劉 梅

熱應(yīng)激是目前影響家禽生產(chǎn)的主要環(huán)境因素之一,尤其在發(fā)展中國家,熱應(yīng)激帶來的損失相當(dāng)嚴(yán)重。過高的溫度會(huì)導(dǎo)致肉仔雞熱應(yīng)激,使其生理機(jī)能發(fā)生變化和紊亂,表現(xiàn)為采食量下降,輕者生長減慢、抵抗力降低,重者死亡率增加,造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。商品肉仔雞對熱應(yīng)激特別敏感,是由于代謝產(chǎn)熱隨著生長率增加而增加,而散熱能力卻沒有提高[1-2]。熱應(yīng)激可促進(jìn)肉仔雞脂肪合成,顯著提高其腹脂率,而且高溫環(huán)境本身直接影響肉仔雞的生長[3]。熱應(yīng)激影響肉仔雞的體組成,而在機(jī)體的主要組成成分中,體脂是最易變動(dòng)的,尤其是脂肪組織儲(chǔ)存的脂肪[4]。但熱應(yīng)激對各部位脂肪重量的影響還存在很大的爭議,本文旨在通過研究熱應(yīng)激對肉仔雞生長性能、血清生化指標(biāo)以及脂肪代謝的影響,探討急性熱應(yīng)激給動(dòng)物帶來的規(guī)律性變化,為防止和緩解熱應(yīng)激提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將 28日齡經(jīng)過常規(guī)免疫、健康、體重相近的愛拔益加(AA)肉仔雞 120只,隨機(jī)分成 3組:急性熱應(yīng)激組、對照組和飼糧配對組,每組 4個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù) 10只雞。急性熱應(yīng)激組:自由采食,室溫(35±1)℃;對照組:自由采食,室溫(22±1)℃;飼糧配對組按高溫組前 1天的采食量飼喂,室溫(22±1)℃。雞舍用排氣扇進(jìn)行縱向通風(fēng),用加熱器和空調(diào)控制溫度,相對濕度控制在(50±5)%,試驗(yàn)期 7 d(28～34日齡)。基礎(chǔ)飼糧參照美國 NRC(1998)肉仔雞營養(yǎng)需要配制,基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表 1。

1.2 飼養(yǎng)管理

各組飼養(yǎng)管理方式一致。試驗(yàn)期間 24 h光照,自由采食,自由飲水。免疫和消毒按常規(guī)程序進(jìn)行。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of basal diet(air-dry basis) %

1.3 測定指標(biāo)

1.3.1 生長性能的測定

每天記錄各重復(fù)的耗料量,并于 35日齡時(shí)對試驗(yàn)肉仔雞進(jìn)行空腹稱重,計(jì)算各組的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

1.3.2 樣品采集

在 35日齡 08:00于每組的每個(gè)重復(fù)中選取1只接近平均體重的雞,翅靜脈采血 5 mL,3 000 r/min離心 15 min(800型離心機(jī),上海)制備血清,裝于1.5 mL的 eppendorf管中,置 -20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。血清甘油三?TG)和總膽固醇(TC)含量均采用終點(diǎn)法[5-6]測定,游離脂肪酸(FFA)含量采用比色法測定(具體操作參照南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒說明書),高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量采用磷鎢酸 -Mg2+法測定,低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量采用肝素 -檸檬酸鈉沉淀法測定(具體操作參照南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒說明書進(jìn)行)。屠宰取肝臟、腹脂(腹部與肌胃及腸系膜周圍的脂肪)、頸皮下脂肪(頸部皮下及嗉囊周圍的脂肪)、腿皮下脂肪(臀股二頭肌周圍及腹股溝內(nèi)的脂肪)、胸肉、腿肉稱重,取腹脂、頸皮下脂肪和腿皮下脂肪樣品再投入液氮中至分析。

1.3.3 腹脂、頸皮下脂肪和腿皮下脂肪的測定

雞屠宰后,剝離腹部脂肪和肌胃周圍脂肪(腸脂不易剝離,故不計(jì)算在內(nèi)),稱重。計(jì)算脂肪的相對重量。腹脂相對重量(%)=(腹脂重/活體重)×100;頸皮下脂肪相對重量(%)=(頸皮下脂肪重/活體重)×100;腿皮下脂肪相對重量(%)=(腿皮下脂肪重 /活體重)×100。

1.3.4 脂肪酸合成酶(FAS)活性的測定

將肝臟和脂肪組織在冰冷的勻漿緩沖液中勻漿(組織和勻漿緩沖液的比例是 1∶2),然后在冷凍超速離心機(jī)中 100 000×g 4℃離心 1 h,取上清液用于分析 FAS和蘋果酸酶的活性。FAS活性測定參照Halestrap等[7]的方法 。

用 0.1mol/L磷酸緩沖液(pH 6.5)配制反應(yīng)液,其中含有 NADPH 0.1mmol/L、乙酰輔酶 A 25μmol/L。

取 1 000μL的上述反應(yīng)液,在 37℃水浴中預(yù)溫 4 min,加入上清酶液 100μL,最后迅速加入1.38 mmol/L的丙二酰輔酶 A 50μL。在 0.5 cm光徑的石英比色皿中,340 nm波長下,測定 1 min內(nèi)吸光度的變化。

FAS活性 =[(測定管吸光度的變化 -空白管吸光度的變化)/(6.2×0.5)]×(反應(yīng)液總體積/取樣量)×1 000/樣本蛋白含量。

式中,6.2:底物的微摩爾消光系數(shù);0.5:比色皿的比色光徑;反應(yīng)液總體積:1 150μL;取樣量:100μL;樣本蛋白含量(mg/mL):考馬斯亮藍(lán)法。

FAS的 1個(gè)酶活力單位:每 mg組織蛋白在該反應(yīng)體系中 1 min內(nèi)催化 1 nmol底物(NADPH)轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物 (NADP+)的量定義為 1個(gè)酶活力單位。

1.3.5 蘋果酸酶活性的測定

參照 Hsu等[8]方法。用 50 mmol/L的 HEPES緩沖液(pH 7.5)配制反應(yīng)液,其中含有 1 mmol/L NADP和 10 mmol/L MgSO4。

取 1 000μL的上述反應(yīng)液,在 37℃水浴中預(yù)溫 4 min,加入上清酶液 50μL,最后迅速加入 L-蘋果酸鹽(44 mmol/L)50μL。在 0.5 cm光徑的石英比色皿中,340 nm波長下,測定 1 min內(nèi)吸光度的變化。

蘋果酸酶活性 =[(測定管吸光度的變化 -空白管吸光度的變化)/(6.2×0.5)]×(反應(yīng)液總體積/取樣量)×1 000/樣本蛋白含量。

式中,6.2:底物的微摩爾消光系數(shù);0.5:比色皿的比色光徑;反應(yīng)液總體積:1 100μL;取樣量:50μL;樣本蛋白含量(mg/mL):考馬斯亮藍(lán)法。

蘋果酸酶的 1個(gè)酶活力單位:每 mg組織蛋白在該反應(yīng)體系中 1 min內(nèi)催化 1 nmol底物(NADP)轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物(NADPH)的量定義為 1個(gè)酶活力單位。

1.3.6 FAS、乙酰輔酶 A羧化酶(ACC)和脂蛋白脂酶(LPL)基因 mRNA表達(dá)的測定

TRIZOL法提取總 RNA后,用 Oligo(dT)引物和 AMV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,RT-PCR反應(yīng)體系為 SYBR Premix Ex Taq,上、下游引物和 cDNA模板,以 18S rRNA為內(nèi)參,反應(yīng)程序?yàn)?95℃變性 10 s,95℃退火 5 s,60℃延伸 34 s。脂肪代謝相關(guān)酶基因的引物序列見表 2。

表2 脂肪代謝相關(guān)酶基因的引物序列Table 2 Gene-specific primer of the lipid metabolism related enzyme

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用 SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析,試驗(yàn)結(jié)果采用平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性熱應(yīng)激對肉仔雞生長性能的影響

急性熱應(yīng)激對肉仔雞生長性能的影響見表 3。與對照組相比,急性熱應(yīng)激組 AA肉仔雞的平均日采食量和平均日增重分別顯著下降 33.84%、65.01%(P＜0.05),料重比增加 89.14%(P＜0.05)。同時(shí),與飼糧配對組相比,急性熱應(yīng)激組的平均日增重降低 28.29%(P＞0.05),料重比增加 42.27%(P＞0.05)。

表3 急性熱應(yīng)激對肉仔雞生長性能的影響Table 3 Effects of acute heat stress on growth performance of broilers

2.2 急性熱應(yīng)激對肉仔雞脂肪沉積的影響

由表 4可知,與對照組比較,急性熱應(yīng)激組肝臟的相對重量(肝臟重/體重)顯著增加 (P＜0.05),腹脂、頸皮下脂肪的相對重量顯著增加(P＜0.05),同時(shí)腿皮下脂肪相對重量有增加的趨 勢(P＞0.05)。

表4 急性熱應(yīng)激對肉仔雞肝臟和脂肪組織相對重量的影響Table 4 Effects of acute heat stress on the relative weight of liver and fat of broilers

2.3 急性熱應(yīng)激對肉仔雞血清生化指標(biāo)的影響

由表 5可知,急性熱應(yīng)激對血清中 FFA和 TC的含量均無顯著影響(P＞0.05),但顯著增加了TG、HDL-C和 LDL-C的含量 (P＜0.05);對照組與飼糧配對組相比均無顯著差異(P＞0.05)。

表5 急性熱應(yīng)激對肉仔雞血清生化指標(biāo)的影響Table 5 Effects of acute heat stress on serum biochemical indices of broilers mmol/L

2.4 急性熱應(yīng)激對肉仔雞肝臟和脂肪組織脂肪酸從頭合成酶活性的影響

如圖 1和圖 2所示,急性熱應(yīng)激對肝臟 FAS和蘋果酸酶的活性具有顯著影響(P＜0.05),但對腹脂中的 FAS和蘋果酸酶的活性均無顯著影響(P＞0.05)。

圖1 急性熱應(yīng)激對肉仔雞 FAS活性的影響Fig.1 Effects of acute heat stress on FASactivity of broilers

圖2 急性熱應(yīng)激對肉仔雞蘋果酸酶活性的影響Fig.2 Effects of heat stress on malic enzyme activity of broilers

2.5 急性熱應(yīng)激對肉仔雞肝臟和脂肪組織脂肪代謝有關(guān)酶基因 mRNA相對表達(dá)水平的影響

如圖 3所示,急性熱應(yīng)激顯著增加了肝臟 ACC和 FAS基因的 mRNA相對表達(dá)水平(P＜0.05),同時(shí)顯著降低了 LPL基因的 mRNA相對表達(dá)水平(P＜0.05)。如圖 4所示,急性熱應(yīng)激只顯著增加了腹脂中 FAS基因的 mRNA相對表達(dá)水平(P＜0.05),而腹脂中的 ACC基因的 mRNA相對表達(dá)水平并未受到熱應(yīng)激的顯著影響(P＞0.05)。

圖3 急性熱應(yīng)激對肉仔雞肝臟脂肪代謝基因表達(dá)的影響Fig.3 Effects of acute heat stress on lipid metabolism gene expression in the liver of broilers

圖4 急性熱應(yīng)激對肉仔雞腹脂中脂肪代謝基因表達(dá)的影響Fig.4 Effects of acute heat stress on lipid metabolism gene expression in the abdominal fat of broilers

3 討 論

3.1 急性熱應(yīng)激對肉仔雞生長性能的影響

家禽采食量的調(diào)控有溫?zé)岷愣C(jī)制和化學(xué)恒定機(jī)制 2種。當(dāng)高熱條件下,溫?zé)岷愣C(jī)制對采食量的控制主要表現(xiàn)為采食量與環(huán)境溫度呈負(fù)相關(guān),高溫可直接作用于下丘腦的攝食中樞,降低其興奮性;另外,消化道交感神經(jīng)的興奮使消化道活動(dòng)減弱,導(dǎo)致消化道食物的充盈,同時(shí)為減輕熱負(fù)荷,雞的飲水量增加,這 2種因素會(huì)壓迫消化道機(jī)械感受器而抑制食欲?；瘜W(xué)恒定機(jī)制是養(yǎng)分在消化道吸收和養(yǎng)分在血液中出現(xiàn)可構(gòu)成一系列原始信號(hào),這些信號(hào)作用于下丘腦的飽覺中樞,增強(qiáng)其興奮性[2,9]。

熱應(yīng)激降低肉仔雞采食量已為大家所承認(rèn),但對飼料利用效率的影響尚有爭議。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為高溫環(huán)境降低飼料利用效率,但也有相反的結(jié)論,這可能與肉仔雞的品種、年齡、性別及環(huán)境溫度有關(guān)。在本研究中,熱暴露 1周后 AA肉仔雞的平均日采食量下降了 33.84%,進(jìn)一步說明了在高溫環(huán)境下家禽采食中樞的興奮性受到部分抑制,導(dǎo)致采食量下降。王啟軍等[10]的研究表明,熱暴露 3周后北京油雞的平均日采食量下降了 22.28%,高溫環(huán)境下北京油雞的平均日增重沒有顯著變化,但飼料轉(zhuǎn)化率顯著升高。本研究高溫環(huán)境顯著降低了 AA肉仔雞的平均日增重和料重比,這說明熱應(yīng)激對不同基因型肉仔雞的影響不同?？赡苁锹偕L型肉仔雞比快速生長型肉仔雞更耐高溫。

3.2 急性熱應(yīng)激對肉仔雞脂肪代謝的影響

多數(shù)研究表明,熱應(yīng)激在降低生長的同時(shí)還有增加脂肪沉積的趨勢[10-11]。Ain Baziz[12]研究了環(huán)境溫度為 32℃時(shí)對 4～7周齡艾維茵肉仔雞腹脂、皮下脂肪和肌間脂肪沉積的影響,發(fā)現(xiàn)此溫度下這3部分脂肪的沉積率分別增加 15%、21%、22%(以活體重計(jì))。本研究發(fā)現(xiàn),AA肉仔雞在高溫環(huán)境條件下脂肪沉積增加主要表現(xiàn)在腹部和肝臟比重增加。

血清 FFA主要來源于體內(nèi)脂肪組織中甘油三酯的分解[11]。肉仔雞體脂的沉積絕大多數(shù)來源于肝臟,而脂肪組織的發(fā)育取決于血清中能利用的甘油三酯的水平。本研究表明,急性熱應(yīng)激對血清中FFA含量沒有顯著影響,但顯著增加了 TG、HDL-C和 LDL-C的含量,對照組與飼糧配對組相比沒有顯著差異。

從乙酰輔酶 A和丙二酰輔酶 A合成長鏈脂肪酸實(shí)際上是一個(gè)重復(fù)加成的過程,每次延長 2個(gè)碳原子。FAS就是催化該加成反應(yīng)的酶,它是由 7種酶蛋白聚合在一起構(gòu)成的多酶體系,在高等動(dòng)物,這7種酶活性都在 1條多肽鏈上,屬多功能酶,由 1個(gè)基因所編碼[13]。FAS在動(dòng)物體脂生成、沉積中發(fā)揮重要作用。有關(guān)研究表明高溫對 FAS的活性有直接影響[14]。本試驗(yàn)中,急性熱應(yīng)激顯著增加了肝臟FAS和蘋果酸酶的活性及 FAS基因的 mRNA相對表達(dá)水平,從而促進(jìn)了肝臟的脂肪酸合成。急性熱應(yīng)激對腹脂 FAS和蘋果酸酶的活性沒有顯著影響。

血液中的甘油三酯要被其他組織重新利用,首先必須水解為 FFA,而催化這一反應(yīng)的酶就是 LPL。LPL對脂肪沉積具有反作用。LPL脂解進(jìn)入血液中的乳糜微粒和極低密度脂蛋白(VLDL)中的 TG,TG在 LPL作用下分解為甘油和脂肪酸,LPL進(jìn)一步引導(dǎo)脂肪酸進(jìn)入脂肪組織,重新酯化成脂肪并貯存起來,LPL活性是在最后階段控制雞脂肪組織增長的[15-16]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,急性熱應(yīng)激組肝臟LPL基因的 mRNA相對表達(dá)水平顯著降低,不能有效降解血清中的 TG,其變化與血脂變化一致。而在脂肪組織中,急性熱應(yīng)激組LPL基因的 mRNA相對表達(dá)水平有所增加,從而使脂肪酸在脂肪組織沉積。

4 結(jié) 論

①急性熱應(yīng)激情況下,AA肉仔雞的平均日采食量、平均日增重下降,料重比增加,表明急性熱應(yīng)激可導(dǎo)致生長性能下降。

②急性熱應(yīng)激也影響了 AA肉仔雞的脂肪代謝,使血清 TG、HDL-C和 LDL-C含量上升,肝臟中FAS和 ACC基因的 mRNA的相對表達(dá)水平增加,而 LPL基因的mRNA的相對表達(dá)水平下調(diào),即意味著脂肪代謝過程中的脂肪沉積增加。

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