠α-GalCer后，大量骨髓來源的Gr-1+(粒細胞譜系標記)細胞及少量的γδ T細胞會迅速滲入肝臟，從而發(fā)揮強大的抗LM感染作用。

2.3 NKT細胞活化后表型特征的改變

大量研究發(fā)現(xiàn)，NKT細胞活化后，表面NK1.1分子表達下調(diào)，TCRα/β表達也下調(diào)，下調(diào)的原因尚未明確。

Emoto等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在LM感染早期階段，NK1.1+NKT細胞顯著下降，NK1.1-NKT細胞顯著上升，以分泌IFN-γ為主。研究認為,NK1.1+細胞是NK1.1-細胞的前體，NK1.1的丟失是為了清除抗原感染的細胞。

Emoto等[17]研究還發(fā)現(xiàn)，LM感染的肝臟NKT細胞表面NK1.1分子表達發(fā)生改變。在感染第4天，NK1.1分子表達下降；感染16 d后，NK1.1分子表達恢復到感染前水平。檢測胞質(zhì)TCRα/β(cTCRα/β)和細胞表面TCRα/β(sTCRα/β)發(fā)現(xiàn)，LM感染后NKT細胞的“丟失”很可能是因為TCRα/β的丟失或凋亡，但在LM感染的小鼠NK1.1+和NK1.1-NKT細胞群中檢測不到活化的半胱天冬氨酸酶3(Caspase-3)[17]。

Werner等[18]比較了NK1.1-BALB/c小鼠肝臟和脾臟的DX5+NKT細胞在表型和功能上的差異發(fā)現(xiàn)，NKT細胞活化后，會發(fā)生典型的TCRα/β表達下調(diào)及CD178(啟動死亡信號轉導的Fas分子的配體)表達上調(diào)。

2.4 活化后的NKT細胞——連接天然免疫與獲得性免疫的橋梁

活化后的NKT細胞幾乎對所有血細胞，包括NK細胞、DC、B細胞及T細胞均有作用，因此活化的NKT細胞是連接天然免疫與獲得性免疫的橋梁[19]。

Joyee等[20]將衣原體感染Jα18-/-基因敲除小鼠與野生型小鼠后，比較CD8α+DC與NKT細胞共培養(yǎng)后的IFN-γ產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)活化后的NKT細胞會優(yōu)先調(diào)節(jié)CD8α+DC的功能，從而引發(fā)天然免疫反應。Choi等研究發(fā)現(xiàn)，在LM靜脈注射初次感染過程中，肝臟和脾臟的NKT細胞在感染第1天就被活化，表現(xiàn)為CD69表達上調(diào)；在感染第8天，通過分泌細胞因子(如IFN-γ、IL-12)，誘導適應性免疫反應，表現(xiàn)為傳統(tǒng)性T細胞增加[21]。Fujii等[22]發(fā)現(xiàn)，NKT細胞被激活后，會激活下游的DC和NK細胞。DC會誘導NKT細胞持久分泌IFN-γ；而活化后的NKT細胞，其CD40表達上調(diào)，能通過CD40-CD40L的相互作用促使DC成熟，從而分泌IL-12，上調(diào)聯(lián)合刺激分子，誘導適應性免疫捕獲胞內(nèi)抗原，以及延長聯(lián)合CD4和CD8 T細胞免疫殺菌作用。

3 結語

含有糖脂類抗原的胞內(nèi)菌，如大腸埃希菌和結核分枝桿菌，可直接活化NKT細胞；其他不含有糖脂類抗原的胞內(nèi)菌，可通過誘導宿主產(chǎn)生某些因子(如IL-12)與NKT細胞表面的細胞因子受體結合，增強NKT細胞的活化?；罨蟮腘KT細胞經(jīng)分泌多種細胞因子發(fā)揮天然免疫反應，并激活下游多種其他免疫細胞，如DC、NK細胞、巨噬細胞、T細胞等，進而調(diào)節(jié)機體多種免疫效應。對活化后的NKT細胞表面TCRα/β和NK1.1的“丟失”機制尚需進一步研究。

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