吳 旋 白東清 朱國霞 寧 博

隨著水產動物養(yǎng)殖規(guī)模地不斷擴大,水產品產量逐年上漲,人們對水產品品質提出了更高的要求[1]。但是水產動物疾病頻發(fā),是制約水產品品質提高的瓶頸。因此,尋求一種高效、環(huán)保、低毒副作用的藥物,已成為水產養(yǎng)殖領域的熱點問題。而中草藥多糖在此方面發(fā)揮了獨到的功效,為解決該難題做出了巨大的貢獻。

黃芪多糖(Astraglus polysaccharides,APS)是從黃芪中提取的天然活性成分[2],具有抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、調節(jié)機體體液免疫、激活免疫細胞因子等功效,目前黃芪多糖作為免疫增強劑在水產養(yǎng)殖中已見報道[3-7],但其在黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)上的研究及應用尚未見報道?；诖?本研究以我國的淡水經濟魚類——黃顙魚作為試驗對象,在魚飼料中分別添加不同水平的黃芪多糖,旨在探討長期連續(xù)投喂黃芪多糖對黃顙魚頭腎巨噬細胞呼吸爆發(fā)活性與外周血白細胞增殖能力的影響,為尋求提高黃顙魚非特異性免疫力的藥物開辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗魚與試驗設計

540尾 2齡健康黃顙魚取自天津農學院漁場,體重(61.6 ±5.4)g、體長(19.5±3.2)cm,隨機分成 6組,每組 3個重復,每個重復 30尾魚。分別投喂添加 0、300、600、900、1 200、1 500 mg/kg黃芪多糖的飼料,飼養(yǎng)期為 8周。試驗魚飼養(yǎng)于架設在養(yǎng)殖池中的 1.5 m×1.5 m×1 m的 18個網箱中,每箱隨機投放黃顙魚 30尾(雌雄各占 1/2)。試驗期間水溫保持在(26±2)℃,每天連續(xù)充氧,試驗期間每天換水 1/3左右。日投餌率為 2%,每天投喂 3次。基礎飼料組成及營養(yǎng)水平見表 1。

1.1.2 試劑

L-15培養(yǎng)基、脂多糖 (lipopolysaccharide,LPS)、Hanks溶液、佛波豆寇乙酸脂(phobolmyr-istate acetate,PMA)、硝基藍四氮唑(nitroblue tetrazolium,NBT)、肝素鈉、超氧化物歧化酶標準品和噻唑蘭(thiazolyl blue,MTT)購自 Sigma公司;胎牛血清購自 Gibco公司;鏈霉素 -青霉素購自北京鼎國生物技術有限責任公司。硅石 -聚乙烯吡咯烷酮(phytohaemagglutinin,Percoll)、細胞培養(yǎng)板購自 Pharmacia公司;格里斯氏(Griesse)試劑購于上海碧云天生物技術有限公司。

表1 基礎飼料組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.2 方法

1.2.1 黃顙魚頭腎巨噬細胞與外周血白細胞的分離

每組取 6尾魚,使用 MS-222麻醉后,采用Bayne[8]的方法分離黃顙魚頭腎巨噬細胞,使用Percoll密度梯度法[9]分離頭腎巨噬細胞,并使用臺盼藍進行細胞活性檢測并計數(shù),以確?；罴毎臄?shù)量大于 90%,調整細胞密度為 1.0×107個/mL,27℃培養(yǎng)備用。在無菌的條件下進行尾靜脈采血,外周血白細胞的分離方法與頭腎巨噬細胞的相同。

1.2.2 免疫細胞活性指標檢測

頭腎巨噬細胞氧呼吸爆發(fā)(oxygen respiratory burst,ORB)活性的測定采用 NBT法[10]。以添加0 APS組采集的細胞液為空白對照,在細胞液中添加 LPS(500μg/mL)為陽性對照,其他各 APS組采集的細胞液分別為 1個處理,每個處理設 7個重復。使用酶聯(lián)免疫檢測儀,在 620 nm下,測定吸光度(OD)值。

頭腎巨噬細胞氮呼吸爆發(fā)(nitrogen respiratory burst,NRB)活性的測定采用 Griesse試劑法[11],其他操作同氧呼吸爆發(fā)活力的測定。在 540 nm下測定 OD值。

外周血白細胞的增殖采用 MTT比色法檢測[12],每個處理細胞設 12個重復,培養(yǎng) 24 h后,在 570 nm的波長下測定 OD值,記錄結果。

1.2.3 數(shù)據處理

試驗數(shù)據用平均值 ±標準誤表示,采用 SPSS 17.0軟件包中的單因素方差分析(one-way ANOVA),以 P＜0.01和 P＜0.05為顯著性標準。

2 結 果

2.1 黃芪多糖對黃顙魚頭腎巨噬細胞氧呼吸爆發(fā)活性的影響

由圖 1和表 2可知,與空白對照相比,陽性對照頭腎巨噬細胞氧呼吸爆發(fā)活性極顯著提高(P＜0.01),這說明試驗中培養(yǎng)的細胞狀態(tài)良好;除300 mg/kg黃芪多糖組頭腎巨噬細胞氧呼吸爆發(fā)活性低于空白對照外,其余各組黃顙魚氧呼吸爆發(fā)活性隨黃芪多糖添加水平的增加而增加,但僅在1 200 mg/kg組氧呼吸爆發(fā)活性顯著高于空白對照(P＜0.05)。由此得出,黃芪多糖的添加水平可顯著影響頭腎巨噬細胞氧呼吸爆發(fā)活性,且1 200 mg/kg黃芪多糖添加水平最適宜。

2.2 黃芪多糖對黃顙魚頭腎巨噬細胞氮呼吸爆發(fā)活性的影響

由圖 2和表 2可知,與巨噬細胞氧呼吸爆發(fā)活性相似,與空白對照相比,陽性對照氮呼吸爆發(fā)活性極顯著提高(P＜0.01);添加黃芪多糖后,變化趨勢也與氮呼吸爆發(fā)活性變化相似,并在 1 200和1 500 mg/kg組氮呼吸爆發(fā)活性極顯著高于空白對照(P＜0.01),但 2組間差異不顯著 (P＞0.05)。因此從提高黃顙魚頭腎巨噬細胞氮呼吸爆發(fā)活性的角度考慮,飼料中黃芪多糖的適宜添加量為 1 200 mg/kg。

圖1 黃芪多糖對黃顙魚頭腎巨噬細胞氧呼吸爆發(fā)活性的影響Fig.1 Effects of Astragalus polysaccharides on oxygen respiratory burst activity of head-kidney macrophages of yellow catfish

圖2 黃芪多糖對黃顙魚頭腎巨噬細胞氮呼吸爆發(fā)活性的影響Fig.2 Effects of Astragalus polysaccharides on nitrogen respiratory burst activity of head-kidney macrophages of yellow catfish

2.3 黃芪多糖對黃顙魚外周血白細胞增殖的影響

由圖 3和表 2可知,各水平黃芪多糖組均能有效地提高黃顙魚外周血白細胞的增殖能力(P＜0.05),且 1 200和 1 500 mg/kg組外周血白細胞增殖能力比空白對照分別提高了 39.98%與35.97%(P＜0.01),其中 1200 mg/kg水平組增殖效果最好。因此從外周血白細胞增殖能力提高的角度上分析,選擇 1 200 mg/kg黃芪多糖水平較適宜。

表2 黃芪多糖對黃顙魚頭腎巨噬細胞呼吸爆發(fā)活力及外周血白細胞增值能力的影響Table 2 Effects of Astragalus polysaccharides on respiratory burst activity of head-kidney macrophages and proliferation of peripheral blood leukocyte of yellow catfish

圖3 黃芪多糖對黃顙魚外周血白細胞增殖能力的影響Fig.3 Effects of Astragalus polysaccharides on proliferation of peripheral blood leukocytes of yellow catfish

3 討 論

3.1 黃芪多糖對動物細胞呼吸爆發(fā)活性的影響

在黃芪多糖提高動物機體免疫功能方面,國內外學者已進行了大量研究。Yina等[3]和 Yin等[4]發(fā)現(xiàn),對鯉魚投喂含 0.5%的黃芪多糖飼料,在第 2、5周時能顯著提高頭腎巨噬細胞的氧呼吸爆發(fā)活性,而黃芪多糖與脂多糖混合后對鯉魚頭腎巨噬細胞進行體外培養(yǎng),能顯著地提高頭腎巨噬細胞的氮呼吸爆發(fā)活性;László等[5]曾報道,使用含 0.1%黃芪多糖提取物的飼料投喂尼羅羅非魚,并對其中性粒細胞的氧呼吸爆發(fā)活性進行檢測,結果顯示1～4周黃芪多糖組的呼吸爆發(fā)活性均高于對照組;曹麗萍等[6]使用黃芪多糖對鯉魚巨噬細胞進行體外培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)黃芪多糖能顯著提高其氮呼吸爆發(fā)活性;Lee等[13]研究發(fā)現(xiàn),黃芪多糖能增強巨噬細胞的一氧化氮的產量,并能增強一氧化氮合酶的表達;邱妍等[14]使用黃芪多糖對雞脾淋巴細胞進行體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),多糖濃度在100μg/mL時,對其一氧化氮含量的增加具有較好的促進作用,而且存在量效關系。

本試驗結果表明,黃芪多糖添加在飼料中投喂黃顙魚,在適宜的添加范圍內能夠有效地提高該魚頭腎巨噬細胞的呼吸爆發(fā)活性,表明飼料中添加適宜水平黃芪多糖可以有效提高魚機體免疫細胞的活性,增強機體免疫力。而這一結果恰好與上述的研究結論相印證。

3.2 黃芪多糖對動物白細胞增殖活性的影響

在魚類的自身免疫系統(tǒng)中巨噬細胞、淋巴細胞與各種粒細胞起著抵抗和殺滅病原菌,保護機體的重要作用。因此白細胞的增殖能力也成為考量一種免疫增強劑是否有效的重要指標。關于黃芪多糖可以提高白細胞的增殖能力已經得到了廣泛的證實:曹麗萍等[6]研究發(fā)現(xiàn),黃芪多糖能顯著增強鯉魚外周血白細胞的增殖能力;黃玉章等[7]使用不同添加量的黃芪多糖飼料投喂羅非魚,結果發(fā)現(xiàn)與對照組相比,各試驗組羅非魚腸道上皮內淋巴細胞數(shù)量均高于對照組;章世元等[15]等使用黃芪多糖與苜蓿多糖對肉仔雞的外周血淋巴與脾臟淋巴細胞進行培養(yǎng),得出結論黃芪多糖具有促進淋巴細胞增殖的作用,在添加量為100μg/mL時效果最佳;王國秀等[16]通過試驗得出,黃芪多糖本身或協(xié)同刀豆蛋白 A(ConA)或 LPS均能增強小鼠脾淋巴細胞的增殖能力;張訓海等[17]指出,黃芪多糖能促進雞脾淋巴細胞的增殖,且濃度為300 mg/L時效果最佳。這些研究成果均與本試驗中得出的黃芪多糖能顯著提高黃顙魚外周血白細胞的增殖,且與添加水平有關的結論相一致。

4 結 論

①連續(xù) 8周投喂適宜水平的黃芪多糖能有效地促進黃顙魚頭腎巨噬細胞的氧、氮呼吸爆發(fā)活性與外周血白細胞的增殖能力。

②黃芪多糖的添加量在 1 200 mg/kg時的作用效果最佳。

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