葛錫娟，許 巖，楊麗麗，吳 非*

(東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030)

大豆抗癌肽的初步提取及抗癌活性

葛錫娟，許 巖，楊麗麗，吳 非*

(東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030)

確定大豆抗癌肽最佳提取條件，并對其抗癌活性進行檢測。大豆經(jīng)乙醚、石油醚或正己烷脫脂預處理后，分別對大豆粉過篩目數(shù)、脫脂粉添加量和超聲波處理時間進行三因素三水平正交試驗設計，通過對胃癌細胞SGC-7901生長抑制率的影響，探討大豆抗癌肽的最佳提取條件；采用四噻唑藍比色法 (MTT法)對不同處理條件下的大豆提取物進行抗癌活性檢測。結果表明：大豆抗癌肽最佳提取條件為乙醚脫脂、過80目篩、脫脂粉添加量3g/15mL PBS緩沖液(pH7.4)、超聲波處理時間80min，經(jīng)驗證實驗，此條件下癌細胞增殖抑制率達到39.03%。

大豆；抗癌肽；提取；生物學活性

近10年來，流行病學研究顯示，癌癥仍然是導致死亡的主要原因之一。我國每年新增癌癥患者近200萬人，每年因癌癥死亡約150萬人，位居各類死因第一位[1]。體外試驗表明，抗癌肽通過抑制癌細胞的DNA來誘導癌細胞凋亡，這對抑制癌細胞發(fā)展和轉移都有重要意義[2-3]。近期研究顯示，大豆中含有一種新型的預防癌癥的物質——Lunasin。它是一種含有43個氨基酸的多肽，主要通過抑制核心組蛋白乙?；瘡亩鸢┘毎蛲鯷4-6]。De Mejia等[7]、Jeong等[8-9]都對這種肽的提取和抗癌活性進行了研究。國內(nèi)對大豆多肽的研究主要集中在抗氧化性、抗高血壓性、降血脂和降膽固醇方面[10-15]，有關大豆抗癌肽的報道較少。其中，大豆抗癌肽的提取主要經(jīng)過酶解法或微生物分解法[16]，酶解產(chǎn)物不但成分復雜而且不易控制，大大增加了加工成本。

本實驗采用四噻唑藍比色法(MTT)對抗癌活性進行體外試驗研究，探討大豆粉脫脂溶劑、目數(shù)、脫脂粉添加量以及超聲波處理時間對大豆抗癌肽提取的影響，以胃癌SGC-7901細胞增殖抑制率為檢測指標，確定最佳的提取條件，通過對大豆抗癌肽提取條件的研究，以期為大豆抗癌肽在食品、醫(yī)藥等領域的應用提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆 市售；人胃癌細胞系SGC-7901細胞 武漢博士得試劑公司；RPMI1640 上海索萊寶生物科技有限公司；胎牛血清(FBS) 杭州四季青生物工程材料有限公司；磷酸緩沖液(PBS，pH7.4) 哈爾濱鑫豐生物材料有限公司；胰酶(Typein，1∶250) 美國Amresco公司；噻唑藍[3(4,5-dimethylthiazo2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide，MTT] 美國Amresco公司；二甲基亞颯(dimethyl sulfoxide，DMSO，分析純) 中國醫(yī)藥集團(上海)試劑公司；乙醚、石油醚、正己烷(均為分析純) 天津市津東天正精細化學試劑廠；青霉素-鏈霉素溶液等。

1.2 儀器與設備

酶聯(lián)免疫檢測儀 美國BIO-RAD公司；超聲波振蕩儀、電子分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；IMT-413倒置熒光顯微鏡 日本Olympus公司；GL-21M高速冷凍離心機 上海市離心機械研究所；CO2培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司；pHS-3C型pH計 上海偉業(yè)儀器廠；手提式粉碎機 上海晴友實業(yè)有限公司；電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器廠；電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；0.22 μm細菌過濾器等。

1.3 方法

1.3.1 大豆抗癌肽提取

干燥的大豆1kg粉碎后進行脫脂，脫脂粉烘干后過篩，備用。取一定量的脫脂大豆粉，加入pH7.4PBS緩沖溶液15mL)，40℃超聲波處理一定時間，每隔10min攪拌一次，取出，4℃、20000×g離心30min，轉移上清液，備用。采用MTT法研究不同提取條件對癌細胞增殖的影響，確定最佳提取條件。

1.3.2 大豆抗癌肽提取條件的優(yōu)化

將粉碎后的大豆粉，分別用乙醚、石油醚、正己烷進行脫脂。根據(jù)脫脂溶劑的不同，將試驗分成3組并編號，分別為乙醚脫脂處理組、石油醚脫脂處理組、正己烷脫脂處理組。研究在同一脫脂劑處理條件下，改變提取條件時，癌細胞的增殖情況。以目數(shù)、脫脂粉添加量和超聲波處理時間作為正交因素，經(jīng)過預試驗(單因素)考慮確定其試驗因素的范圍；設計一個三因素三水平的正交試驗，以癌細胞增殖抑制率為考察指標，確定大豆抗癌肽提取的最佳條件。各組的試驗因素水平見表1。

表1 大豆抗癌肽提取條件優(yōu)化正交試驗因素水平表Table 1 Factors and their coded levels in orthogonal array design for optimizing extraction of anticancer peptides from defatted soybean powder

1.3.3 MTT法[17]檢測大豆抗癌肽對人胃癌細胞SGC-7901生長的影響

1.3.3.1 培養(yǎng)細胞

將復蘇后的SGC-7901細胞置于含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 164 0培養(yǎng)液(pH7.4)中，于體積分數(shù)5% CO2、37℃飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞鋪滿瓶底80%左右時用質量分數(shù)0.25%胰蛋白酶消化傳代。2～3d換液并傳代，取處于對數(shù)生長期的同一代細胞進行實驗。

1.3.3.2 接種細胞

質量分數(shù)0.25%胰蛋白酶消化貼壁生長的細胞，用含體積分數(shù)10% FB S(胎牛血清)、100mg/L青霉素和100mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液吹打成單細胞懸液，以每孔200μL(共4000～5000個細胞)接種于96孔培養(yǎng)板中。

1.3.3.3 培養(yǎng)細胞

將培養(yǎng)板移入CO2培養(yǎng)箱，在37℃、體積分數(shù)5% CO2及飽和濕度條件下，培養(yǎng)24h。

1.3.3.4 加入提取物

將不同處理的大豆提取液過0.22μm濾膜除菌，每孔分別加入濾液100μL，同時設置5個平行孔，空白對照為RPMI 1640培養(yǎng)液。

1.3.3.5 呈色

加藥完畢繼續(xù)孵育48h后，每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL，37℃繼續(xù)孵育4h，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，控干后每孔加入150μL DMSO，輕輕振蕩15min，使藍紫色甲瓉結晶物充分溶解。

1.3.3.6 比色

選擇波長490nm，在酶標儀上測定各孔光密度值(OD490)，記錄結果。

1.3.3.7 抑制率計算公式

1.3.4 統(tǒng)計學分析

采用統(tǒng)計學軟件SPSS 17.0對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，組間檢驗用ANOVA方差分析，數(shù)據(jù)以χ±s表示；方差齊性時用最小顯著差法(least significant difference，LSD)檢驗，方差不齊時用Tamhane,s檢驗；檢驗的顯著性水平為α=0.05(顯著水平)和α=0.01(極顯著水平)。

2 結果與分析

2.1 乙醚脫脂處理大豆抗癌肽提取正交試驗

MTT法檢測結果表明，目數(shù)、脫脂粉添加量、超聲波處理時間正交試驗的9組大豆提取物對胃癌細胞抑制作用表現(xiàn)為：細胞折光性增加，壁厚、變圓、黏連、破碎、脫落，OD值明顯下降。從表2中R值可以看出因素主次順序為：C＞B＞A從K值可知，最佳組合為C3B3A2，即在乙醚作為脫脂劑的條件下，大豆抗癌肽的最佳提取條件為超聲波處理時間80min、脫脂粉添加量3g、過篩目數(shù)80目。經(jīng)驗證實驗此時癌細胞生長抑制率達到39.03%。

表2 乙醚脫脂條件大豆抗癌肽提取正交試驗設計及結果Table 2 Orthogonal array design for optimizing extraction of anticancer peptides from ether-defatted soybean powder and corresponding experimental results

2.2 石油醚脫脂處理大豆抗癌肽提取正交試驗

表3 石油醚脫脂條件大豆抗癌肽提取正交試驗設計及結果Table 3 Orthogonal array design for optimizing extraction of anticancer peptides from petroleum ether-defatted soybean powder and corresponding experimental results

經(jīng)過石油醚脫脂，超聲波處理的大豆提取物對體外培養(yǎng)的人胃癌細胞有抑制作用。加入不同處理樣，其胃癌細胞的抑制作用明顯不同。由表3中R值可知因素主次順序為：A＞C＞B。從K值可知，最佳組合為C2A2B2，即在石油醚作為脫脂劑的條件下，大豆抗癌肽的最佳提取條件為超聲波處理時間60min、過篩目數(shù)80目、脫脂粉添加量2g。經(jīng)驗證實驗此時癌細胞生長抑制率達到25.59%。

2.3 正己烷脫脂處理大豆抗癌肽提取正交試驗

試驗以對胃癌細胞SGC-7901的生長抑制作用作為反映抗癌活性的指標。由表4中R值可知因素主次順序為：C＞B＞A，從K值可知，最佳組合為C1B1A1，即在正己烷作為脫脂劑的條件下，大豆抗癌肽的最佳提取條件為超聲波處理時間40min、脫脂粉添加量1g、過篩目數(shù)40目。驗證實驗表明，此時癌細胞生長抑制率達到19.21%。

表4 正己烷脫脂條件大豆抗癌肽提取L9(33)正交試驗設計及結果Table 4 Orthogonal array design for optimizing extraction of anticancer peptides from n-hexane-defatted soybean powder and corresponding experimental results

大豆提取液作用48h后，乙醚、石油醚、正己烷3組試驗在最佳提取條件下癌細胞的抑制率依次是(39.03± 3.86)%、(25.59±2.64)%、(19.21±3.19)%。通過方差分析，正交試驗的各試驗組別之間差異不顯著(P＞0.05)；大豆脫脂預處理脫脂劑各組間兩兩比較表明，細胞抑制率均不同，差異顯著(P＜0.05)，進一步作兩兩比較，LSD及SNK(student-newman-keuls)檢驗表明：乙醚脫脂與石油醚脫脂處理之間差異顯著，P=0.013＜0.05；乙醚脫脂處理與正己烷脫脂之間差異極顯著，P＝0.004＜0.01；石油醚脫脂與正己烷脫脂處理之間P＝0.629＞0.05，差異不顯著。表明不同脫脂預處理對癌細胞生長的影響大于試驗組別，3種脫脂劑預處理中，乙醚脫脂處理對癌細胞生長抑制率最高。

通過大豆抗癌提取物雙縮脲反應和茚三酮反應均呈陽性，說明該抗癌物為肽類物質。國內(nèi)外學者研究表明大豆中一些具有抗癌活性的物質如大豆異黃酮、大豆皂甙、凝集素、蛋白酶抑制劑等，其抗癌作用主要集中在抗乳腺癌、結腸癌、前列腺癌這一部分[18-20]。其中，大豆異黃酮在體外主要是抑制前列腺癌細胞系的生長。而且只有其在超生理水平的條件下(IC50＞50μmol/L)，即濃度達到能引起生長抑制時，才能觀察到前列腺癌細胞凋亡時出現(xiàn)的DNA片段[21]。相反，在低濃度條件下，大豆肽能抑制體外胃癌細胞的生長。Park等[22]研究表明大豆中存在一種名為Lunasin的抗癌肽，這種肽具有強烈的抑癌作用。這對今后大豆抗癌肽的分離精制，提取其高附加值部分有指導意義。

3 結 論

通過體外細胞試驗可以看出，大豆抗癌肽的初步提取物有明顯抑制癌細胞增殖的作用。 在最優(yōu)條件下3種脫脂劑預處理對癌細胞生長抑制率分別為39.03%、25.59%、19.21%。因此，大豆抗癌肽的最佳提取條件為選用乙醚脫脂、過篩目數(shù)80目、脫脂粉添加量3g、超聲波處理時間80min，經(jīng)驗證實驗，此條件下，癌細胞增殖抑制率達到39.03%。

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Extraction and Activity Evaluation of Anticancer Peptides from Soybean

GE Xi-juan，XU Yan，YANG Li-li，WU Fei*
(School of Food, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Dried soybean powder was defatted with either petroleum ether, n-hexane or ethyl ether before the extraction of anticancer peptides with PBS buffer (pH 7.4) under ultrasonic assistance. In order to maximize the inhibitory rate of anticancer peptides against human gastric cancer cell line SGC-7901, a three-factor, three-level orthogonal array design was used to optimize three operating conditions including material particle size, solid-to-liquid ratio and ultrasonic treatment time. Anticancer activity evaluation of anticancer peptides extracted from defatted soybean was carried out using MTT assay. The optimal extraction conditions were determined as follows∶ material particle size 80 mesh, solid-to-liquid ratio 1∶5 (g/mL) and ultrasonic treatment time 80 min. The inhibitory rate of the extract under these conditions against the proliferation of human gastric cancer cell line SGC-7901 was 39.03%.

soybean；anticancer peptide；extraction；biological activity

TS214.6

A

1002-6630(2011)16-0027-04

2010-10-20

哈爾濱市科技創(chuàng)新人才基金項目(2008RFQXN016)；黑龍江省教育廳科學技術研究面上項目(11531016)

葛錫娟(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為食品科學。E-mail：xijuange@163.com

*通信作者：吳非(1968—)，女，教授，博士，研究方向為大豆產(chǎn)品精深加工。E-mail：wfneau@163.com