曾文慧，劉瑞嫻，李志強，劉炳榮，李秋劍，陳來泉，鐘俊鴻*

(1.廣東省昆蟲研究所，廣州 510260;2.廣東韶能集團股份有限公司，韶關(guān) 510630)

木質(zhì)纖維素 (lignocellulose)是植物細胞壁的主要組成成分 (Ohkuma，2003)，是一類由纖維素(cellulose)、半纖維素 (hemicellulose)等多聚糖以及無定形態(tài)聚合物木質(zhì)素 (lignin)結(jié)合在一起形成的混合物 (Arakawa et al.，2009)，是地球上含量最豐富的可再生資源。

纖維素和半纖維素酶均屬于糖基水解酶 (glycosyl hydrolase)蛋白家族。低等白蟻的木質(zhì)纖維素水解酶系統(tǒng)包含三種不同類型的纖維素酶:外切葡聚糖酶，包括纖維二糖水解酶 (cellobilohydrolase，1，4－β －D －glucan cellobiohydrolase，CBH)和外葡萄糖水解酶 (exoglucohydrolase，1，4－β－D－glucan exoglucohydrolase)2種成份，內(nèi)切葡聚糖酶 (endo－β－1，4－glucanases，EG，EC3.2.1.4)以及 β－葡萄糖苷酶 (β－glucosidase，BG，EC3.2.1.21)(Li et al.，2010)。同時，內(nèi)切木聚糖酶 (endo－β－1，4－D－xylan，xylanohydrolase，EX，EC3.2.1.8)是低等白蟻重要的一類半纖維素水解酶 (Li and Sun，2001)。

研究發(fā)現(xiàn)低等白蟻擁有兩個纖維素水解酶系統(tǒng):一個在前腸 (Foregut)/唾液腺 (Salivary gland) +中腸 (Midgut)，為內(nèi)源性水解酶系統(tǒng);另一個在后腸 (Hindgut)，為后腸共生微生物水解酶系統(tǒng) (Nakashima et al.，2002;Zhou et al.，2007)。但是，至今為止，低等白蟻的兩個纖維素酶水解系統(tǒng)的調(diào)控機制還未有相關(guān)的研究報道。相較而言，在絲狀真菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了木聚糖酶和纖維素酶啟動子結(jié)合型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Xyrl、ACEI及轉(zhuǎn)錄激活因子X1nR等 (Ling et al.，2009;Stricker et al.，2008;Saloheimo et al.，2000)。研究發(fā)現(xiàn)真菌木質(zhì)纖維素酶可以通過添加槐糖 (sophorose)、纖維二糖 (cellobiose)及乳糖 (lactose)等寡聚糖至培養(yǎng)基中作為調(diào)節(jié)因子來調(diào)節(jié)其分泌量 (Morikawa et al.，1995)。

本實驗通過借鑒真菌纖維素酶和半纖維素酶分泌的調(diào)節(jié)因子，利用各種糖基化合物活體誘導(dǎo)臺灣乳白蟻Coptotermes formosanus，研究它們對臺灣乳白蟻4種糖基水解酶分泌的影響。通過測定EG、BG和CBH 3種纖維素酶及EX 1種半纖維素酶活力，來檢測誘導(dǎo)效果。這些研究將給白蟻木質(zhì)纖維素酶系的調(diào)控機制，提供重要的實驗數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗白蟻

供試蟲源采自廣州龍洞的白蟻誘捕箱，帶回實驗室飼養(yǎng)，挑取活力較好的臺灣乳白蟻工蟻進行試驗。

1.1.2 實驗試劑

本實驗選用的誘導(dǎo)試劑:木質(zhì)素 (Lignin，low sulfonate content，Sigma)，羧甲基纖維素鈉(CMC－Na，天津福晨化學(xué)試劑廠)，L－山梨糖(L－sorbose，Genview)，D－果糖 (D－Fructose，Genview)，葡萄糖 (Glucose，廣州化學(xué)試劑廠)，D－半乳糖 (D－Galactose，Genview);其它化學(xué)試劑:濾紙 (雙圈定性濾紙)，D－水楊苷 (DSalicin，上海晶純試劑有限公司)，對硝基苯－8－D－纖維二糖苷 (p－NPC，Sigma)，木聚糖 (Xylan from Birchwood，Sigma)，D－木糖 (D－Xylose，Genview)，對硝基苯酚 (p－NP，Genview)，牛清血蛋白組分 V(BSA，Albumin，F(xiàn)raction V，Genview)，3，5－二硝基水楊酸 (DNS，Genview)，考馬斯亮藍 G－250(Coomassie brilliant blue G －250，Genview)。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳白蟻誘導(dǎo)培養(yǎng)

采用蛭石作為保濕材料，用滅菌蒸餾水濕潤后均勻鋪到直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿放入150頭供試乳白蟻工蟻，加蓋培養(yǎng)。將6種誘導(dǎo)試劑分別配成1% (W/V)濃度溶液，各取約300 μL濕潤濾紙，再放入加有白蟻的培養(yǎng)皿中，共六組。將裝有白蟻的培養(yǎng)皿放入28℃恒溫培養(yǎng)箱 (南京實驗儀器廠，WMK－02型)，每天添加一次誘導(dǎo)試劑保持濕潤狀態(tài)。在乳白蟻接觸到含有各種誘導(dǎo)試劑的濾紙開始后的4 h、8 h、24 h、2 d、3 d、4 d、6 d和9 d取樣。將乳白蟻腸道解剖成乳白蟻的前腸/唾液腺+中腸及后腸兩部份。前腸/唾液腺+中腸部分用于檢測白蟻內(nèi)源性糖基水解酶活性變化，后腸部分用于檢測白蟻共生微生物來源糖基水解酶活性變化，整頭白蟻酶活力測定用作指示各種酶活性大小之間的比例變化。以接觸誘導(dǎo)物之前的同批次乳白蟻作為參照，參照活性設(shè)定為100% 。

1.2.2 粗酶制備

每次取樣選取各組中活力好的乳白蟻約15頭置于0.9% (W/V)滅菌生理鹽水中反復(fù)漂洗，之后用濾紙吸干表面水分，放入已滅菌的干凈培養(yǎng)皿中。在實體解剖鏡下將白蟻腸道解剖，分成前腸/唾液腺+中腸和后腸兩部分，與5頭未解剖的乳白蟻共分成3組分別放入裝有500 μL HACNaAC緩沖液 (SAB，0.1 M，pH5.6)的離心管中再轉(zhuǎn)移至玻璃組織勻漿器，冰浴研磨;研磨完畢將勻漿液吸至離心管后定容至 500μL，12000 rpm，4℃冷凍離心 (Sigma，3K15)15 min，取上清，再次12000 rpm，4℃冷凍離心5 min，取上清即為粗酶液于－20℃保存待用。

1.2.3 蛋白質(zhì)濃度的測定

采用考馬斯亮藍法進行測定。將粗酶液按一定的比例進行稀釋，取50 μL稀釋后粗酶液，加入350 μL考馬斯亮藍G－250顯色試劑，多功能酶標儀595 nm 比色 (PerkinElmer，1420－012 victor3)，測定OD595，用蛋白質(zhì)標準曲線求蛋白質(zhì)含量。

1.2.4 內(nèi)切－β－1，4－葡聚糖酶，β－葡萄糖苷酶及內(nèi)切－β－1，4－木聚糖酶活力的測定

內(nèi)切－β－1，4－葡聚糖酶 (EG)，β－葡萄糖苷酶 (BG)以及內(nèi)切 －β－1，4－木聚糖酶(EX)活力的測定，參照 Miller方法 (Miller，1959)，均采用還原糖法測定。在1.5 mL離心管中，分別加入120 μL 1%CMC－Na，Salicin，Xylan，預(yù)熱5 min，然后加入酶液 12 μL，37℃ 準確反應(yīng)60 min，立刻加入120 μL DNS溶液終止反應(yīng)，沸水浴 5 min，冰浴冷卻，540 nm比色，測定OD540。EG和BG從葡萄糖標準曲線求得葡萄糖含量，計算酶活力單位;XE用木糖標準曲線求木糖含量，計算酶活力單位。EG，BG，EX酶活力U定義為，每毫克蛋白質(zhì)在37℃，pH=5.6反應(yīng)條件下分解底物，每分鐘可以產(chǎn)生還原糖的量，表示為U/mg。每個酶切反應(yīng)重復(fù)3次。

1.2.5 FPA濾紙酶活測定

采用還原糖法測定，用打孔器將濾紙制作成直徑為5 mm的濾紙片，每個離心管中放入1份濾紙片，再加入120 μL SAB緩沖液 (pH 5.6)將其浸潤。加入酶液 12 μL，37℃ 準確反應(yīng) 60 min，然后加入120 μL DNS溶液終止反應(yīng)，沸水浴5 min，冰浴冷卻后，540 nm比色，測定OD540。葡萄糖標準曲線求得葡萄糖含量，酶活力單位計算同1.2.4。每個酶切反應(yīng)重復(fù)3次。

1.2.6 纖維二糖水解酶 (CBH)活力測定

在1.5 mL離心管仲加入120 μL 1 mmol pNPC底物，預(yù)熱5 min，然后加入酶液12 μL，37℃ 準確反應(yīng)60 min，加入120 μL Na2CO3(0.6mol/L)溶液終止反應(yīng)，405 nm比色，測定OD405，從p－NP標準曲線求得p－NP含量，計算酶活力單位。CBH酶活力U定義為:每毫克蛋白質(zhì)在37℃，pH=5.6反應(yīng)條件下分解pNPC，每分鐘可以產(chǎn)生p－NP的量，表示為 U/mg。每個酶切反應(yīng)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同糖基化合物對臺灣乳白蟻內(nèi)源性以及共生微生物來源的糖基水解酶分泌量的影響

選取用于對臺灣乳白蟻進行活體誘導(dǎo)的化合物分為2類，第一類為大分子聚合物:木質(zhì)素和羧甲基纖維素鈉，第二類為單糖:山梨糖，果糖，葡萄糖。酶活力測定結(jié)果表明，這2類物質(zhì)對乳白蟻后腸共生微生物來源的糖基水解酶的分泌與它們對內(nèi)源性糖基水解酶的分泌作用相反。后腸部分:6種化合物對乳白蟻后腸EG，BG，CBH，EX 4種酶在整個實驗時間內(nèi)起到的基本為抑制分泌的作用，其中對后腸抑制作用最大的物質(zhì)為果糖及山梨糖，只有 1% 半乳糖 (4 h，135%，0.540 U/mg)對濾紙分解有微弱的促進作用 (圖1 f～j)。前腸/唾液腺+中腸部分:一方面山梨糖和果糖分別是為 EG(6day，126%，1.538 U/mg)與EX(6day，341%，5.146 U/mg)的最佳誘導(dǎo)物，同時山梨糖對BG(6day，147%，4.282 U/mg)和EX(6day，258%，3.892 U/mg)，果糖對CBH(6day，249%，1.128 U/mg)也有較好的誘導(dǎo)效果。另一方面半乳糖和葡萄糖對內(nèi)源性糖基水解酶促進作用不明顯，且在大部分時間點對其分泌有抑制作用。實驗結(jié)果還表明大分子物質(zhì)木質(zhì)素對4種內(nèi)源性水解酶平均促進作用最大。它不僅為 FPA (6 day，149%，0.750 U/mg)，BG(6day，178%，5.170 U/mg) 及 CBH(6 day，265%，1.201 U/mg)的最佳誘導(dǎo)物，其次對EG(6day，122%，1.486 U/mg) 和EX(6day，232%，3.505 U/mg)都具有相對好的誘導(dǎo)效果。五種酶活測定指標比較，CBH和EX的分泌對各種糖基化合物作用最為敏感且增幅最大。8個取樣點內(nèi)各種酶活力在4小時和第6天有高峰促進作用(圖1 a～e)。

圖1 臺灣乳白蟻腸道不同部位糖基水解酶活性化學(xué)誘導(dǎo)曲線Fig.1 Graphs for chemical induced activity variations of glysosyl hydrolase in different parts of C.formosanus intestine

2.2 糖基化合物對臺灣乳白蟻纖維素酶、半纖維素酶之間活性大小比例的影響

選取誘導(dǎo)后4 h(酶活高點)、3 d(酶活低點)、6 d(酶活高點)、9 d(酶活低點)的整頭乳白蟻為樣品，測定4種水解酶活性大小，以未接觸誘導(dǎo)物的同批臺灣乳白蟻作對照。對整頭白蟻的酶活測定表明 (圖2)，EX的活力明顯高于其它3種，是總酶活大小變化的主要影響因素。4種酶活力誘導(dǎo)最大值的大小順序為 EX(6 d，9.356 U/mg) ＞BG(2 d，3.313 U/mg) ＞ EG(2 d，1.541 U/mg) ＞ CBH(6 d，1.476 U/mg)。分泌量有所提高的1% 木質(zhì)素，1%CMC和1%山梨糖樣品其整頭白蟻4種酶活力的低點和高點的酶活大小比例均與對照白蟻基本一致，即EX:(BG+EG+CBH) 約為 2∶1。

3 結(jié)論與討論

圖2 臺灣乳白蟻糖基水解酶腸道活性比例分布變化化學(xué)誘導(dǎo)曲線Fig.2 Graphs for chemical induced proportion variations of intestinal glysosyl hydrolase activities of C.formosanus

在T.reesei的纖維素調(diào)控機制中，T.reesei的生長營養(yǎng)條件能夠顯著影響其纖維素和半纖維素酶的產(chǎn)量，碳水化合物及他們的衍生物可以作為誘導(dǎo)物質(zhì)促進其大部分纖維素酶的分泌 (Ling et al.，2009)。根據(jù)碳水化合物在細胞代謝中的一些共同中間產(chǎn)物，本研究選取用于對臺灣乳白蟻進行活體誘導(dǎo)的化合物包括:代謝起始物質(zhì) (大分子聚合物)木質(zhì)素和羧甲基纖維素鈉;代謝下游產(chǎn)物 (單糖)山梨糖、果糖、葡萄糖和半乳糖。實驗結(jié)果表明這些糖基化合物對乳白蟻不用來源的纖維素酶的分泌起著大相徑庭的作用。

在6種化合物的影響下，乳白蟻后腸4種酶的分泌在8個取樣點大部分為抑制狀態(tài)，山梨糖和果糖的抑制作用最為明顯，只有半乳糖對FPA活力有微弱的促進作用。而對于乳白蟻內(nèi)源性糖基水解酶，木質(zhì)素、山梨糖和果糖對酶的分泌起到了正向的誘導(dǎo)作用。

4種單糖中山梨糖和果糖互為差向異構(gòu)體均為己酮糖，它們與己醛糖葡萄糖、半乳糖對后腸的作用與其對前腸/唾液腺+中腸的作用相反。絲狀真菌中葡萄糖作為降解物，可以對纖維素酶分泌的造成反饋抑制，但是當葡萄糖耗盡之后纖維素則可以正常的表達 (Ilmen et al.，1997)。在本實驗中葡萄糖對乳白蟻木質(zhì)纖維素分泌的抑制作用，很可能也是由于代謝物的反饋抑制作用，半乳糖作為葡萄糖的差向異構(gòu)體而產(chǎn)生了類似的作用。山梨糖在T.reesei中已經(jīng)被證明可以通過啟動子誘導(dǎo)糖基水解酶的分泌 (Ling et al.，2009)，因此同理山梨糖的差像異構(gòu)體果糖也很可能可以產(chǎn)生誘導(dǎo)作用。山梨糖和果糖對乳白蟻糖基水解酶的分泌表現(xiàn)出的誘導(dǎo)作用，可以則猜測為其可能擁有類似于T.reesei中控制纖維素酶和半纖維素酶的啟動子，這些啟動子的上下游序列中存在山梨糖等物質(zhì)的激活位點。但是山梨糖和果糖對于后腸4種糖基水解酶的強烈抑制作用機理還需要進一步的研究。

木質(zhì)素對乳白蟻內(nèi)源性糖基水解酶5種酶活力指標的平均促進作用最大。木質(zhì)素是一種高度分支的由多種芳香族羧酸組成的高分子物質(zhì)，性質(zhì)穩(wěn)定降解緩慢 (Xie et al.，2000)。木質(zhì)素通常在細菌或真菌的氧化酶作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榉辑h(huán)自由基和醌類才能進一步分解，而纖維素的降解產(chǎn)物可以為木質(zhì)素的降解提供還原力 (Sewalt et al.，1996)。雖然木質(zhì)素代謝與乳白蟻纖維素、半纖維素酶分泌之間的關(guān)系目前未見報道，但是Tartar等(2009)研究表明黃胸散白蟻Reticulitermes flavipes的酚氧化酶幾乎全部來源于前腸和唾液腺，而且喂食木質(zhì)素可以提高酚氧化酶的活性。結(jié)合本研究結(jié)果，木質(zhì)素的作用機制可能為，由木質(zhì)素作為一種間接促進酚氧化酶分泌的化學(xué)信號，刺激糖基水解酶分泌用來降解纖維素，從而產(chǎn)生各種代謝物質(zhì)來直接誘導(dǎo)分解木質(zhì)素的酚氧化酶的生產(chǎn)，即相當于提高了糖基水解酶的分泌量。

實驗結(jié)果顯示乳白蟻CBH和EX的分泌對各種糖基化合物作用最為敏感，其次為BG，以EG最不敏感，且后腸EG抑制最為強烈。所測定的乳白蟻4種糖基水解酶中，EX的活力明顯高于其它三種，4種酶的大小順序為EX ＞BG＞EG＞CBH。到目前為止，乳白蟻CBH的基因只在后腸的共生鞭毛蟲中發(fā)現(xiàn)，而本實驗中乳白蟻內(nèi)源性CBH活性在接觸誘導(dǎo)物后出現(xiàn)了大量的提高，因此推測乳白蟻是有可能存在自身基因組編碼的CBH基因。木質(zhì)素和半纖維素可以形成致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，包圍和加固纖維素與半纖維素骨架，將纖維素成份緊密的包埋起來 (Yu，2008)，所以EX的大量分泌是木制纖維素代謝的基礎(chǔ)。當EX分泌大量增加時，從木質(zhì)纖維素中釋放出大量纖維素，纖維素的結(jié)晶部份需要經(jīng)過CBH的作用才能繼續(xù)被EG和BG分解，這是其中一種可能的解釋。因此EX的分泌量的增大伴隨著CBH分泌量的相應(yīng)提高，而BG和EG則由于處于代謝產(chǎn)物反饋調(diào)節(jié)中更加下游的位置使得其誘導(dǎo)不明顯或出現(xiàn)抑制作用。同時在對T.reesei cbh1啟動子的研究中發(fā)現(xiàn)，cbh1啟動子上游區(qū)域存在葡萄糖抑制位點，可以在槐糖山梨糖醇的培養(yǎng)基中強烈誘導(dǎo)cbh1基因 (Takashima et al.，1996;Ilmen et al.，1996)。在本實驗中葡萄糖和山梨糖對CBH也出現(xiàn)了相應(yīng)的抑制和誘導(dǎo)作用，那么乳白蟻中是否存在類似與cbh1基因的調(diào)節(jié)機制還需要大量的基礎(chǔ)研究工作。

此外，8個取樣時間點內(nèi)各種酶活力均沒有呈現(xiàn)規(guī)律性的變化，只在4 h和6 d兩個取樣點有高峰促進作用。有研究表明，真菌纖維素酶的誘導(dǎo)合成與誘導(dǎo)物的濃度密切相關(guān) (Sun，2007)，因此誘導(dǎo)物對白蟻木質(zhì)纖維素酶分泌的誘導(dǎo)作用的波動，可能反映了實際起作用的誘導(dǎo)物濃度的變化，相關(guān)的影響因子有待進一步研究。

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