馬虎飛，王思敏，楊章民

陜北野生枸杞多糖的體外抗氧化活性

馬虎飛，王思敏，楊章民*

(陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710062)

目的：測定陜北野生枸杞中總糖含量、糖醛酸含量以及體外抗氧化活性。方法：采用苯酚-硫酸法，測定枸杞提取物的總糖含量；用硫酸-咔唑法，測定枸杞多糖的糖醛酸含量；通過紅外光譜技術(shù)初步分析枸杞多糖基團(tuán)的構(gòu)成；并以VC為對照，比較枸杞多糖對二苯代苦味?；?DPPH)自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基的體外抗氧化活性及還原力。結(jié)果：陜北枸杞提取物中的總糖含量為58.31%，糖醛酸含量為32.17%。 當(dāng)枸杞多糖的質(zhì)量濃度為1mg/mL時(shí)，對DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基清除率分別為81.30%、50.33%和60.57%，還原能力比VC稍低。結(jié)論：陜北野生枸杞多糖有很強(qiáng)的抗氧化活性。

陜北；枸杞；多糖；自由基；體外抗氧化活性

枸杞(Lycium chinense Miller)為茄科枸杞屬(Lycium Linn.)植物，其果實(shí)是一種“藥食同源”的功能保健性食品，也是一味常用的補(bǔ)肝益腎中藥，其色鮮紅，味酸甜。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)其含有多糖、亞油酸、粗蛋白、維生素(VA、VC、VB1、VB2)、甜菜堿、礦物質(zhì)(鈣、磷、鐵、鋅、錳)等營養(yǎng)成分，枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharides，LBPs)為枸杞中的主要活性成分之一[1]。藥理研究表明，枸杞多糖具有抗腫瘤、抗衰老、抗疲勞、降血脂、降血糖、調(diào)節(jié)免疫等多種保健功能[2]。LBPs是枸杞的主要功效成分，具有良好的抗氧化活性[3]。國內(nèi)外類似的研究也發(fā)現(xiàn)，合理攝入天然抗氧化劑可預(yù)防和延緩癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化、癡呆和衰老等退行性疾病的發(fā)生與發(fā)展[4-6]。

枸杞屬幾乎在我國各省均有野生分布或栽培，共有7個(gè)種3個(gè)變種，其中最負(fù)盛名的當(dāng)屬寧夏枸杞。陜北枸杞因能適應(yīng)各種惡劣的生態(tài)環(huán)境(耐旱、耐寒、耐沙塵、抗輻射)，生長于貧瘠的溝梁土壤，加之當(dāng)?shù)厝罕妼ζ渌幱脙r(jià)值不甚了解及毀滅性利用，致使陜北野生枸杞的存在與分布量逐年降低，致使該野生資源處于越來越稀少的狀態(tài)，對其利用及保護(hù)迫在眉睫，也是保護(hù)陜北脆弱的生態(tài)環(huán)境所需，然而目前關(guān)于陜北野生枸杞多糖有何利用價(jià)值報(bào)道較少。本研究擬在體外對其提取物中多糖的抗氧化活性和還原能力進(jìn)行測定，以期為其開發(fā)利用、資源保護(hù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用枸杞采集自陜北榆林地區(qū)橫山縣。

1,1-二苯基-2-苦基肼(1,1-dipheny1-2-picrylhydrazyl，DPPH)、考馬斯亮藍(lán)G-250、鐵氰化鉀[K3Fe (CN)6]、三氯乙酸(TCA)、抗壞血酸 美國Sigma公司；二丁基羥基甲苯(BHT)、氮藍(lán)四唑(NBT)、吩嗪硫酸甲脂(PMS)、還原型輔酶(NADH)、2-脫氧-D-核糖(DR) 德國Applichem公司；溴化甲(KBr)、甲醇、三氯化鐵(FeCl3)、雙氧水以及無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TU1810紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器公司；冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Spectrum GX型紅外光譜儀 美國Perkin-Elmer公司。

1.3 方法

1.3.1 枸杞多糖的分離純化

稱取100g陜北野生枸杞，粉碎后脫脂，將粉末置于圓底燒瓶中加入95%乙醇，攪拌、80℃水浴，冷凝回流4 h，倒出乙醇，自然干燥。除去脂肪后，加入蒸餾水，于80℃水浴4h，重復(fù)2次，離心取上清液，將上清液收集到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，抽真空濃縮，濃縮液加無水乙醇沉淀過夜，重復(fù)3次。用反復(fù)凍融除蛋白10次以上，隨后將濾液裝入透析袋內(nèi)透析2d，最后在冷凍干燥機(jī)上冷凍干燥，得枸杞多糖提取物(LBP)。

1.3.2 總糖、糖醛酸及蛋白質(zhì)含量的測定

總糖含量測定采用苯酚-硫酸法[7]，糖醛酸分析含量采用硫酸-咔唑法[8]，蛋白含量檢測采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[9]。

1.3.3 野生枸杞多糖的紅外光譜分析

稱取5mg的LBP，與750mg KBr充分混勻，壓片，紅外光譜儀于4000～650cm-1波數(shù)范圍內(nèi)掃描。

1.3.4 DPPH自由基清除率的測定

參照Kumaran等[10]報(bào)道的方法進(jìn)行：吸取不同質(zhì)量濃度樣品1mL于試管中，然后依次加入3mL 0.004% DPPH甲醇溶液，充分混勻，避光靜置20min后，以甲醇作空白對照，517nm波長測吸光度，以蒸餾水代替樣品液作陰性對照，VC作陽性對照。

式中：A1為樣品吸光度；A2為蒸餾水吸光度。

1.3.5 對超氧陰離子自由基清除率的測定

參照張改平等[11]報(bào)道的方法進(jìn)行：吸取不同質(zhì)量濃度樣品液1mL于試管中，依次加入1mL 0.078mol/L NBT，1mL 0.468mol/L NADH，最后加入0.4mL的0.06mol/L PMS溶液，室溫?fù)u勻，后靜置5min，于560nm波長處測定吸光度，調(diào)零組用不同質(zhì)量濃度樣品液1mL，0.4mL蒸餾水代替PMS溶液調(diào)零，用蒸餾水作陰性對照，VC作陽性對照，清除率計(jì)算如上所述。

1.3.6 對羥自由基清除作用的測定

參照Siddhuraju等[12]報(bào)道的方法進(jìn)行：取不同質(zhì)量濃度的樣品液1mL，先后加入1.5mL反應(yīng)液[含0.1mmol/L EDTA、0.1mmol/L FeCl3和2.8mmol/L DR的磷酸鹽緩沖液(pH7.4)]，0.35mL H2O2(20mmol/L)，37℃恒溫水浴作用40min后，終止反應(yīng)，于532nm波長處測定吸光度，蒸餾水為陰性對照，VC為陽性對照，抑制率計(jì)算同上所述。

1.3.7 還原力的測定

參照Kumaran等[13]報(bào)道的方法進(jìn)行：將 1mL不同質(zhì)量濃度的樣品液分別與2.5mL磷酸鹽緩沖液(pH6.6)及2.5mL鐵氰化鉀(1%)混合，混合物在50℃水浴中孵育20min，然后加入2.5mL的TCA(10%)終止反應(yīng)，離心10min，取上清液2.5mL，依次加入2.5mL無水乙醇和0.5mL FeCl3(0.1%)，混勻后于700nm波長處測定吸光度，蒸餾水作空白對照，VC作陽性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 陜北野生枸杞中總糖的含量

所得結(jié)果做回歸方程為：y =7.712x+0.006R2(R2= 0.994，y為吸光度，x為質(zhì)量濃度)，計(jì)算出提取物中的總糖含量為58.3%。

2.2 糖醛酸和殘留蛋白含量

所得結(jié)果做回歸方程為：y=0.0061x-0.052(R2= 0.9865，y為吸光度，x為質(zhì)量濃度)，計(jì)算出樣品提取物中糖醛酸的含量為32.17%；回歸方程式y(tǒng)=0.0027x-0.035(R2=0.9925，y為吸光度，x為質(zhì)量濃度)，除蛋白后樣品中的蛋白殘留為0.4%。

2.3 LBP的紅外光譜分析

圖1可以看出，3440cm-1處出現(xiàn)一寬的吸收峰，反映了O-H和N-H分別伸縮振動(dòng)引起，為多糖間形成的分子間氫鍵；2925cm-1附近的尖峰，由-CH2-基團(tuán)的C-H伸縮振動(dòng)引起的；1645cm-1處的吸收峰為酰胺羰基特征吸收峰，由-COOH或-CO-基團(tuán)的C＝O非對稱伸縮振動(dòng)引起的；1150cm-1附近的吸收峰，為含有環(huán)C-O-C鍵的吡喃糖特征吸收峰。紅外光譜的檢測結(jié)果表明陜北野生枸杞是一種酸性糖，此結(jié)果與硫酸-咔唑法分析的結(jié)果一致。

圖1 陜北野生枸杞多糖的紅外光譜Fig.1 IR spectra of polysaccharide of wild Lycium barbarum from north Shaanxi province

2.4 LBP對DPPH自由基的清除率

圖2 野生枸杞多糖對DPPH自由基清除率Fig.2 Scavenging activities of polysaccharides from wild Lycium barbarum on DPPH radicals

通過測定清除DPPH自由基的方法測定枸杞多糖清除自由基的活性，與VC進(jìn)行比較。DPPH自由基通常被用來作為底物，因DPPH自由基是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，其孤對電子在517nm波長附近有強(qiáng)吸收；當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，孤對電子被配對，吸收消失或減弱。因此通過測定吸收減弱的程度，來評價(jià)抗氧化劑的抗氧化活性[12]。如圖2所示，陜北野生枸杞多糖有顯著的清除DPPH自由基的能力，且表現(xiàn)出良好的劑量依賴關(guān)系。在質(zhì)量濃度為0.2mg/mL時(shí)，枸杞多糖對DPPH自由基的清除能力雖然低于VC，但隨著質(zhì)量濃度的升高其清除能力增強(qiáng)，尤其是當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到1mg/mL時(shí)，枸杞多糖的清除率達(dá)到81.30%，接近于VC。枸杞多糖對DPPH自由基有清除能力可能是由于多糖中的羥基具有供氫質(zhì)體能力的結(jié)果。可見陜北野生枸杞多糖具有明顯清除DPPH自由基的能力。

2.5 LBP對超氧陰離子自由基的清除率

超氧陰離子自由基作為多種活性氧的前體，能對生物體產(chǎn)生損傷。已知超氧陰離子自由基可在體內(nèi)產(chǎn)生，它的氧化性較弱，但它會(huì)分解成氧化性很強(qiáng)的單線態(tài)氧自由基或羥自由基，而單線態(tài)氧和羥自由基能使DNA的單股鏈斷裂[14]。由圖3可知，陜北野生枸杞多糖能有效地清除超氧陰離子自由基，清除能力隨著質(zhì)量濃度增大而增強(qiáng)。在0.2～1mg/mL劑量濃度范圍內(nèi)，清除超氧陰離子自由基能力弱于VC，但隨著質(zhì)量濃度增加，在0.6mg/mL和0.8mg/mL，其清除能力幾乎與VC相當(dāng)，甚至超越VC；當(dāng)質(zhì)量濃度為1mg/mL，清除率是50.33%，這種結(jié)果表明在清除超氧陰離子自由基時(shí)陜北枸杞多糖具有顯著的效果。

圖3 野生枸杞多糖對超氧陰離子自由基清除率Fig.3 Scavenging activities of the polysaccharides from wild Lycium barbarum on superoxide anion

2.6 LBP對羥自由基的清除率

圖4 野生枸杞多糖對羥自由基清除率Fig.4 Scavenging activities of the polysaccharides from wild Lycium barbarum on hydroxyl radicals

羥自由基和其他自由基相比，是最活躍的體內(nèi)活性氧，是在生命活動(dòng)的氧化代謝過程中產(chǎn)生的，可導(dǎo)致大量的疾病發(fā)生。對羥自由基清除率的檢測也是抗氧化劑抗氧化活性的指標(biāo)之一，而且對研究自由基的生物有著重要意義。由圖4可知，陜北枸杞多糖清除羥自由基的能力在特定質(zhì)量濃度梯度范圍內(nèi)強(qiáng)于VC，并且隨著質(zhì)量濃度增強(qiáng)，清除能力增強(qiáng)。在質(zhì)量濃度為1mg/mL時(shí)，清除羥自由基的能力是60.57%，強(qiáng)于清除超氧陰離子的能力。

2.7 LBP還原力的測定

多種抗氧化活性的機(jī)制已經(jīng)被闡明了，它們是還原力機(jī)制，鏈引發(fā)的抑制機(jī)制，過渡金屬離子催化劑的折疊機(jī)制，過氧化物的分解和自由基清除機(jī)理[15]。一種化合物的還原能力可以作為潛在的抗氧化活性的一個(gè)重要指標(biāo)。由表1可知，陜北野生枸杞多糖和VC在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)都有顯著的還原能力，并且隨著質(zhì)量濃度的增加而增加。陜北野生枸杞多糖的還原力明顯地低于VC?？傊谠搶?shí)驗(yàn)所測定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，枸杞多糖的還原能力說明枸杞多糖能作為一種良好的電子供應(yīng)者，也能終止自由基鏈的反應(yīng)，具有一定的抗氧化能力。

表1 野生枸杞多糖還原力的測定結(jié)果Table 1 Reducing power of the polysaccharides from wild Lycium barbarum

3 結(jié) 論

對陜北野生枸杞中提取的粗多糖的研究表明，枸杞多糖有較好的清除DPPH自由基、超氧陰離子自由基及羥自由基的能力，并且同質(zhì)量濃度樣品液的部分指標(biāo)與VC的自由基清除能力相當(dāng)，說明它有良好的抗氧化活性，可以作為一種天然的抗氧化劑，值得開發(fā)和利用；由于陜北枸杞多糖特殊的生長環(huán)境，它的體內(nèi)抗氧化活性和機(jī)制仍是今后研究的重點(diǎn)。

[1]錢彥叢, 宇文萍. 枸杞子的化學(xué)成分及藥理研究新進(jìn)展[J]. 中醫(yī)藥學(xué)報(bào), 2000, 28(4):33-35.

[2]黃秋婷, 陳遠(yuǎn)峰. 枸杞多糖的研究及其進(jìn)展[J]. 食品研究與開發(fā), 2006, 27(1):172-174.

[3]KONG Q, LILLEHEI K O. Antioxidant inhibitors for cancer therapy[J]. Medical Hypotheses, 1998, 51(5):405-409.

[4]KALIORA A C, DEDOUSSIS G V Z, SCHMIDT H. Dietary antioxidants in preventing atherogenesis[J]. Atherosclerosis, 2006, 187(1):1-17.

[5]WILLIAM, PRYOR A. Vitamin E and heart disease basic science to clinical intervention trials[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2000, 28(1):141-164.

[6]OSAWA T. Protective role of dietary polyphenols in oxidative stress[J]. Mechanisms of Ageing and Development, 1999, 111(2):133-139.

[7]黃建華, 范文秀. 白靈菇多糖的提取及含量的測定[J]. 光譜實(shí)驗(yàn)室, 2005, 22(5): 1014-1016.

[8]劉翠平, 董群, 方積年. 一種判定多糖中有無糖醛酸殘基的簡易新方法[J]. 中草藥, 2001, 32(5):404-407.

[9]劉小華, 張美霞, 于春梅, 等. 考馬斯亮藍(lán)法測定殼聚糖中蛋白的含量[J]. 中國交通醫(yī)學(xué)雜志, 2006, 20(2):159-160.

[10]KUMARAN A, KARUNAKARAN R J. Activity-guided isolation and identification of free radical-scavenging components from an aqueous extract of Coleus aromaticus[J]. Food Chemistry, 2007, 100(1):356-361.

[11]張改平, 楊建雄, 朱玉安. 紫草提取物的體外抗氧化活性研究[J].武漢植物學(xué)研究, 2007, 25(5):490-493.

[12]SIDDHURAJU P, BECKER K. The antioxidant and free radical scavenging activities of processed cowpea (Vigna unguiculata (L.) Walp) seed extracts[J]. Food Chemistry, 2007, 101(1):10-19.

[13]KUMARAN A, JOEL KARUNAKRAN R. Antioxidant and free radical scavenging activity of an aqueous extract of Coleus aromaticus[J]. Food Chemistry, 2006, 97(1):109-114.

[14]BAYDAR N G, OZKAN G, YASAR S. Evaluation of the antiradical and antioxidant potential of grape extracts[J]. Food Control, 2007, 18:1131-1136.

[15]PELLEGRINI N, PROTEGGENTE A, PANNALA A, et al. Antioxidant activity applying an improved ABTS+radical cation decolorisation assay[J]. Free Radical Bio Med, 1999, 26:1231-1237.

in vitro Antioxidant Activities of Polysaccharides from Wild Lycium barbarum in North Shaanxi

MA Hu-fei，WANG Si-min，YANG Zhang-min*
(College of Life Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710062, China)

Objective: To determine the content of total polysaccharides (LBP) and uronic acid from wild Lycium barbarum, as well as their in vitro antioxidant activities. Methods: phenol-sulfuric acid and sulfuric acid-carbazole method were used to evaluate the total contents of LBP and uronic acid, respectively. LBP structural composition was detected by IR spectra. DPPH, superoxide anion radicals, hydroxyl radical scavenging and reducing power of LBP were analyzed for antioxidant activity in vitro, with VC as control. Results: The polysaccharides and uronic acid content was 58.31% and 32.17%, respectively, in the extract of wild plants. At 1 mg/mL of polysaccharide, the DPPH, superoxide radical and hydroxyl radicals-scavenging activities was 81.30%, 50.33% and 60.57%, respectively, while the reducing power was slightly lower than that of VC. These results suggested that polysaccharides in extract from wild plants show potent antioxidant activities, which might provide a scientific basis for further exploitation and the significance of protecting Lycium barbarum in north Shaanxi province.

north Shaanxi province；Lycium barbarum；polysaccharide；free radical；antioxidant activity in vitro

O636.1

A

1002-6630(2011)03-0060-04

2010-04-27

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30870303)；陜西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(SJ08C102)

馬虎飛(1982—)，男，碩士研究生，主要從事應(yīng)用微生物學(xué)研究。E-mail：mhfwsm2006@163.com

*通信作者：楊章民(1966—)，男，副教授，博士，主要從事分子生物學(xué)與應(yīng)用微生物學(xué)研究。

E-mail：yzhangmin@snnu.edu.cn.