楊振軍，宋成軍，陳志宏

（承德醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，河北承德 067000）

糖尿病大鼠腎臟VEGF表達(dá)的變化及絲膠的保護(hù)作用

楊振軍，宋成軍，陳志宏

（承德醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，河北承德 067000）

目的:觀察糖尿病大鼠腎臟血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF）蛋白表達(dá)的變化及絲膠的保護(hù)作用。方法:48只雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組(每組12只）：正常對照組、糖尿病模型組、絲膠治療組和絲膠預(yù)防組。分別采用免疫組化染色和Western Blotting法觀察腎臟VEGF蛋白的表達(dá)。結(jié)果:與正常對照組大鼠相比，模型組大鼠腎臟VEGF蛋白的表達(dá)明顯升高(P＜0.01）；絲膠治療組、絲膠預(yù)防組大鼠腎臟VEGF蛋白的表達(dá)明顯低于模型組(P＜0.01）。結(jié)論:絲膠可通過下調(diào)腎臟VEGF蛋白的表達(dá)發(fā)揮對糖尿病大鼠腎臟損傷的保護(hù)和預(yù)防保護(hù)作用。

絲膠；糖尿??；腎臟；VEGF

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組 清潔級雄性SD大鼠48只，購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證號：712024）。大鼠隨機(jī)分為4組：正常對照組、模型組、絲膠治療組和絲膠預(yù)防組，每組12只。模型組、絲膠治療組和絲膠預(yù)防組大鼠均采用2% STZ(25mg/kg，3d）連續(xù)腹腔注射建立糖尿病動(dòng)物模型，一周后以血糖≥16.7mmol/L作為成模標(biāo)準(zhǔn)。待模型成功建立后，模型組大鼠不再作任何處理；絲膠治療組大鼠給予絲膠(2.4g/kg/d）灌胃，連續(xù)35天；絲膠預(yù)防組大鼠于注射STZ前給予同等劑量絲膠灌胃35天。

1.2 藥物與試劑 STZ購于美國Sigma公司，臨用時(shí)用PH4.4的枸櫞酸鈉-枸櫞酸緩沖液配成2%的溶液。絲膠由彩色蠶繭經(jīng)浸泡、水煎、過濾、濃縮而成，彩色蠶繭由承德醫(yī)學(xué)院蠶業(yè)研究所提供。血糖檢測試劑盒，保定長城臨床試劑有限公司；鼠抗VEGF抗體，美國Santa公司(購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒，北京泰格美科技有限公司。

1.3 檢測血糖 各組大鼠禁食12h以上，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)內(nèi)眥于眶后靜脈叢采血，3000r/min離心20min，收集血清，采用葡萄糖氧化酶法檢測血糖。

1.4 腎臟VEGF蛋白表達(dá)的檢測 各組大鼠取血后斷頭處死，迅速取雙側(cè)腎臟，一側(cè)腎臟投入液氮中冷凍，后移入-80℃冰箱保存，用于Western Blotting檢測；另一側(cè)腎臟入Bouins液固定，用于免疫組化染色。

1.4.1 免疫組化染色及定量分析：入Bouins液固定腎臟，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚5μm。采用免疫組織化學(xué)染色法觀察腎臟VEGF蛋白的表達(dá)。一抗為鼠抗，稀釋濃度1：50，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。以PBS代替一抗作為陰性對照，以胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)對免疫組化染色陽性結(jié)果進(jìn)行定量分析：VEGF陽性切片在高倍顯微鏡下(×400）選取視野，計(jì)算陽性產(chǎn)物面積占視野面積的百分比。每只動(dòng)物任選3張切片，每張切片選取3個(gè)視野，取平均值。

1.4.2 Western Blotting檢測及定量分析：取200mg腎臟組織，提取蛋白，BCA蛋白試劑盒定量蛋白濃度。采用Western Blotting方法檢測大鼠腎臟組織VEGF蛋白的表達(dá)，蛋白上樣量為60μg。12% SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜；一抗稀釋濃度為1：200，4℃過夜；Super ECL Plus超敏發(fā)光液顯影。采用Quantiy One軟件對顯影條帶進(jìn)行分析，以VEGF條帶與β-actin條帶的灰度比值作為VEGF蛋白的相對表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血糖 與正常對照組大鼠相比，模型組大鼠的血糖明顯升高(P＜0.01）。絲膠治療組、絲膠預(yù)防組大鼠的血糖明顯低于模型組(P＜0.01）。見附表。

2.2 腎臟VEGF蛋白的表達(dá) 免疫組化染色：VEGF蛋白陽性產(chǎn)物位于腎小球細(xì)胞胞漿，呈棕黃色細(xì)膩顆粒狀，定量分析結(jié)果見附表；Western Blotting結(jié)果：見附表。模型大鼠腎臟VEGF蛋白的表達(dá)明顯高于正常對照組大鼠(P＜0.01）；絲膠治療組、絲膠預(yù)防組大鼠腎臟VEGF蛋白的表達(dá)明顯低于模型大鼠(P＜0.01）。

附表 各組大鼠血糖和腎臟VEGF蛋白的表達(dá)（±s，n=12）

附表 各組大鼠血糖和腎臟VEGF蛋白的表達(dá)（±s，n=12）

與正常組比較:*P＜0.01，與模型組比較:＃P＜0.01

組別 血糖(mmol/L) VEGF免疫組化 Western Blotting正常對照組 10.83±2.03 0.0313±0.0079 0.651±0.095模型組 29.45±4.82* 0.0425±0.0076* 0.863±0.091*絲膠治療組 13.20±4.09＃ 0.0314±0.0062＃ 0.653±0.074＃絲膠預(yù)防組 11.04±2.29＃ 0.0317±0.0082＃ 0.660±0.098＃

3 討論

VEGF又稱血管通透因子，在腎臟主要由足突細(xì)胞產(chǎn)生。DM時(shí)，AGEs增多、PKC活化、各種細(xì)胞因子的增加和腎素-血管緊張素系統(tǒng)的激活均可上調(diào)腎臟VEGF的表達(dá)[4]。在DN早期，腎組織VEGF的表達(dá)即增加，并且VEGF可能通過自分泌或旁分泌方式增加腎小球毛細(xì)血管的通透性，導(dǎo)致DN早期蛋白尿的產(chǎn)生；在DN中晚期，VEGF可能通過某些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)，與其它細(xì)胞因子共同促使蛋白尿形成；另外，VEGF還可特異作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過增加微小靜脈的通透性導(dǎo)致蛋白尿的產(chǎn)生[5-6]。大量的蛋白尿反過來可通過多種途徑引發(fā)腎小球進(jìn)行性硬化和腎間質(zhì)纖維化，從而使DN進(jìn)一步發(fā)展和惡化，導(dǎo)致終末期腎病的發(fā)生。此外，VEGF還可能通過誘發(fā)FN等細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，促使腎小球硬化、腎小管基底膜增厚和腎間質(zhì)纖維化，從而在DM腎臟肥大及硬化中發(fā)揮重要作用[6]。

目前治療糖尿病多采用一些化學(xué)合成的藥物(如二甲雙胍、西他列汀、拜糖平等），雖然療效可靠但副作用較大。即使是公認(rèn)的經(jīng)典首選藥物—雙胍類，在降糖的同時(shí)，易引起乳酸性酸中毒，死亡率較高[7]。絲膠是蠶絲中包被在絲素外圍的高分子水溶性蛋白，約占繭絲的30%，主要由18種氨基酸組成，以往對蠶絲的研究主要集中在絲素，絲膠多作為廢料遺棄，如此大量優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的有效利用一直是蠶絲界迫切希望的。

本研究發(fā)現(xiàn)，絲膠治療組、絲膠預(yù)防組大鼠腎臟VEGF蛋白的表達(dá)明顯低于模型組。表明，絲膠可通過下調(diào)VEGF的表達(dá)，改善DN時(shí)腎小球毛細(xì)血管的通透性、緩解基膜增厚，減輕細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，延緩DN的發(fā)展；同時(shí)，絲膠預(yù)處理可阻止DN時(shí)VEGF的高表達(dá)，從而防止DN時(shí)腎小球毛細(xì)血管通透性的改變和細(xì)胞外基質(zhì)沉積。并且，由于絲膠是天然的蛋白質(zhì)，具有生物相容性，可生物降解，對人體無毒性[8]，避免了化學(xué)合成藥物帶給人體的副作用，因此具有良好的應(yīng)用推廣前景。

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CHANGES OF VEGF EXPRESSION IN KIDNEY OF DM RATS AND PROTECTIVE EFFECTS OF SERICINE

YANG Zhen-jun, SONG Cheng-jun, CHEN Zhi-hong
(Department of Human Anatomy, Chengde Medical College, Chengde 067000, China)

Objective:To observe the changes of vascular endothelial growth factor (VEGF) in kidney of diabetes mellitus (DM) rats and protective effects of sericine.Methods:48 male SD rats were randomly divided into 4 groups (n=12): normal control group, DM model group, sericine treatment group and sericine prevention group. Immunohistochemical staining and Western Blotting were respectively used to observe the expression of VEGF protein in kidney.Results:Compared with normal control rats, the VEGF expression in kidney of rats in model group increased obviously(P＜0.01). VEGF expression in kidney of rats in sericine treatment group and sericine prevention group were significantly lower than that of model group(P＜0.01).Conclusions:Sericine has protective and preventive effects on kidney injury of DM rats by down regulating VEGF expression.

Sericine; Diabetes mellitus; Kidney; VEGF糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN）是糖尿病(diabetes mellitus，DM）常見的嚴(yán)重微血管并發(fā)癥，是引起慢性腎功能不全進(jìn)而導(dǎo)致透析治療或腎臟移植的重要原因之一[1-2]。DN的發(fā)病機(jī)制目前仍不十分清楚，長期高血糖是DN發(fā)生的最關(guān)鍵原因，毛細(xì)血管功能改變和新生血管形成是DN的重要病理特征。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種有效的血管形成和血管通透性誘導(dǎo)因子，屬于促血管生長因子[3]。有研究表明，VEGF在DN的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。本研究采用鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ）致糖尿病大鼠模型，觀察絲膠對糖尿病大鼠腎臟VEGF表達(dá)的作用，探討絲膠對DM大鼠腎臟的保護(hù)作用及機(jī)制。

R587.2

A

1004-6879(2011）02-0119-03

2010-09-28）