常 明 劉書馨 劉 焱 王志宏 付 瑤 (大連市中心醫(yī)院腎內(nèi)科，遼寧 大連 116033)

近年來的研究表明，p16基因(細(xì)胞周期蛋白激酶抑制物基因)不僅是一種抑癌基因，也是人類細(xì)胞衰老的主導(dǎo)基因。它在衰老細(xì)胞中的表達(dá)比年輕細(xì)胞高10～20倍，是細(xì)胞衰老的標(biāo)志物之一。抑制p16基因表達(dá)，不僅細(xì)胞衰老速度減慢，壽命延長(zhǎng)，而且端粒長(zhǎng)度縮短也減慢;反之，增加p16基因表達(dá)，不僅細(xì)胞衰老速度加快，壽命縮短，端粒長(zhǎng)度縮短也加快，提示調(diào)控p16的表達(dá)直接影響某些細(xì)胞的壽命〔1〕。腎臟功能隨年齡增長(zhǎng)逐漸下降。腎臟衰老在病理上表現(xiàn)為腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化和腎動(dòng)脈硬化，但缺乏特征性改變和特異性標(biāo)志物，限制了腎臟衰老機(jī)制的研究。鑒于p16在細(xì)胞衰老中的重要作用，我們推測(cè)p16可能是腎臟衰老的標(biāo)志之一。因此，本研究以p16為切入點(diǎn)，從基因和蛋白質(zhì)水平觀察p16在大鼠腎臟隨增齡表達(dá)的變化，為進(jìn)一步探討腎臟衰老的機(jī)制尋求理想的衰老標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 大鼠p16引物由北京賽百盛公司合成、小鼠p16單克隆抗體(美國Santa Cruz)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠ⅠgG(美國Santa Cruz)、PCR試劑(TaKaRa生物工程大連有限公司)、ECL顯色試劑(美國 Santa Cruz)、PTC-200 DNA合成儀(美國MJ Research)、SYBR GREENⅠ染料(美國Molecular Probes)、ⅠCYCLER熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad)、MⅠNⅠ-PROTEⅠN2 電泳儀(美國 Bio-Rad 公司)、ALPHAⅠMAGER2200凝膠圖像分析系統(tǒng)(美國Alpha公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及標(biāo)本留取 取1日齡、3月齡和24月齡雄性Wister大鼠(由大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供)各6只，以2%戊巴比妥(0.1 ml/kg)腹腔注射麻醉，取腹正中切口，分離雙側(cè)腎臟，去包膜留取腎組織，腎組織分為2份，1份以10%中性甲醛固定，用于制備石蠟切片，1份置于液氮凍存以提取 RNA和蛋白。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)不同月齡大鼠腎臟p16的mRNA表達(dá) Trizol一步法提取總RNA。紫外分光光度計(jì)測(cè)濃度后取2μg RNA，使用Promega公司的反轉(zhuǎn)錄試劑合成cDNA模板。大鼠p16引物序列為:上游5'-GGTAATAGTGTTTTTAGAGGTG-3'，下游 5'-CTACCCTAACTAATCTATCTAC-3'，片段長(zhǎng)度111 bp。反應(yīng)條件為:94 ℃變性 5 min，94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s、86℃ 15 s(檢測(cè)熒光)，共40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min。GADPH作為 RNA內(nèi)參，引物序列為:上游 5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'，下 游 5'-GGCATGGAC TGTGGTCATGAG-3'，片段長(zhǎng)度116 bp。SYBR GREENⅠ作為檢測(cè)染料。mRNA表達(dá)量用p16拷貝數(shù)/GAPDH拷貝數(shù)比值表示。

1.4 Western印跡分析檢測(cè)不同月齡大鼠腎臟p16蛋白的表達(dá) 根據(jù)試劑盒說明提取腎組織總蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度。取80μg蛋白上樣，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干法轉(zhuǎn)移至聚氟乙烯膜上，封閉液封閉，加入1∶200稀釋的小鼠p16單克隆抗體，4℃過夜。次日0.05%TBST洗膜3次，加入1∶2 000稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠 ⅠgG，室溫?fù)u床1 h，0.05%TBST洗膜3次，ECL顯影。以β-actin的蛋白表達(dá)作為內(nèi)參照，用ALPHAⅠMAGER 2200凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

1.5 腎組織p16的免疫組化染色 采用鏈霉親和素-生物素復(fù)合物技術(shù)(SP)法:腎組織經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋;常規(guī)脫蠟至水，PBS浸泡后3%過氧化氫孵育10 min，PBS洗3次，0.05%胰酶室溫修復(fù)15 min，5%正常山羊血清封閉10 min后加入1∶50稀釋的小鼠p16單克隆抗體，室溫過夜，PBS洗3次后加入生物素標(biāo)記的兔抗小鼠二抗，室溫孵育40 min，PBS洗3次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，室溫孵育40 min，PBS洗3次，DAB顯色5 min，充分沖洗后蘇木素復(fù)染。400倍視野下觀察p16在腎組織表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 不同月齡大鼠腎臟p16的mRNA表達(dá)結(jié)果 實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果顯示在1日齡大鼠腎臟p16的mRNA表達(dá)水平很低，在3月齡大鼠腎臟能夠檢測(cè)出p16的mRNA表達(dá)，在24月齡大鼠腎臟，p16的 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(0.31±0.02 vs 1.20±0.17 vs 5.89±0.83，P＜0.05)。

2.2 不同月齡大鼠腎臟p16的蛋白表達(dá)結(jié)果 (1)Western印跡分析檢測(cè)發(fā)現(xiàn):在1日齡大鼠p16的蛋白表達(dá)水平低，在3月齡大鼠腎臟能夠檢測(cè)出p16的蛋白表達(dá)，在24月齡大鼠腎臟p16的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。見圖1。(2)免疫組化結(jié)果顯示:在1日齡大鼠腎小球和腎小管幾乎檢測(cè)不出p16的蛋白表達(dá);在3月齡大鼠腎小球內(nèi)細(xì)胞核和腎小管上皮細(xì)胞核內(nèi)可見陽性p16表達(dá);在24月齡大鼠腎臟，腎小球內(nèi)和腎小管上皮細(xì)胞核內(nèi)p16表達(dá)顯著上調(diào)。見圖2。

圖1 不同月齡大鼠腎臟p16的Western印跡結(jié)果

圖2 不同月齡大鼠腎臟p16免疫組化染色結(jié)果(×400)

3 討論

衰老是生命活動(dòng)的普遍現(xiàn)象，其機(jī)制至今仍不清楚。腎臟衰老在功能上表現(xiàn)為腎小球?yàn)V過率下降，腎臟濃縮稀釋功能受損，對(duì)損傷的修復(fù)能力減弱，有研究表明，衰老的腎小管上皮細(xì)胞在遭受缺血/再灌注損傷后，更易發(fā)生壞死和/或凋亡〔2〕。但腎臟衰老缺乏特異性的標(biāo)志物，大大限制了對(duì)腎臟衰老機(jī)制的研究。已有大量的體外研究的結(jié)果顯示p16在細(xì)胞衰老中的重要作用。細(xì)胞衰老的關(guān)鍵特征是細(xì)胞周期停滯。衰老細(xì)胞主要含有G1期的DNA含量，因此目前認(rèn)為衰老細(xì)胞停滯于G1期，不能順利進(jìn)入S期，細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換是衰老的關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞衰老時(shí)，p16基因的mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平增高，抑制有絲分裂原刺激發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生RB蛋白的磷酸化，從而維持了衰老細(xì)胞不可逆的生長(zhǎng)停滯狀態(tài)〔3～5〕。盡管細(xì)胞衰老發(fā)生不可逆增殖停滯狀態(tài)過程中可能發(fā)生多種變化，但p16及RB基因的表達(dá)及功能的改變可能是細(xì)胞周期停滯于G1期的根本原因。p16表達(dá)的變化也成為許多細(xì)胞如胰島細(xì)胞〔6〕、血管內(nèi)皮細(xì)胞〔7〕衰老的標(biāo)志。

鑒于p16在細(xì)胞衰老中的重要作用，我們推測(cè)p16可能成為腎臟衰老的良好的分子標(biāo)志物。也就是說，在腎臟衰老的進(jìn)程中，p16的mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平可能發(fā)生顯著變化。我們的研究結(jié)果與推測(cè)吻合。提示p16是大鼠腎臟衰老的良好的分子標(biāo)志。

p16在腎臟隨增齡表達(dá)上調(diào)的機(jī)制目前還不完全清楚。Krishnamurthy等的研究顯示正向調(diào)控p16表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子Ets1隨增齡表達(dá)上調(diào)，與p16表達(dá)平行，可能是p16隨增齡表達(dá)上調(diào)的機(jī)制之一〔8〕。與此類似，Ressler等〔9〕的研究發(fā)現(xiàn)在衰老的皮膚，p16表達(dá)的抑制因子Bmi-1水平顯著下調(diào)，可能是p16隨增齡表達(dá)上調(diào)另一原因。p16隨增齡表達(dá)上調(diào)另一重要機(jī)制是氧化損傷，新近的研究發(fā)現(xiàn)在造血干細(xì)胞，活性氧通過p38-MAPK途徑激活p16表達(dá)，從而限制造血干細(xì)胞壽命，使造血干細(xì)胞喪失自我更新的能力〔10〕。p16在腎臟隨增齡表達(dá)上調(diào)的機(jī)制可能與上述機(jī)制有關(guān)，但需要進(jìn)一步的研究闡明。

1 Tsygankov D，Liu Y，Sanoff HK，et al.A quantitative model for age-dependent expression of the p16ⅠNK4a tumor suppressor〔J〕.Proc Natl Acad Sci U SA，2009;106(39):16562-7.

2 丁 瑞，喬 晞，陳香美，等.抗氧化劑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣釋放阻滯劑對(duì)老年大鼠腎臟缺血/再灌注損傷中凋亡的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2006;26(6):779-82.

3 Elledge SJ，Harper JW.Cdk inhibitors:on the threshold of checkpoints and development〔J〕.Curr Opin Cell Biol，1994;6(6):847-52.

4 Sherr CJ，Roberts JM.Ⅰnhibitors of mammalian G1 cyclin-dependent kinases〔J〕.Genes Dev，1995;9(10):1149-63.

5 Stein GH，Drullinger LF，Soulard A，et al.Differential roles for cyclin-dependent kinase inhibitors p21 and p16 in the mechanisms of senescence and differentiation in human fibroblasts〔J〕.Mol Cell Biol，1999;19(3):2109-17.

6 林暉榕，陳慎仁，傅玉才，等.不同月齡大鼠胰島細(xì)胞衰老及胰島素表達(dá)的研究〔J〕.中國病理生理雜志，2009;25(1):180-2.

7 單海燕，白小涓，張偉光，等.AngⅡ誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老相關(guān)基因表達(dá)的研究〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2008;24(6):1041-6.

8 Krishnamurthy J，Torrice C，Ramsey MR，et al.Ⅰnk4a/Arf expression is a biomarker of aging〔J〕.J Clin Ⅰnvest，2004;114(9):1299-307.

9 Ressler S，Bartkova J，Niederegge R，et al.p16ⅠNK4A is a robust in vivo biomarker of cellular aging in human skin〔J〕.Aging Cell，2006;5(5):379-89.

10 Ⅰto K，Hirao A，Arai F，et al.Reactive oxygen species act through p38 MAPK to limit the lifespan of hematopoietic stem cells〔J〕.Nat Med，2006;12(4):446-51.