郭江鵬,潘建忠,李發(fā)弟,2＊ ,郝正里,馬友記,張元興,李海靜,馬騰

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院,甘肅 蘭州730070;2.甘肅省飼料工程技術(shù)研究中心,甘肅 蘭州730070)

瘤胃、網(wǎng)胃和瓣胃構(gòu)成的前胃是反芻動物特有的消化器官,是其進行微生物消化和物理消化的主要場所[1]。反芻動物前胃的正常發(fā)育,除受種別、年齡和體重影響外,還有若干因子影響其功能發(fā)育,而飼糧組成及形態(tài)、飼養(yǎng)管理模式等因素最為重要[2]。研究表明,犢牛前胃結(jié)構(gòu)和生理功能的發(fā)育在很大程度上是采食飼料及其代謝產(chǎn)物影響的結(jié)果[3,4];犢牛采食飼料可促進胃部肌肉組織發(fā)育,提高瘤胃的蠕動水平及揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acids,VFA)的產(chǎn)生和吸收水平[5];碳水化合物可在瘤胃微生物及其分泌的復合酶和代謝產(chǎn)物的作用下逐步降解成單糖被瘤胃微生物利用,并轉(zhuǎn)化為VFAs(特指各種揮發(fā)性脂肪酸,而VFA一般是對揮發(fā)性脂肪酸的統(tǒng)稱)等物質(zhì),為反芻動物新陳代謝過程提供能源[6]。以瘤胃內(nèi)容物的pH值、VFAs的摩爾組成比例作為研究瘤胃發(fā)酵的主要內(nèi)環(huán)境指標,基本上可以反映瘤胃的內(nèi)部環(huán)境狀況及飼料在瘤胃內(nèi)的發(fā)酵程度和模式[7,8]。反芻動物瘤胃黏膜不分泌任何酶,其中的酶由微生物分泌,酶的活性、種類與微生物的數(shù)量、種類有關(guān)[9];瘤胃內(nèi)容物中微生物酶的活性在一定程度上可以反應微生物的定植與完善程度。因此,以前胃內(nèi)容物相對重量、內(nèi)容物pH值及瘤胃VFAs的濃度、摩爾比和微生物蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶的活性等作為指標,可較為全面地反映幼年反芻動物過渡為功能性反芻動物的前胃發(fā)育過程。

Wardrop和Coombe[10]曾假設認為,放牧羔羊瘤胃生理和功能發(fā)育可分為3個階段:即0～3周齡的非反芻階段,3～8周齡的過渡階段和8周齡以上的成年反芻階段;Poe等[11]證實這一階段劃分同樣適合于補飼的舍飼羔羊。但近年來,隨著品種改良、飼料生產(chǎn)技術(shù)改進和飼養(yǎng)管理模式改善,肉羊生產(chǎn)現(xiàn)狀在品種、飼草料及飼養(yǎng)管理等方面都發(fā)生了很大變化,國內(nèi)外近年來雖對綿羊羔羊前胃(尤其是瘤胃)功能的發(fā)育有較多研究[12-25],但有關(guān)舍飼條件下肉用羔羊前胃功能發(fā)育變化的研究尚未見報道,Wardrop和Coombe[10]的假設是否仍適用于目前我國舍飼并早期補飼條件下肉用羔羊的瘤胃生理和功能發(fā)育過程,有待進一步驗證。本研究選用舍飼甘肅肉用綿羊新品種選育群公羔,研究了0～56日齡羔羊前胃各室內(nèi)容物相對重量、pH值、瘤胃內(nèi)容物VFA及主要微生物消化酶等指標的發(fā)育變化特點,為較全面了解舍飼條件下肉用羔羊前胃功能的發(fā)育變化,進而制定舍飼哺乳肉用羔羊早期飼養(yǎng)管理策略,開發(fā)相應補飼技術(shù)和產(chǎn)品,實現(xiàn)羔羊早期培育和早期斷奶等提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及設計

試驗于2009年2-5月進行。從甘肅省永昌肉用種羊場選擇健康、生長發(fā)育正常的群飼甘肅肉用綿羊新品種選育群公羔(單羔)45只(平均初生重及宰前活重見表1),按組間出生體重相近的原則分為9組。以日齡為單因素進行試驗設計,分9個處理,每個處理5個重復,每個重復1只羊;分別于產(chǎn)后0,7,14,21,28,35,42,49,56 d不禁食狀態(tài)下稱活重,而后屠宰、取樣,測定瘤胃、網(wǎng)胃和瓣胃的相關(guān)指標。

表1 羔羊初生重和宰前活重Table 1 Birthweight and live weight in lambs kg

1.2 羔羊屠宰前的飼養(yǎng)管理

羔羊隨同母羊接受全舍飼飼養(yǎng)。出生后0.5～1.0 h內(nèi)吸吮初乳,之后置羔羊欄中,每日11:30-13:30,16:30-18:30,21:30-次晨8:30放入母羊欄吮吸母乳。于產(chǎn)后7 d開始,投放誘食精料補充料(配方及營養(yǎng)成分見表2)及優(yōu)質(zhì)苜蓿干草(鍘短至3cm左右,營養(yǎng)成分:干物質(zhì) 92.50%,粗蛋白質(zhì) 16.72%,粗脂肪2.16%,粗纖維17.44%,粗灰分10.69%,鈣15.57 g/kg DM,磷9.84 g/kg DM),令羔羊自由采食,并供應充足的清潔飲水。

表2 精料補充料組成和營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 2 Composition and nutrition level of concentrate supplement(air-dry basis)

1.3 屠宰、樣品采集與重量、pH 值測定

稱羔羊宰前活體重后,頸靜脈放血致死。立即打開腹腔,按照《家畜解剖學及組織胚胎學》[27]所述,將胃分為瘤網(wǎng)胃、瓣胃和皺胃,結(jié)扎各部位連接處。稱取傾出內(nèi)容物前、后的各胃室重量后,立即測定內(nèi)容物pH值;而后混勻各胃室內(nèi)容物、采樣;將樣品傾入10 mL離心管置液氮中速凍后,轉(zhuǎn)移至-70℃冰箱中保存,以待測定VFAs和瘤胃主要微生物酶。

羔羊初生重、宰前活重、各胃室內(nèi)容物重量:用電子秤(載量30 kg,感量為0.1 g)稱取。全胃內(nèi)容物重量為瘤網(wǎng)胃、瓣胃和皺胃3部分內(nèi)容物重量之和。

內(nèi)容物pH值:用賽多利斯產(chǎn)PB-10型pH計現(xiàn)場測定[28]。

1.4 樣品預處理與測定

樣品預處理采用楊子江等[28]的方法。測定前低溫(4～10℃)解凍樣品,在未完全解凍前用分析天平(載量200 g,感量為0.000 1 g)稱重,按1∶5(W/V)加入4℃的0.4 mol/L氯化鉀溶液冰浴勻漿45 s,4℃、12 000 r/min離心10 min,將上清液分裝至5 mL冷凍管中置于-70℃保存?zhèn)錅y。

瘤胃內(nèi)容物VFAs測定采用楊子江等[28]的方法。用安捷倫(Aglient)6890N氣相色譜儀測定。色譜柱為19091 N-213。測定條件為:進樣口溫度220℃,載氣(N2)流量 2.0 mL/min,分流比40∶1,進樣量0.6 μ L;程序升溫:120℃保持3 min,而后升高 10℃/min,180℃保持1 min;FID溫度為250℃;氫氣 40 mL/min,空氣 450 mL/min,尾吹氣45 mL/min。

瘤胃內(nèi)容物蛋白質(zhì)含量按楊子江[29]對Folin-酚法[30]改進后的方法測定。

瘤胃內(nèi)容物主要微生物酶活性:蛋白酶活性用李啟鵬[19]改進的萃取化學公司法[31]測定,淀粉酶活性用Bernfeld法[31]測定,纖維素酶活性用萃取化學公司法[31]測定。規(guī)定在38℃、pH 6.9的條件下,水解酪蛋白每min產(chǎn)生酪氨酸1 μ g為1個蛋白酶活性單位[31]。1個α-淀粉酶單位相當于在38℃和pH 6.9條件下,從可溶性淀粉中釋放1 μ mol麥芽糖所需的酶量[31]。1個纖維素酶單位相當于每min釋放出0.1 μ mol葡萄糖的還原糖時所需的酶量[31]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析,差異顯著時用 Tukey(同質(zhì)數(shù)據(jù))或 Tamhane'2法(不同質(zhì)數(shù)據(jù))作多重比較。試驗結(jié)果以“Mean±SD”表示,P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 羔羊前胃各室內(nèi)容物相對重量的日齡變化

羔羊瘤網(wǎng)胃內(nèi)容物相對重量(%活體重量)在0～42 d呈增高趨勢,42～49 d顯著增加(P<0.05),28和35 d分別為0 d的24.95和36.55倍;49 d時達到最高,為0 d值的68.89倍(表3)。瓣胃內(nèi)容物相對重量(%活體重量)為0.02%～0.12%,變化幅度明顯較小。羔羊瘤網(wǎng)胃內(nèi)容物相對重量(%全胃內(nèi)容物重量)在0～35 d呈線性增加(R2=0.93,P=0.00),其中7～14,21～28,28～35 d顯著增加(P<0.05),之后在74.44%～80.73%波動;49 d時達到最高(80.73%),是0 d的15.18倍。瓣胃內(nèi)容物相對重量(%全胃內(nèi)容物重量)為0.31%～1.34%,總體隨日齡呈下降趨勢。

2.2 羔羊前胃各室內(nèi)容物pH值的日齡變化

0與7 d前胃各室內(nèi)容物pH值較低,以后隨日齡增長稍有升高且較穩(wěn)定,各日齡間差異均不顯著(P>0.05)(表4);其中瘤胃、網(wǎng)胃和瓣胃內(nèi)容物 pH 值分別為5.30～6.03,5.37～6.42和5.39～6.15。

2.3 羔羊瘤胃內(nèi)容物揮發(fā)性脂肪酸含量的日齡變化

在0 d時全部參試羔羊均未被檢出VFAs,7 d時有個別羔羊樣被檢出;21 d之前,所有羔羊均未被檢出異丁酸、異戊酸。隨日齡增長,各種VFA濃度均呈上升趨勢,其中TVFA(total volatile fatty acids,TVFA)、乙酸、丁酸和戊酸在21～28 d顯著(P<0.05)增高或呈增高(P>0.05)的趨勢,TVFA、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸濃度在28 d分別為其首次檢出日齡(14或21 d)的11.90,8.26,18.31,38.21和5.90倍;之后戊酸濃度相對穩(wěn)定,TVFA、乙酸、丙酸穩(wěn)步增高(49 d值除外),丁酸濃度的變化不甚規(guī)律(表5)。與42 d相比,49 d的 TVFA、乙酸和丙酸均顯著增高,可能突顯了該時段受試羔羊的個體特點。

表3 羔羊前胃各室內(nèi)容物相對重量的日齡變化Table 3 Relative weight of contents in compartments of forestomach in lambs at different age in days %

14 d時乙酸摩爾比和乙酸/丙酸(acetic/propionic,A/P)顯著高于其他日齡階段(P<0.05),而丙酸和丁酸摩爾比顯著低于其他日齡階段(P<0.05)(表6)。在其他日齡階段,僅28 d丁酸摩爾比顯著高于35,42和56 d(P<0.05);各日齡階段乙酸、丙酸、丁酸和戊酸摩爾比及A/P分別為 0.565～0.676,0.181～0.259,0.115～0.194,0.017～0.028和2.175～3.822。

表4 羔羊前胃各室內(nèi)容物pH值的日齡變化Table 4 pH value of contents in compartments of forestomach in lambs at different age in days

2.4 羔羊瘤胃內(nèi)容物微生物酶比活性的日齡變化

0 d時即從2只羔羊瘤胃內(nèi)容物檢出了纖維素酶比活性,自7 d開始所有參試羔羊均被檢出纖維素酶比活性;其他2種微生物酶在各日齡階段參試羔羊中均被檢出。瘤胃內(nèi)容物微生物酶(蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶)比活性存在較大的個體差異,隨著日齡的增長,3種微生物酶的比活性均呈增高趨勢(表7)。21 d以后的蛋白酶比活性均為7 d的1.5倍以上,以56 d最高(2.66倍);7 d始的各日齡段,α-淀粉酶比活性均為0 d值的3倍以上,49 d為其6.06倍;纖維素酶比活性在14 d有較大的上升,為7 d值的2.81倍,以后日齡增幅放緩,56 d達到7 d的4.00倍。

3 討論

3.1 日齡對羔羊前胃各室內(nèi)容物相對重量變化的影響

前人研究表明,當反芻動物采食飼料后,網(wǎng)胃和瘤胃開始迅速增大,羔羊瘤網(wǎng)胃內(nèi)容物占活重的百分率隨年齡增長而遞增[2]。本試驗結(jié)果與前人研究結(jié)果相符,羔羊0 d時瘤網(wǎng)胃內(nèi)容物僅為活體重量的0.15%,而28,35和42 d分別為3.79%,5.56%和7.05%,與韓正康和陳杰[2]的3.9%,4.6%和8.6%甚為相近。所測瘤網(wǎng)胃內(nèi)容物相對重量(%全胃內(nèi)容物重量)在7,14,21,28,42和56 d分別為11.09%,25.63%,37.26%,61.54,77.37%和74.44%,與王彩蓮等[13]完全放牧不補飼條件下相應日齡的13.77%,24.60%,64.25%,64.26%,69.21%和78.15%相比,僅21 d值明顯偏低。舍飼且早期充分補飼精補料與苜蓿干草條件下羔羊能按需要采食,瘤網(wǎng)胃內(nèi)容物重量能有規(guī)律地增長;而全放牧條件下羔羊各時段的牧草覓食量受放牧地可食牧草產(chǎn)量與質(zhì)量制約,故其瘤網(wǎng)胃內(nèi)容物重量的增長不甚規(guī)律。本試驗羔羊瘤網(wǎng)胃內(nèi)容物在7～14 d顯著增長,說明7 d開始補飼的辦法對羔羊前胃內(nèi)容物重量的增加具有明顯的促進作用。在28 d時羔羊瘤網(wǎng)胃內(nèi)容物相對重量(%全胃內(nèi)容物重量)為 61.54%,35 d時為76.87%,表明在本試驗條件下,羔羊在28 d時已具備了實施早期斷奶的前胃功能基礎,與郭江鵬等[32]通過分析羔羊各胃室重量和容積發(fā)育等指標得出的結(jié)論

——“在舍飼并早期補飼條件下35 d或提早到28 d進行羔羊早期斷奶是可行的”一致。

表5 羔羊瘤胃內(nèi)容物揮發(fā)性脂肪酸濃度的日齡變化Table 5 VFA concentration of rumen contents in lambs at different age in days mmol/L

表7 羔羊瘤胃內(nèi)容物微生物酶比活性的日齡變化Table 7 Activity of microbic enzymes of rumen contents in lambs at different age in days U/mg蛋白質(zhì)Protein

本試驗中羔羊瓣胃內(nèi)容物相對重量(%活體重量,%全胃內(nèi)容物重量)存在波動,沒有明顯的規(guī)律,與王彩蓮等[13]的結(jié)果相似,可能與瓣胃承擔的生理功能及其內(nèi)容物存量較少有關(guān),個體間差異較大亦是影響因素。

3.2 日齡對羔羊前胃各室內(nèi)容物pH值及VFA含量變化的影響

瘤胃內(nèi)容物pH值是反映瘤胃發(fā)酵狀況的綜合指標,受飼糧性質(zhì)(飼糧結(jié)構(gòu)、物理形式、原料種類及其加工形式)、唾液分泌、瘤胃內(nèi)VFA及其他有機酸的生成、吸收和排出、飼喂模式等因素的綜合影響[33]。本研究前胃各胃室內(nèi)容物pH值均隨日齡增長而稍有上升,是羔羊飼草料采食量逐漸增加、反芻行為逐步出現(xiàn)、唾液分泌量增加及其中和作用增強等因素綜合作用的結(jié)果。本試驗所測前胃各室pH值較王彩蓮等[13]所報道(6.03～6.67,6.19～6.83和4.95～6.71)和成年反芻動物均低,是由本試驗條件所致;補飼可為羔羊瘤胃發(fā)酵提供更多的易發(fā)酵碳水化合物,進而導致各胃室pH的降低;較小年齡羔羊(0～56 d)尚不具備成年反芻動物完善的反芻功能,使唾液對胃酸的中和能力降低。按Wardrop和Coombe[10]的假設,放牧羔羊瘤胃生理和功能發(fā)育,0～3周齡的非反芻階段,3～8周齡為過渡階段,8周齡以上為成年反芻階段?？煽闯?這一假設同樣也適合于舍飼且進行早期補飼的羔羊。

瘤胃內(nèi)容物的pH值并不直接影響瘤胃的發(fā)育,但它的變化可反映瘤胃VFAs比例的變化,而且直接影響到瘤胃上皮細胞對VFA的吸收和代謝,從而間接影響瘤胃發(fā)育[34]。VFA是瘤胃發(fā)酵的主要終產(chǎn)物,反映了微生物活性和瘤胃內(nèi)VFAs的吸收、排出或被中和的狀況;飼料類型可顯著影響VFA的總量和各種酸的比例,采食精料型飼糧和顆粒飼料,可使VFA水平升高,并提高丙酸的摩爾比[2]。本試驗結(jié)果與王彩蓮等[13]完全放牧不補飼條件下相應日齡羔羊瘤胃液中乙酸、丙酸、丁酸及TVFA含量、A/P存在較大的差別,和朱文濤等[12]4種飼糧條件下(飼糧1:11.91 MJ/kg消化能,20.11%粗蛋白質(zhì);飼糧2:11.91 MJ/kg消化能,14.02%粗蛋白質(zhì);飼糧3:8.15 MJ/kg消化能,20.09%粗蛋白質(zhì);飼糧4:8.15 MJ/kg消化能,14.26%粗蛋白質(zhì))相近日齡羔羊上述指標的差異也明顯。本試驗乙酸和丁酸含量明顯高于上述報道,但丙酸含量高于王彩蓮等[13](3.559～14.936 mmol/L)而低于朱文濤等[12]的結(jié)果(34.3～42.6 mmol/L),進一步證實了飼料類型可顯著影響VFA的總量和各種揮發(fā)酸比例的結(jié)論。此外,本試驗測出瘤胃內(nèi)容物中含有較高的丙酸、丁酸濃度,及郭江鵬等[32]舍飼條件下7 d開始的充足補飼能促使各胃室重量和容積的發(fā)育提前7～14 d的結(jié)論,均與前人在正常生理范圍內(nèi),較低的瘤胃pH值不但會引起丙酸、丁酸產(chǎn)量提高,而且能夠加強瘤胃上皮對它們的吸收,從而有利于幼齡反芻動物前胃的迅速發(fā)育的結(jié)論一致。

本試驗A/P在2.18～3.82內(nèi),表明羔羊瘤胃仍以乙酸發(fā)酵類型為主導。研究表明,在足夠的還原型輔酶II(還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,nicotinamide adeninedinucleotide phosphate-reduced,NADpH)存在的條件下,乙酸和丁酸用于合成脂肪時的理論量熱效率較高[2],而丙酸的葡萄糖異生途徑是反芻動物體內(nèi)產(chǎn)生NAD-pH的重要途徑。本試驗較高的丙酸含量保證了羔羊體內(nèi)葡萄糖異生前體的較充足供給,為乙酸、丁酸的高效供能提供了足夠的NADpH,從而保證了本試驗采用的飼養(yǎng)模式有較好的飼養(yǎng)效果。

3.3 日齡對羔羊瘤胃主要微生物酶比活性變化的影響

反芻動物的年齡、飼糧類型及飼養(yǎng)管理模式對瘤胃中各種微生物酶的種類和數(shù)量有顯著的影響[35,36]。本試驗結(jié)果表明,纖維素酶比活性的出現(xiàn)存在時間差異,證實了王彩蓮等[13]有關(guān)研究的報道。本試驗中,瘤胃內(nèi)容物中微生物蛋白酶、α-淀粉酶和纖維素酶比活性的較高活性日齡分別出現(xiàn)在21,7和14 d,與他人研究存在差異。王彩蓮等[13]分別出現(xiàn)在14,42和28 d;趙恒波等[15]結(jié)果為60 d時3種酶活性較高;kmet等[36]試驗表明,羔羊瘤胃內(nèi)容物蛋白酶和α-淀粉酶活性在20 d時達到最高峰,纖維素酶在30 d時呈峰值;Bomba等[37]研究表明,在常規(guī)飼喂方式下,羔羊瘤胃液淀粉酶活性在2～6周明顯升高,纖維素酶活性在4周齡明顯升高。與前人報道存在差異可能緣于本試驗采用的7日齡開始的補飼策略,羔羊在較早的日齡采食到高營養(yǎng)濃度的顆粒型精補料及優(yōu)質(zhì)飼草,促進了分泌蛋白酶、淀粉酶及纖維素酶的相關(guān)微生物區(qū)系的定植和完善,進而提早了淀粉酶和纖維素酶比活性的增高與穩(wěn)定。

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