沈文英 李衛(wèi)芬 梁 權(quán) 鄧 斌 陳南南 周緒霞

我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖的集約化發(fā)展導(dǎo)致水環(huán)境日益惡化,病害頻繁發(fā)生,直接影響?zhàn)B殖動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育,甚至導(dǎo)致養(yǎng)殖動(dòng)物的大量死亡。益生菌因其安全性好且具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和改善水質(zhì)等功能而被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中[1]。研究表明,益生菌的促生長(zhǎng)機(jī)理主要與改善水體水質(zhì)、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、提高機(jī)體免疫和抗氧化功能有關(guān)[2-5]。益生菌作為飼料添加劑可以促進(jìn)魚(yú)類免疫器官的成熟[6]、刺激呼吸爆發(fā)活性[7]、提高免疫和抗氧化能力[8-10],從而提高其抗病力和促進(jìn)生長(zhǎng)。研究表明,益生菌芽孢桿菌能提高鯽魚(yú)[11]、南美白對(duì)蝦[1-2,10]的消化酶活力和免疫能力。而有關(guān)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)對(duì)魚(yú)類免疫和抗氧化功能的研究較少。因此,本試驗(yàn)擬在草魚(yú)(Ctenopharyngodon idellus)飼料中添加枯草芽孢桿菌,探討其對(duì)草魚(yú)生長(zhǎng)性能、免疫和抗氧化功能的影響,為枯草芽孢桿菌在草魚(yú)養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

試驗(yàn)用枯草芽孢桿菌制劑由本實(shí)驗(yàn)室制備,枯草芽孢桿菌含量為 1×108CFU/g。根據(jù)草魚(yú)配合飼料營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(SC/T 1024—1997)配制基礎(chǔ)飼料,基礎(chǔ)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表 1。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)并結(jié)合參考文獻(xiàn)[10],在基礎(chǔ)飼料中添加 1‰枯草芽孢桿菌制劑,使得試驗(yàn)飼料中枯草芽孢桿菌含量達(dá)到 1×105CFU/g。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)用草魚(yú)由浙江省紹興市淡水養(yǎng)殖場(chǎng)提供,在試驗(yàn)前先馴養(yǎng) 1周,然后選取體重(51.0±2.3)g的健康無(wú)病草魚(yú) 300尾,隨機(jī)分成 2組(對(duì)照組和試驗(yàn)組),每組 3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù) 50尾魚(yú)。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼料,試驗(yàn)組飼喂試驗(yàn)飼料(含枯草芽孢桿菌 1×105CFU/g)。按草魚(yú)體重3%的日投餌量飼喂,每天分 3次(08:00、12:00和19:00)投餌,試驗(yàn)期為 45 d。試驗(yàn)在室內(nèi)過(guò)濾式循環(huán)水系統(tǒng)中進(jìn)行,試驗(yàn)魚(yú)以重復(fù)為單位飼養(yǎng)于圓形水族箱(體積為 2.75 m3,實(shí)際水體積為1.33 m3)內(nèi),試驗(yàn)用水為充分曝氣的水庫(kù)水,每周換水 1/3。試驗(yàn)期間水溫為 18～25℃,用ACO-318型空氣壓縮機(jī) 24 h增氧。

1.3 樣品采集

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后,停飼 24 h,從每個(gè)重復(fù)隨機(jī)抽取 10尾魚(yú),以 0.2 g/L的 3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸鹽麻醉后取樣。

血清樣品:通過(guò)尾椎靜脈采血,將血樣在 4℃冰箱中靜置 24 h后,4℃4 000 r/min離心15 min,取上清液于 1.5 mL Eppendorf管中,立即保存于-80℃冰箱中備用。

肝胰臟樣品:將每尾魚(yú)的肝胰臟裝于密封樣品袋中,立即用液氮快速冷凍,然后轉(zhuǎn)至 -80℃冰箱中保存。準(zhǔn)確稱取 0.5 g草魚(yú)肝胰臟樣品于滅菌的 10 mL離心管中,加 4.5 mL預(yù)冷滅菌的生理鹽水,然后用自動(dòng)勻漿器于冰上勻漿,得 10%組織勻漿液。將 10%組織勻漿液于 4℃ 4 000 r/min離心 20 min,取上清液于 1.5 mL Eppendorf管中,立即保存于 -80℃冰箱中備用。

1.4 指標(biāo)測(cè)定與方法

1.4.1 生長(zhǎng)性能

在養(yǎng)殖試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)分別對(duì)草魚(yú)進(jìn)行稱重,計(jì)算增重率(WGR)和特定生長(zhǎng)率(SGR),公式如下:

WGR(%)=100×(終末體重 -初始體重)/初始體重;

SGR(%/d)=100×(ln終末體重 -ln初始體重)/試驗(yàn)天數(shù)。

1.4.2 血清免疫指標(biāo)

血清總蛋白和白蛋白含量分別采用考馬斯亮藍(lán) G-250染料法和溴甲酚綠法測(cè)定,球蛋白含量即為總蛋白含量減去白蛋白含量。血清溶菌酶(LZM)活性采用比濁法測(cè)定,髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性采用比色法測(cè)定,堿性磷酸酶(AKP)活性采用磷酸苯二鈉法測(cè)定,谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)活性均采用賴氏法測(cè)定。血清補(bǔ)體 3(C3)和免疫球蛋白 M(IgM)含量分別采用速率散射濁度法和免疫透射比濁法測(cè)定。血清總蛋白、白蛋白含量以及 LZM、MPO、AKP、GOT和 GPT活性的測(cè)定所用試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所,而血清 C3和 IgM含量的測(cè)定所用試劑盒購(gòu)自寧波慈城生化試劑廠。

1.4.3 血清和肝胰臟抗氧化指標(biāo)

血清和肝胰臟中超氧化物歧化酶(SOD)活性采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定,過(guò)氧化氫酶(CAT)活性采用紫外吸收法測(cè)定,谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性和還原型谷胱甘肽(GSH)含量均采用 5,5-二巰基雙 -2-硝基苯甲酸(DTNB)法測(cè)定,抗超氧陰離子自由基(O-2?)活性采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定,丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定,總抗氧化能力(T-AOC)采用比色法測(cè)定。血清和肝胰臟中 SOD、CAT、GSH-Px、抗 O-2?活性,GSH、MDA含量以及 TAOC的測(cè)定所用試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用 Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)均以平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用 SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì) t檢驗(yàn)分析,P＜0.05表示存在顯著差異。

2 結(jié) 果

2.1 飼料中添加芽孢桿菌對(duì)草魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響

由表 2可見(jiàn),與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組草魚(yú)的WGR提高了 21.78%,SGR提高了 16.67%,差異達(dá)到顯著水平(P＜0.05)。

表2 飼料中添加枯草芽孢桿菌對(duì)草魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響Table 2 Effects of dietary Bacillus subtilis on growth performance of grass carp

2.2 飼料中添加枯草芽孢桿菌對(duì)草魚(yú)免疫功能的影響

由表 3可知,與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組草魚(yú)血清中 IgM、C3含量和 AKP活性顯著升高(P＜0.05),而 MPO和 GPT活性則顯著降低 (P＜0.05)。飼料中添加枯草芽孢桿菌對(duì)草魚(yú)血清中總蛋白、白蛋白、球蛋白含量,白球比以及 LZM和GOT活性無(wú)顯著影響(P＞0.05)。

表3 飼料中添加枯草芽孢桿菌對(duì)草魚(yú)血清免疫指標(biāo)的影響Table 3 Effects of dietary Bacillus subtilis on serum immune indices of grass carp

2.3 飼料中添加枯草芽孢桿菌對(duì)草魚(yú)抗氧化功能的影響

由表 4可知,與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組草魚(yú)血清和肝胰臟中 T-AOC以及 CAT、SOD活性和肝胰臟GSH含量顯著升高(P＜0.05),血清 T-AOC以及CAT、SOD活性分別提高了 18.31%、44.23%和11.01%,肝胰臟 T-AOC,CAT、SOD活性和 GSH含量分別提高了 37.60%、52.00%、39.05%和51.39%;血清和肝胰臟中抗 O-2?活性和 MDA含量均顯著降低(P＜0.05),抗 O-2?活性分別降低了 21.73%和 25.97%,MDA含量分別降低了48.62%和 12.62%。飼料中添加枯草芽孢桿菌對(duì)草魚(yú)血清和肝胰臟中 GSH-Px活性以及血清中GSH含量無(wú)顯著影響(P＞0.05)。

表4 飼料中添加枯草芽孢桿菌對(duì)草魚(yú)血清和肝胰臟抗氧化指標(biāo)的影響Table 4 Effects of dietary Bacillus subtilis on antioxidant indices in serum and hepatopancreas of grass carp

3 討 論

益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用的研究主要集中于改善水質(zhì)和促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)方面[2-5],而對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物自身免疫和抗氧化功能影響的報(bào)道較少。研究表明,枯草芽孢桿菌投喂鯉魚(yú)能顯著提高鯉魚(yú)的巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)活力和抗嗜水氣單胞菌的能力,促進(jìn)鯉魚(yú)免疫器官的成熟[6]?？莶菅挎邨U菌和乳酸菌單獨(dú)或復(fù)合投喂能提高金頭海鯛(Sparus aurata)非特異性免疫力[8]。鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)可刺激虹鱒魚(yú)(Oncorhynchus mykiss)巨噬細(xì)胞的呼吸爆發(fā)活力[7]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,飼料中添加枯草芽孢桿菌能顯著提高草魚(yú)的 WGR和 SGR,提高草魚(yú)血清中 IgM、C3含量和AKP活性。這說(shuō)明飼料中添加枯草芽孢桿菌可以提高草魚(yú)部分特異性和非特異免疫功能。飼料中添加芽孢桿菌等益生菌增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫功能的機(jī)理可能是通過(guò)改善水生動(dòng)物腸道微生態(tài)環(huán)境和通過(guò)自身分泌免疫激活劑來(lái)實(shí)現(xiàn)的[12-15],芽孢桿菌通過(guò)口服作用于腸道集合淋巴結(jié)的抗原結(jié)合位點(diǎn)或通過(guò)調(diào)整動(dòng)物的微生物群間接地發(fā)揮免疫賦活的作用,提高機(jī)體的局部或整體防御功能,進(jìn)而起到防病、抗病的作用[16]。此外,本試驗(yàn)還檢測(cè)了草魚(yú)血清 GPT和 GOT活性,發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組草魚(yú)血清GPT和 GOT活性均低于對(duì)照組,這與朱學(xué)芝等[17]在凡納濱對(duì)蝦上得到的結(jié)果一致,表明枯草芽孢桿菌對(duì)草魚(yú)的肝胰臟功能無(wú)損傷。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示,飼料中添加枯草芽孢桿菌可通過(guò)提高血清和肝胰臟中的相關(guān)抗氧化物的活性或含量來(lái)增強(qiáng)草魚(yú)血清和肝胰臟的抗氧化功能,具體表現(xiàn)為草魚(yú)血清中 T-AOC,CAT、SOD活性和肝胰臟中 T-AOC,CAT、SOD活性和 GSH含量顯著提高,血清和肝胰臟中抗 O-2?活性和MDA含量顯著降低。這與前人得出的地衣芽孢桿菌提高三角帆蚌[9]和枯草芽孢桿菌提高凡納濱對(duì)蝦[10]抗氧化功能的結(jié)果一致。研究表明,芽孢桿菌和乳酸菌均具有清除機(jī)體羥自由基、CAT以及抗脂質(zhì)過(guò)氧化的能力[9-10,18]。大多數(shù)乳酸菌通過(guò)提高 SOD活性和 GSH含量來(lái)抵抗機(jī)體的氧化[19-20],而枯草芽孢桿菌隨飼料進(jìn)入魚(yú)體后也可能通過(guò)自身分泌抗氧化酶或者作為激活劑促進(jìn)機(jī)體抗氧化酶分泌,從而有效清除自由基,阻止脂質(zhì)過(guò)氧化。因此在飼料中添加適量枯草芽孢桿菌可以提高草魚(yú)的免疫和抗氧化功能,減輕自由基對(duì)機(jī)體的損傷,減少草魚(yú)養(yǎng)殖過(guò)程中的病害發(fā)生。這也是枯草芽孢桿菌作為飼料添加劑促進(jìn)草魚(yú)生長(zhǎng)的原因之一。

4 結(jié) 論

①飼料中添加枯草芽孢桿菌可促進(jìn)草魚(yú)的生長(zhǎng)。

②飼料中添加枯草芽孢桿菌可提高草魚(yú)的部分特異性和非特異免疫功能,且對(duì)其肝胰臟功能無(wú)不良影響。

③飼料中添加枯草芽孢桿菌可提高草魚(yú)的抗氧化功能,進(jìn)而減輕自由基對(duì)機(jī)體的損傷。

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