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(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130012；2.長(zhǎng)春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司，吉林 長(zhǎng)春 130012)

《細(xì)胞病毒抑制法》是進(jìn)行干擾素生物學(xué)活性測(cè)定的方法，現(xiàn)已收錄在《中國(guó)藥典》3部附錄[1]，此法是進(jìn)行干擾素生物學(xué)活性測(cè)定的依據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)，但是此方法實(shí)施環(huán)節(jié)多，影響因素多，這就要求實(shí)驗(yàn)者在進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)時(shí)了解影響實(shí)驗(yàn)的各項(xiàng)因素，避免在各環(huán)節(jié)出現(xiàn)錯(cuò)誤，從而得出準(zhǔn)確的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 儀器 恒溫磁力攪拌器(上海雷磁儀器廠)；百級(jí)超凈臺(tái)；酶標(biāo)儀(anthos 2010)。

1.2 試劑及藥品 人羊膜細(xì)胞(中國(guó)藥品生物制品檢定所生化室)；MEM培養(yǎng)基(Gibicol)；重組人干擾素α2b活性標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)；VSV病毒(中國(guó)藥品生物制品檢定所生化室)；胎牛血清(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所 TBD0012HYX)；乙醇(北京化工廠20061115)。

1.3 培養(yǎng)基的滅菌方式及存放時(shí)間[2-3]

1.3.1 培養(yǎng)基的滅菌方式 培養(yǎng)基為MEM培養(yǎng)基分為3種：完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，測(cè)定培養(yǎng)基(含7%胎牛血清)，攻毒培養(yǎng)基(含3%胎牛血清)。同時(shí)在培養(yǎng)基中加入雙抗(青霉素和鏈霉素)。

1.3.2 培養(yǎng)基的存放條件及時(shí)間 液體培養(yǎng)基要存放在冷藏箱中,通常液體培養(yǎng)基在冷藏條件下可存放6個(gè)月～1年。

1.4 凍存細(xì)胞的復(fù)蘇及復(fù)蘇濃度 將取出的凍存細(xì)胞迅速至于40 ℃溫水中,使凍存管中的物質(zhì)在1 min內(nèi)融化，加于10 mL完全培養(yǎng)基中。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，凍存細(xì)胞的數(shù)量過(guò)少，不利于細(xì)胞的復(fù)蘇，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，狀態(tài)欠佳。所以在凍存細(xì)胞時(shí)細(xì)胞的數(shù)量要適中，以利于復(fù)蘇后細(xì)胞的生長(zhǎng)。同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，要及時(shí)進(jìn)行狀態(tài)最佳細(xì)胞的再凍存工作，這樣有利于細(xì)胞的再應(yīng)用。

1.5 消化時(shí)間及細(xì)胞狀態(tài)觀察 按照《中國(guó)藥典》[1]規(guī)定進(jìn)行配制。在使用前，消化液應(yīng)置于室溫平衡后使用。消化的時(shí)間范圍約為15～30 min，同時(shí)應(yīng)根據(jù)細(xì)胞的狀態(tài)結(jié)束消化時(shí)間。

1.6 鋪板 按照《中國(guó)藥典》[1]要求進(jìn)行鋪板，在鋪板時(shí)應(yīng)使用準(zhǔn)確性高的槍頭，如進(jìn)口槍頭，避免液體掛壁帶來(lái)的影響；排槍在細(xì)胞培養(yǎng)中是常用的儀器，使用排槍時(shí)應(yīng)傾斜45°，液體吸取完畢時(shí)，將槍頭在盛裝液體的器皿空白處劃出，將掛在槍頭外壁的多余液體留在器皿空白處。在向孔中排出液體完畢時(shí)，將槍頭從孔中劃出，將槍頭內(nèi)的剩余液體留在孔內(nèi)，以確保在鋪板時(shí)，每孔體積的準(zhǔn)確性。

1.7 加樣 向孔內(nèi)添加需要測(cè)定的樣品時(shí)，應(yīng)注意加入樣品的體積的準(zhǔn)確性，操作方法如1.6。

1.8 病毒攻擊

1.8.1 病毒保存地點(diǎn) 病毒攻擊是此法中重要的環(huán)節(jié)，此法中使用的病毒為VSV病毒(水泡性口炎病毒)，需保存在-70 ℃冰箱中保存。

1.8.2 加病毒時(shí)間 將病毒從-70 ℃冰箱中取出,應(yīng)在10 min之內(nèi)，將病毒加至細(xì)胞培養(yǎng)板中，病毒在室溫條件下，毒力會(huì)隨著時(shí)間的推移降低，為準(zhǔn)確反映病毒毒力，所以這個(gè)步驟要迅速。

1.9 細(xì)胞病變點(diǎn)的觀察 經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，可知，細(xì)胞病變點(diǎn)的觀察應(yīng)結(jié)合2個(gè)原則:1)標(biāo)準(zhǔn)品A行細(xì)胞基本無(wú)死亡且H行細(xì)胞基本全部死亡；2)標(biāo)準(zhǔn)品D行或E行半數(shù)細(xì)胞死亡點(diǎn)。

1.10 細(xì)胞培養(yǎng)板脫色 《中國(guó)藥典》[1]中規(guī)定，使用流水進(jìn)行染色細(xì)胞培養(yǎng)板的脫色，但是由于流水速度難以控制，力量不均勻，不利于操作，所以經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，采用的方法為：用盆接水，將細(xì)胞培養(yǎng)板放入盆內(nèi)沖洗，換水3次，沖洗3次，即可洗去浮色，脫色完成。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)基的滅菌方式及存放時(shí)間 應(yīng)用0.2 μm濾器進(jìn)行培養(yǎng)基的滅菌處理，防止高溫滅菌對(duì)培養(yǎng)基成分的破壞。

在實(shí)際操作中，為防止培養(yǎng)基存放時(shí)間過(guò)長(zhǎng)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)不利，培養(yǎng)基的配制量應(yīng)不超過(guò)2周為宜。培養(yǎng)基在使用前需37 ℃預(yù)熱或在室溫平衡后再使用。

2.2 細(xì)胞狀態(tài)決定消化時(shí)間及效果 倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞貼在細(xì)胞培養(yǎng)瓶表面生長(zhǎng)，形態(tài)正常，狀態(tài)為致密單層。

將細(xì)胞培養(yǎng)瓶從二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中拿出后，放置于室溫，加入一定量消化液，消化一段時(shí)間后，顯微鏡下觀察細(xì)胞基本皺縮變圓。

消化過(guò)度則對(duì)細(xì)胞的活性損傷較大，并有部分細(xì)胞漂浮，隨棄去的消化液流失；消化不足則細(xì)胞難于從瓶壁上吹下，反復(fù)吹打同樣也會(huì)損傷細(xì)胞活性。所以在應(yīng)消化至可輕吹或隨培養(yǎng)基輕搖下最好。

2.3 細(xì)胞病變點(diǎn)觀察

2.3.1 加入VSV病毒進(jìn)行攻擊，細(xì)胞培養(yǎng)板中，正常的攻擊狀態(tài)是：干擾素生物學(xué)活性標(biāo)準(zhǔn)品A行細(xì)胞基本無(wú)死亡且H行細(xì)胞基本全部死亡。

2.3.2 加入VSV病毒進(jìn)行攻擊，細(xì)胞培養(yǎng)板中，正常的攻擊狀態(tài)是：標(biāo)準(zhǔn)品D行或E行出現(xiàn)細(xì)胞半數(shù)死亡點(diǎn)。

3 結(jié)論

《細(xì)胞病毒抑制法》為干擾素生物學(xué)活性檢測(cè)方法，是各研究所和醫(yī)藥企業(yè)進(jìn)行干擾素生物學(xué)活性檢定的標(biāo)準(zhǔn)，但是目前，由于各檢定場(chǎng)所環(huán)境和人員操作的不同，導(dǎo)致應(yīng)用此方法對(duì)干擾素生物學(xué)活性檢測(cè)的結(jié)果重復(fù)性差。要求操作人員對(duì)此方法的熟練程度高，且應(yīng)掌握各環(huán)節(jié)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，本實(shí)驗(yàn)對(duì)各環(huán)節(jié)的影響因素進(jìn)行了重復(fù)實(shí)驗(yàn)，試圖通過(guò)實(shí)驗(yàn)消除各環(huán)節(jié)的影響，從而利于操作人員對(duì)實(shí)驗(yàn)的把握[4-5]。

[1]中華人民共和國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典(三部)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2005:附錄56.

[2]黃志榮.MTT比色法在干擾素生物學(xué)活性測(cè)定中應(yīng)用的探討[J].海峽藥學(xué),2006,18(6):23-26.

[3]劉鐵成,于淼,曹翎婕.重組人α-2b型干擾素生物學(xué)活性測(cè)定方法的改進(jìn)[J].黑龍江醫(yī)藥,2000,13(4):15-18.

[4]韓蕾,黎耕.重組人干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(rhSCF)生物活性測(cè)定方法研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,2004,39(2):56-59.

[5]賈茜,周興軍.重組人粒細(xì)胞集落刺激因子生物學(xué)活性測(cè)定方法研究[J].中國(guó)生化藥物雜志,2001,22(1):89-91.