彭 哲綜述,朱朝敏審校

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院感染消化科 400014)

結(jié)核分枝桿菌RD1區(qū)研究進(jìn)展

彭 哲綜述,朱朝敏△審校

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院感染消化科 400014)

分枝桿菌,結(jié)核;差別1區(qū);ESX-1

根據(jù)WHO的報(bào)告,中國(guó)是全球結(jié)核病高發(fā)病國(guó)家之一,患者數(shù)位居世界第2位,僅次于印度[1]。因此,控制和預(yù)防結(jié)核病已成為當(dāng)務(wù)之急。1999年Behr等[2]用DNA芯片技術(shù)比較了結(jié)核分枝桿菌H37Rv,牛結(jié)核分枝桿菌和卡介苗(BCG)3者的全基因組,發(fā)現(xiàn)牛結(jié)核分枝桿菌基因組與結(jié)核分枝桿菌H37Rv相比,有11個(gè)差別區(qū)(region of difference,RDs),BCG則在牛分枝桿菌的基礎(chǔ)上,還多了5個(gè)差別區(qū),相對(duì)于結(jié)核分枝桿菌H37Rv共有129個(gè)開放讀碼框缺失。其中差別1區(qū)(region of difference 1,RD1)是惟一的BCG基因組缺失,而且是致病性分枝桿菌存在的區(qū)域。RD1區(qū)這一獨(dú)特的遺傳缺失區(qū)域,不禁讓人聯(lián)想它在結(jié)核分枝桿菌(mycobacteriurm tuberculosis,M TB)中的毒力機(jī)制和在宿主的免疫反應(yīng)中所發(fā)揮的作用,因此RD1區(qū)也成為目前結(jié)核研究的熱點(diǎn)。

1 RD1區(qū)的結(jié)構(gòu)及其編碼的蛋白

RD1區(qū)基因全長(zhǎng)9 455 bp,它包括9個(gè)開放讀碼框(Rv3871～3879c),分別編碼9種蛋白。Rv3871蛋白含591個(gè)氨基酸,基因生物信息學(xué)分析表明在核苷酸的第250～273和1 126～1 149位上具有AAA A TP酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域,與Rv3870均可能為FtsK-SpoⅢE A TP酶家族成員。Rv3872基因編碼PE35蛋白,它與Rv3873編碼的PPE68蛋白分別是PE和PPE蛋白家族成員。這兩大富含甘氨酸的蛋白家族在基因組中廣泛分布,接近編碼總量的10%,可能與抗原變異、干擾抗原提呈等過程相關(guān),具有重要的免疫學(xué)意義。Rv3874和Rv3875分別編碼兩個(gè)低相對(duì)分子質(zhì)量的分泌蛋白,培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)和6 kD早期分泌抗原靶(ESA T-6),它們均是ESA T-6/WXG100家族成員。這兩個(gè)基因以單拷貝形式分布于M TB中,由同一個(gè)啟動(dòng)子調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄,轉(zhuǎn)錄后以緊密的1∶1異二聚體高親和性形式分泌出細(xì)胞壁,是RD1區(qū)編碼的關(guān)鍵毒力蛋白[3]。Rv3876編碼N端富含脯氨酸的蛋白。Rv3877編碼膜蛋白,有11個(gè)轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域,可以穿過脂質(zhì)雙分子層,提示其可能是跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的通道。Rv3878編碼M TB27.4蛋白,只存在于M TB H37Rv株、Erdman株和牛分枝桿菌中。該蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì),只有少量為分泌蛋白。Rv3879c編碼的蛋白包含729個(gè)氨基酸,它在分枝桿菌中顯示了其基因序列多態(tài)性,該蛋白并未發(fā)現(xiàn)有跨膜結(jié)構(gòu)和分泌信號(hào)。

2 RD1區(qū)與ESA T-6分泌系統(tǒng)1類(ESX-1)蛋白質(zhì)分泌轉(zhuǎn)運(yùn)途徑

Stanley等[4]在篩選RD1區(qū)的毒力基因時(shí),發(fā)現(xiàn)由RD1區(qū)的部分基因及其擴(kuò)展區(qū)構(gòu)成了一套獨(dú)特的結(jié)核桿菌毒力蛋白分泌系統(tǒng),其中包括Rv3870、Rv3871、Rv3877 3個(gè)組成元件和ESA T-6、CFP-10兩個(gè)反應(yīng)底物。將其命名為分枝桿菌分泌系(SNM)獨(dú)立分泌系統(tǒng),也被稱為ESX-1。在RD1區(qū)的基因中, Rv3873和Rv3876并不影響ESA T-6和CFP-10分泌,而且在一些臨床分離的M TB毒力株中觀察到Rv3878和RV 3879c處于不完整的狀態(tài)[5],因此認(rèn)為這4個(gè)基因不是ESX-1的組成部分。其后實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),為維持ESX-1的分泌功能,除了Stanley等[4]所觀察到的外,可能還包括總量不少于14個(gè)的組成元件,它們很多位于RD1區(qū)外,并且根據(jù)不同的分枝桿菌種屬有不同的數(shù)目[6]。ESX-1怎樣將蛋白分泌出極厚的M TB細(xì)胞壁,具體過程現(xiàn)在并不清楚,但已知ESA T-6和CFP-10并無(wú)經(jīng)典分泌引導(dǎo)序列或信號(hào)肽,因此其分泌表達(dá)肯定不依賴于經(jīng)典的Sec途徑。一些實(shí)驗(yàn)推測(cè),它們可能是多個(gè)蛋白質(zhì)協(xié)同作用來(lái)完成分泌的。在它核心組成成分中,Rv3869、Rv3870和Rv3877編碼的蛋白,分別有1、3和11個(gè)跨膜區(qū)域,它們與Rv3871、Rv3868結(jié)合在一起,形成一套利用ATP水解供能的膜結(jié)合分泌復(fù)合物。ESA T-6和CFP-10被分泌前先形成緊密的1∶1異二聚體,當(dāng)Rv3871識(shí)別CFP-l0無(wú)序羧基末端的7個(gè)氨基酸后,與Rv3870在細(xì)胞膜上形成活性A TP酶,同時(shí)將信號(hào)經(jīng)Rv3870傳遞給膜結(jié)合分泌復(fù)合物,打開通道(Rv3877蛋白),水解A TP后將ESA T-6/CFP-10異二聚體分泌出細(xì)胞膜[6]。目前還有很多蛋白只知道是這一分泌過程所必需的,但功能未明。例如Rv3883c編碼的類似枯草桿菌溶素的絲氨酸蛋白酶、Rv3872編碼的PE35等,需要進(jìn)一步研究[7]。

Rv3616c-Rv3614c基因區(qū)是ESX-1分泌系統(tǒng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)部位。Rv3616c編碼蛋白產(chǎn)物EspA,能被ESX-1系統(tǒng)分泌,它與ESA T-6、CFP-10分泌是互相依賴的,缺少其中任何一個(gè),其余底物的分泌都將失敗,而Rv3849編碼的EspR能活化Rv3616c-Rv3614c基因啟動(dòng)子,同時(shí)EspR自身也能被ESX-1系統(tǒng)分泌。這樣便形成了一個(gè)負(fù)反饋調(diào)節(jié)圈,使ESX-1系統(tǒng)的分泌處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)[8]。除了EspR外,反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白PhoP也是Rv3616c-Rv3614c的調(diào)節(jié)因子。如果PhoP基因發(fā)生點(diǎn)突變,則PhoP不能同該DNA功能結(jié)合域結(jié)合,從而降低Rv3616c-Rv3614c的表達(dá),最終使ESX-1分泌失效[9]。

ESX-1非常類似于革蘭陰性桿菌中經(jīng)典的Ⅳ型分泌系統(tǒng)。例如:與CFP-10分泌相似,Ⅳ型分泌系統(tǒng)也是通過識(shí)別底物非結(jié)構(gòu)化的羧基末端,直接將其分泌出細(xì)胞膜的。而且識(shí)別單位通常為成對(duì)的FtsK-SpoⅢE A TP酶,并具有2個(gè)跨膜區(qū)和1個(gè)胞漿區(qū)。而ESX-1分泌系統(tǒng)的Rv3870和Rv3871特征與其吻合。但ESA T-6和CFP-10能存在于體外培養(yǎng)的培養(yǎng)液中,這與革蘭陰性菌Ⅳ型分泌機(jī)制不同,它們是通過與宿主細(xì)胞的相互作用來(lái)促進(jìn)分泌的。因此推測(cè)ESX-1并不僅僅是M TB的毒力系統(tǒng),可能還具有其他生理功能。由于ESX-1由1組獨(dú)特的蛋白構(gòu)成,主要的分泌底物都是ESA T-6/WXG100蛋白家族成員,并且蛋白在分泌過程中是相互依存的,只存在于革蘭陽(yáng)性菌中,這使其不同于已知的Ⅰ～Ⅵ型分泌系統(tǒng),因此將這一新類型的分泌體系稱為Ⅶ型分泌系統(tǒng)[6]。

3 RD1區(qū)的毒力作用機(jī)制

研究發(fā)現(xiàn)引入RD1的BCG在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上有與結(jié)核毒力株相類似的病理表現(xiàn),而失去RD1的M TB其致病能力明顯減弱[10]。Stanley等[4]發(fā)現(xiàn)的ESX-1分泌系統(tǒng),則合理的解釋了RD1的毒力來(lái)源。ESX-1對(duì)宿主的毒力作用表現(xiàn)在許多方面。實(shí)驗(yàn)表明,ESX-1能夠誘發(fā)肺表面上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞溶解,這有助于結(jié)核桿菌侵入肺間質(zhì),主要機(jī)制可能是ESA T-6在宿主細(xì)胞膜表面形成通道,致死性的離子流最終導(dǎo)致細(xì)胞溶解壞死[11]。還有實(shí)驗(yàn)認(rèn)為ESX-1分泌的CFP-10/ESA T-6復(fù)合物起分子信號(hào)的作用。它們通過與宿主細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合以調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的行為[12]。Davis和Ramokrishnan[13]通過對(duì)感染斑馬魚的海分枝桿菌的研究發(fā)現(xiàn)也支持這一點(diǎn),在早期感染階段,ESX-1的一個(gè)或多個(gè)的成分使感染的巨噬細(xì)胞分泌聚集信號(hào),誘導(dǎo)未感染的巨噬細(xì)胞聚集,并吞噬新形成的肉芽腫,導(dǎo)致結(jié)核桿菌快速增長(zhǎng)和擴(kuò)散,而ESX-1缺失的海分枝桿菌在巨噬細(xì)胞間的擴(kuò)散明顯減弱。如果巨噬細(xì)胞內(nèi)的吞噬溶酶體吞噬了M TB,它分泌的CFP-10/ESA T-6復(fù)合物則在溶酶體內(nèi)酸性條件下解離,ESA T-6將結(jié)合到脂質(zhì)體上并導(dǎo)致其溶解,M TB從而逃入細(xì)胞質(zhì)而避免被殺死[14]。ESX-1其他的致病性效應(yīng)還包括抑制巨噬細(xì)胞的信號(hào)傳遞,以此阻礙促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生等[4]。以上研究表明,RD1區(qū)編碼的ESX-1對(duì)M TB的致病性發(fā)揮了重要作用。

4 RD1區(qū)編碼蛋白的免疫原性

隨著MTB的許多T細(xì)胞抗原被鑒定,令人驚訝的是在RD1區(qū)的9個(gè)基因中,除Rv3876、Rv3877外,其余基因編碼的蛋白都具有T細(xì)胞抗原決定簇,這可能形成了一個(gè)免疫原性島。但不同的抗原誘發(fā)T細(xì)胞反應(yīng)的能力并不一樣,Brusasca等[15]將Rv3871～Rv3875、Rv3878編碼的6種蛋白測(cè)試感染結(jié)核豚鼠的遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH),發(fā)現(xiàn)只有CFP-10和EAST-6有明顯的DTH反應(yīng),而Rv3873(PPE68)僅引出2～4 mm的低水平反應(yīng),其余則為陰性。同時(shí)測(cè)試肺結(jié)核患者的血清抗體陽(yáng)性率,也是以EAST-6和CFP-10最高。另外, Rv3873(PPE68蛋白)在健康對(duì)照組中有陽(yáng)性反應(yīng),考慮是受到廣泛分布在分枝桿菌中PPE家族的交叉反應(yīng)的干擾所致。Caroline等[16]也發(fā)現(xiàn)Rv3872(PE35)、Rv3878、Rv3879c不能誘導(dǎo)C57BL/6小鼠體內(nèi)出現(xiàn)明顯的γ干擾素(IFN-γ)。目前還沒有證據(jù)表明伴侶蛋白R(shí)v3876、膜蛋白R(shí)v3877具有抗原性。

5 RD1區(qū)的相關(guān)應(yīng)用進(jìn)展

5.1 在疫苗方面 BCG是現(xiàn)在預(yù)防結(jié)核病的惟一菌苗,但它在不同地區(qū)的保護(hù)效果差異顯著,一些學(xué)者認(rèn)為BCG在傳代過程中過度減毒降低了其保護(hù)力,后有人將RD1片斷引入BCG,證實(shí)其產(chǎn)生的免疫保護(hù)力超過了未重組的BCG,這為研究者提供了新的思路,即適當(dāng)恢復(fù)BCG的毒力有助于提高疫苗的保護(hù)力[17]。在進(jìn)一步研究RD1區(qū)編碼的蛋白時(shí)又發(fā)現(xiàn)ESA T-6和CFP-10都是誘導(dǎo)IFN-γ分泌的優(yōu)勢(shì)抗原,而IFN-γ可顯著活化巨噬細(xì)胞,提高對(duì)胞內(nèi)結(jié)核菌生長(zhǎng)的抑制作用和殺傷能力,并且ESA T-6是記憶性CD4+T淋巴細(xì)胞的靶分子,能誘導(dǎo)持續(xù)的免疫力[18]。但實(shí)驗(yàn)顯示,只有具備完整ESX-1分泌系統(tǒng)的重組BCG才能誘發(fā)EAST-6特異性的T細(xì)胞反應(yīng),否則,即使重組BCG細(xì)胞質(zhì)內(nèi)具有EAST-6,如不能分泌,也不能誘發(fā)相應(yīng)的T細(xì)胞反應(yīng)[7]。提示疫苗具有有效的抗原分泌是產(chǎn)生免疫保護(hù)作用的關(guān)鍵之一。M TB的許多分泌蛋白都是重要的保護(hù)性抗原,通過對(duì)ESX-1分泌機(jī)制的研究,也許將對(duì)制備新型疫苗有重要幫助。目前丹麥哥本哈根血清研究所研發(fā)的結(jié)核菌Ag85B-ESA T-6融合蛋白疫苗正在進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn),期望在不久將來(lái)可以得到更多高效安全的新疫苗。

5.2 在診斷方面 RD1區(qū)編碼的蛋白中PE35、PPE68、RV 3878、RV 3879c都具有用于血清學(xué)診斷抗原的潛力,但它們的特異性或敏感性均較CFP-10和ESA T-6差。實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)ESA T-6和CFP-10聯(lián)合使用檢測(cè)M TB感染時(shí),其敏感性和特異性均明顯高于結(jié)核菌素純蛋白衍生物(PPD)[19]。它們不僅可將人或牛M TB感染、BCG接種和環(huán)境中的非致病性分枝桿菌區(qū)別開,而且還可將由于BCG接種和接觸非致病性分枝桿菌所造成的PPD假陽(yáng)性區(qū)分開。由于增殖期和非復(fù)制期的M TB在細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)期間都高度表達(dá)ESA T-6。因此,無(wú)論是在活動(dòng)性結(jié)核病還是在感染潛伏期,ESA T-6均可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng),這也為診斷潛伏結(jié)核感染提供了重要的手段。尤其重要的是,它們對(duì)H IV感染的潛伏結(jié)核病患者也有較高的敏感性和特異性,這有助于盡早對(duì)這些患者使用抗結(jié)核預(yù)防治療[20]?，F(xiàn)國(guó)際上已有將ESA T-6和CFP-10作為診斷抗原的IFN-γ體外釋放檢測(cè)商品試劑盒供應(yīng),如Quanti-FERON-TBGOLD(Cellestis L td.,Carnegie,Victoria,Australia)與T-SPOT.TB test(Oxford Immunotec,Abingdon,UK)等。FDA已批準(zhǔn)將該方法用于結(jié)核病潛伏感染的檢測(cè)。以上實(shí)驗(yàn)及檢測(cè)方法為結(jié)核病的診斷提供了重要的臨床和試驗(yàn)價(jià)值,值得進(jìn)一步深入研究。

綜上所述,目前對(duì)RD1區(qū)的研究和應(yīng)用都已取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展,但仍不清楚ESX-1的具體分泌機(jī)制,ESA T-6和CFP-10作為毒力蛋白,如何作用于細(xì)胞表面及細(xì)胞內(nèi)成分也尚未完全闡明,而且在M TB中還有與ESX-1同源的其他4個(gè)ESX分泌系統(tǒng),它們之間的關(guān)系及各自的生理功能也需要進(jìn)一步研究,如果能夠解釋這些難題,將可能幫助找到新的結(jié)核藥物的靶向位點(diǎn),以及獲得更加安全有效的新疫苗。

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2010-02-06

2010-05-19)

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