武宇鵬，丁 亮，李 捷，武春生，范仁俊，朱朝東*

(1.山西大學(xué)黃土高原研究所，太原 030006;2.中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所動(dòng)物進(jìn)化與系統(tǒng)學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101;3.山西省植保植檢總站，太原 030001;4.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，太原 030031)

1 DNA條形碼產(chǎn)生的背景

分類(lèi)學(xué)是生物學(xué)的基礎(chǔ)，是人類(lèi)認(rèn)識(shí)自然的第一步。自林奈創(chuàng)立雙名法近250年來(lái)，已經(jīng)有170多萬(wàn)個(gè)物種被命名。目前全球生物估計(jì)的物種數(shù)量至少有 1億種 (Erwin，1982;May，1990;Stock，1993)。如此巨大的數(shù)量，單靠專(zhuān)業(yè)的經(jīng)典分類(lèi)學(xué)家，幾乎是不可能完成的任務(wù)。以平均一個(gè)經(jīng)典分類(lèi)學(xué)家一生鑒定1000個(gè)物種的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)計(jì)算，需要1萬(wàn)多個(gè)經(jīng)典分類(lèi)學(xué)家同時(shí)參與完成。由于經(jīng)典分類(lèi)學(xué)方法具有局限性，很難同時(shí)、有效地對(duì)某一個(gè)地區(qū)、某一個(gè)項(xiàng)目或某一次大型考察所得到的全部生物樣本進(jìn)行鑒定與記錄。以現(xiàn)在人類(lèi)社會(huì)生產(chǎn)力發(fā)展的需求來(lái)看，亟需一種更加具有效率的生物物種鑒定體系，更好地為生產(chǎn)生活服務(wù);況且現(xiàn)有物種正以每年1～2萬(wàn)種的速度在滅絕，也亟需一種更加具有效率的生物物種鑒定與記錄體系，為人類(lèi)進(jìn)一步深入全面地認(rèn)識(shí)自然界和評(píng)估自身存在留備更加系統(tǒng)的物種本底資料。

近20年來(lái)，快速發(fā)展的分子生物學(xué)技術(shù)為眾多傳統(tǒng)學(xué)科提供了新的發(fā)展機(jī)遇，分類(lèi)學(xué)亦不例外。利用DNA進(jìn)行物種鑒定已經(jīng)成功應(yīng)用到了多個(gè)生物類(lèi)群中 (Hebert et al.，2004a;Ward et al.，2005;Barber et al.，2006;Chantangsi et al.，2007;Smith et al.，2008)。國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)DNA數(shù)據(jù)平臺(tái)的構(gòu)建，使得大量物種基因信息第一時(shí)間公示，例如美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心NCBI(National Center of Biotechology Information)的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中生物基因數(shù)據(jù)爆炸式增加。但在分類(lèi)學(xué)中，尚缺乏一個(gè)專(zhuān)門(mén)將DNA序列與分類(lèi)學(xué)相結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)。

在此趨勢(shì)之下，Tautz等 (2002)首先提出DNA分類(lèi)的概念 (DNA Taxonomy)，以DNA序列為基礎(chǔ)建立物種識(shí)別體系，利用DNA序列的差異進(jìn)行種級(jí)階元的分類(lèi)，并與林奈命名系統(tǒng)一一對(duì)應(yīng)。利用此體系可以鑒定物種，也可以解決一些形態(tài)學(xué)上的難題，發(fā)掘隱存種。Tautz等 (2003)指出，雖然DNA測(cè)序技術(shù)是昂貴的，但培養(yǎng)一個(gè)分類(lèi)學(xué)專(zhuān)家所花成本更大，而且需要長(zhǎng)時(shí)間的投入，DNA分類(lèi)是未來(lái)分類(lèi)學(xué)發(fā)展的必然趨勢(shì)。

隨后，Herbert等 (2003a)提出DNA條形碼概念 (DNA Barcoding)。針對(duì)形態(tài)學(xué)分類(lèi)固有的缺陷，如表型可塑性和遺傳可變性，無(wú)法鑒定隱存分類(lèi)單元和不同發(fā)育階段的物種等，Herbert倡導(dǎo)利用線粒體COⅠ基因 (線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基I基因)作為通用序列，建立全球性的物種鑒別系統(tǒng)。與其它基因片段相比，COⅠ基因有許多優(yōu)點(diǎn)，相對(duì)保守又有足夠的變異，并且序列長(zhǎng)度適中 (Hebert et al.，2003b)。DNA條形碼系統(tǒng)的建筑流程為預(yù)先收錄已知種名物種的COⅠ基因建立一個(gè)龐大的條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)，將未知種名物種的COⅠ基因輸入數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，根據(jù)序列相似度來(lái)快速鑒定物種，解決實(shí)際問(wèn)題并不斷豐富數(shù)據(jù)庫(kù)。這個(gè)過(guò)程類(lèi)似于超市利用給商品添加條形碼，分類(lèi)管理成千上萬(wàn)種不同的商品，故稱(chēng)之為DNA條形碼。

2003年，全球多位生物學(xué)專(zhuān)家在美國(guó)冷泉港召開(kāi)了兩次會(huì)議，深入討論了DNA條形碼的科學(xué)性和社會(huì)功能，提出了國(guó)際DNA條形碼計(jì)劃——iBOL(International Barcode of Life)。2004年，“生命條形碼聯(lián)盟”(CBOL，the Consortium for the Barcode of Life)成立，至今已經(jīng)有來(lái)自50個(gè)國(guó)家的170多個(gè)組織成為其會(huì)員 (http:∥barcoding.si.edu/)。目前，針對(duì)全球鳥(niǎo)類(lèi)的計(jì)劃:All Birds Barcoding Initialtive(www.barcodingbirds.com)、全球魚(yú)類(lèi)計(jì)劃:Fish Barcode of Life Initiative(www.fishbol.org)、鱗翅目昆蟲(chóng)計(jì)劃:All Leps Barcode of Life(www.lepbarcoding.org)、極地生物計(jì)劃:Polar Barcode of Life(www.polarbarcoding.com)等DNA條形碼項(xiàng)目正在實(shí)施中 (關(guān)申民等，2008)。2007年5月，加拿大圭爾夫大學(xué)正式籌建生命條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng) (Barcode of Life Data Systems，BOLD)。該數(shù)據(jù)庫(kù)不僅包括序列信息，也包括完整的物種描述、地理分布信息、標(biāo)本圖片等。

有關(guān)DNA條形碼的學(xué)術(shù)論文也逐年增加。截至目前，在Sciencedirect(http://www.science-direct.com)中輸入 “DNA barcode”檢索可得到1155篇文獻(xiàn)。DNA條形碼研究已成為不可逆轉(zhuǎn)的趨勢(shì)。

2 DNA條形碼的研究進(jìn)展

DNA條形碼自提出以來(lái)，已在多個(gè)類(lèi)群的研究中得到了應(yīng)用。包括真菌 (Seifert et al.，2007)，植物(Kress et al.，2007)，纖毛蟲(chóng)(Chantangsi et al.，2007)，珊瑚 (Barber et al.，2006)，腹足類(lèi) (Remigio and Hebert，2003)，蜘蛛(Greenstone et al.，2005)，甲殼動(dòng)物 (Costa et al.，2007)，昆蟲(chóng) (Hebert et al.，2004a;Hajibabaei et al.，2006b;Burns et al.，2008;Kumar et al.，2007;Smith et al.，2008)，魚(yú)類(lèi) (Ward et al.，2005)，兩棲類(lèi) (Vences et al.，2005)，鳥(niǎo)類(lèi)(Hebert et al.，2004b) 及靈長(zhǎng)類(lèi) (Lorenz et al.，2005)等。國(guó)內(nèi)也有學(xué)者開(kāi)展了一些研究，如高玉石等 (2007)、屠云潔等 (2009)分別對(duì)6個(gè)地方和3個(gè)地方雞的線粒體COⅠ基因多樣性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明COⅠ基因?qū)﹄u品種的鑒定結(jié)果與形態(tài)鑒定基本相符。馮毅等 (2009)利用DNA條形碼信息研制DNA芯片，成功鑒定了3種西花薊馬。彭居俐等 (2009)的研究表明以COⅠ基因作為鲌屬魚(yú)類(lèi)DNA條形碼進(jìn)行物種鑒定具有一定的可行性。王中鐸等 (2009)探討了COⅠ條碼序列在硬骨魚(yú)類(lèi)輔助物種鑒別的適用性。

傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類(lèi)對(duì)于一些類(lèi)群的鑒定非常耗時(shí)，缺乏可用的鑒定性狀 (Huang et al.，2007;Evans et al.，2007)。相比之下，DNA條形碼提供了一個(gè)快速、簡(jiǎn)便的鑒定系統(tǒng) (Herbert et al.，2003a)。在一些生物多樣性調(diào)查研究中，DNA條形碼鑒定物種的準(zhǔn)確率達(dá)到了97%(Janzen et al，2005) 或 97.9% (Hajibabaei et al.，2006b)。在鱗翅目等類(lèi)群中，通過(guò)DNA條形碼發(fā)現(xiàn)了大量隱存種或新種 (Herbert et al.，2004a;Monaghan et al.，2005):Vaglia等 (2008) 通過(guò) DNA條形碼在天蛾科Sphingidae)中發(fā)現(xiàn)的隱存種與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果相一致;Silva-Brand?ao等(2009)認(rèn)為鱗翅目中出現(xiàn)如此多隱存種，跟動(dòng)物相互之間通過(guò)模仿或擬態(tài)而造成的物種形成或分化有關(guān)，借助DNA條形碼是很好的研究途徑;Janzen等 (2009)通過(guò)DNA條形碼研究哥斯達(dá)黎加瓜納卡斯特省(ACG)的昆蟲(chóng)標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)鱗翅目19個(gè)科中，有17個(gè)科的種類(lèi)有所增加。

另外，DNA條形碼能夠從不同發(fā)育時(shí)期的動(dòng)植物標(biāo)本或分散的組織中鑒別出物種，例如對(duì)幼魚(yú)的鑒定 (Pegg et al.，2006);Domingo-Roura等(2006)通過(guò)對(duì)一種名貴的修面刷所用材料進(jìn)行DNA條形碼分析，獲知該產(chǎn)品是由歐亞獾Meles meles的毛所制成;Teletchea等 (2008)將DNA條形碼用在對(duì)超市食品的檢驗(yàn)上。DNA條形碼也可用在對(duì)包含多種生物組合的環(huán)境樣本如動(dòng)物的糞便、水、土壤等的鑒定中，例如根據(jù)糞便中提取的線粒體DNA多態(tài)性，可以將在同一區(qū)域活動(dòng)的阿穆?tīng)柋狿anthera pardus orientalis和西伯利亞虎Panthera tigris altaica區(qū)分開(kāi)來(lái) (Sugimoto et al.，2006)。

但有不少學(xué)者反對(duì)僅僅依靠DNA序列進(jìn)行物種分類(lèi) (Will and Rubinoff，2004;Moritz and Cicero，2004;Will et al.，2005)。他們提出拋棄傳統(tǒng)分類(lèi)方法，會(huì)造成分類(lèi)學(xué)的倒退，分類(lèi)學(xué)有可能又回歸到依據(jù)單一性狀進(jìn)行分類(lèi)的類(lèi)型學(xué) (typology)時(shí)代;他們認(rèn)為僅用DNA序列作為分類(lèi)依據(jù)，會(huì)喪失很多有用信息，特別是顛覆了傳統(tǒng)意義上的物種認(rèn)知，使人們對(duì)物種的理解變成了抽象的代碼。也有學(xué)者提出應(yīng)該取消DNA分類(lèi)的概念，認(rèn)為DNA分類(lèi)只是部分科學(xué)家的一廂情愿，并沒(méi)有多少實(shí)際意義 (K?hler et al.，2007)。還有學(xué)者結(jié)合生態(tài)學(xué)、形態(tài)學(xué)、行為學(xué)等多種性狀，進(jìn)行物種的鑒定、發(fā)現(xiàn)與高級(jí)階元的分類(lèi)，即綜合分類(lèi) (Integrated taxonomy) (Will et al.，2005)。實(shí)際上，無(wú)論是DNA分類(lèi)還是DNA條形碼，無(wú)論在理論上或?qū)嶋H應(yīng)用中都不可能完全取代傳統(tǒng)分類(lèi)，但卻可以從各種不同的角度和領(lǐng)域填補(bǔ)傳統(tǒng)分類(lèi)的不足或解決一些傳統(tǒng)分類(lèi)無(wú)法入手的難題?？傊珼NA分類(lèi)和DNA條形碼研究仍然在飛速向前推進(jìn)。

3 與DNA條形碼有關(guān)的討論

3.1 DNA條形碼與DNA分類(lèi)的關(guān)系

DNA條形碼與DNA分類(lèi)幾乎同時(shí)提出，彼此雖然相互聯(lián)系，但又有所不同 (Vogler et al.，2006;Hajibabaei et al.， 2007;DeSalle， 2005;DeSalle et al.，2007)。

目的不同:DNA條形碼基于DNA序列之間的相似度進(jìn)行物種鑒定，注重實(shí)效，而不是構(gòu)建生命樹(shù) (the Tree of Life)或進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育研究(Hajibabaei et al.，2007)。DNA條形碼只作為物種鑒定的工具，并不單獨(dú)作為物種分類(lèi)的平臺(tái)。相比之下，DNA分類(lèi)則是要建立一個(gè)單獨(dú)依靠DNA序列的分類(lèi)系統(tǒng) (Blaxter et al.，2005;Cognato et al.，2006;Vogler et al.，2007)。雖然DNA 分類(lèi)結(jié)果也需要與林奈命名系統(tǒng)相對(duì)應(yīng)，但根據(jù)Tautz(2003)的構(gòu)想，DNA分類(lèi)不依賴(lài)形態(tài)特征，能有效排除人為因素，基于DNA序列的分類(lèi)更為客觀，更接近物種的自然屬性。DNA分類(lèi)在為物種鑒定提供平臺(tái)的同時(shí)，還需要進(jìn)一步探討物種的系統(tǒng)發(fā)育、高階元分類(lèi)地位等深層次的內(nèi)容。

所用基因不完全相同:DNA條形碼在提出之初，就強(qiáng)調(diào)用統(tǒng)一的基因序列進(jìn)行鑒定，雖然研究者倡導(dǎo)在解決一些特殊類(lèi)群，或處理一些特殊情況如假基因、基因交流等時(shí)，需要再加一條候補(bǔ)基因 (alternate loci/candidate loci) (Hajibabaei et al.，2007)。但目前動(dòng)物類(lèi)群中使用較多的仍是COⅠ基因。甚至在一些特殊領(lǐng)域 (如法醫(yī))中，標(biāo)本的DNA已經(jīng)降解，無(wú)法提取完整長(zhǎng)度的COⅠ基因，提取的COⅠ基因短到200 bp～500 bp也可以準(zhǔn)確鑒定物種 (Hajibabaei et al.，2006b)。植物的線粒體基因進(jìn)化速率較慢，COⅠ基因無(wú)法有效區(qū)分物種，經(jīng)過(guò)近幾年的反復(fù)研究討論，傾向于在葉綠體基因組中選取不同片段進(jìn)行組合 (Chase et al.，2005;Kress et al.，2005)。

但在DNA分類(lèi)中，對(duì)于長(zhǎng)度僅為658 bp的COⅠ基因來(lái)講，所包含的信息量并不足以很好的解決物種的系統(tǒng)發(fā)育等問(wèn)題。特別是針對(duì)一些特殊類(lèi)群，僅僅憑借COⅠ基因不具有強(qiáng)大的說(shuō)服力。所以，要進(jìn)行更深層次的分類(lèi)工作，一般仍需要再加至少一條其它區(qū)域的DNA序列 (如核基因等)，甚至還需要附加其它的性狀 (生態(tài)學(xué)、行為學(xué)等)來(lái)進(jìn)行輔助研究 (Hajibabaei et al.，2007)。

分析方法不完全相同:雖然DNA條形碼主要用系統(tǒng)發(fā)育分析常用的樹(shù)來(lái)做分析，但僅僅是為了驗(yàn)證物種的單源性和聚類(lèi)關(guān)系，通常要求所用分析方法簡(jiǎn)潔、快速，所以這些樹(shù)并不能看做系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。而DNA分類(lèi)為了解決系統(tǒng)發(fā)育與高級(jí)階元分類(lèi)關(guān)系等問(wèn)題，針對(duì)DNA序列的特點(diǎn)，可能要用到多種軟件、多種算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，運(yùn)算耗時(shí)較長(zhǎng)。

從某種程度上來(lái)講，DNA條形碼與DNA分類(lèi)雖然目的不同，但也可相輔相成，DNA條形碼計(jì)劃可以為DNA分類(lèi)提供大量可用數(shù)據(jù)，完全可以作為DNA分類(lèi)系統(tǒng)的實(shí)踐部分 (practical component)(Hajibabaei et al.，2007)。

3.2 物種概念的定義

近年來(lái)，有關(guān)物種概念的定義一直在爭(zhēng)論之中。十九世紀(jì)之前，分類(lèi)學(xué)家主要根據(jù)生物表型特征上的差異來(lái)識(shí)別和區(qū)分物種。隨著現(xiàn)代綜合進(jìn)化論和群體遺傳學(xué)的建立，Mayr(1963)提出了“生物學(xué)物種概念”(the biological species concept/BSC)，認(rèn)為對(duì)于有性生殖生物而言，物種是一個(gè)具有共同基因庫(kù)、與其它類(lèi)群之間存在生殖隔離的類(lèi)群。

但物種形成是一個(gè)漸進(jìn)的過(guò)程，何時(shí)確定為新物種形成，有時(shí)在分類(lèi)實(shí)踐中難以操作。單從進(jìn)化歷史的一個(gè)截面上討論物種問(wèn)題，有其局限性 (Hennig，1966)。有學(xué)者認(rèn)為物種形成是對(duì)不同自然環(huán)境或性選擇的分化適應(yīng)，生殖隔離是這種分化適應(yīng)的副產(chǎn)物，而沒(méi)有必要將整個(gè)基因組上完全的生殖隔離作為物種形成的絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)(Wu，2001)。

DNA條形碼的研究不可避免會(huì)觸及到物種定義的問(wèn)題。Herbert(2004b)認(rèn)為，種內(nèi)種間的線粒體COⅠ基因差異存在一個(gè)閾值 (baocoding gap/threhold)，低于此閾值就可認(rèn)為是同一個(gè)種，例如鱗翅目大約在3%左右 (Herbert et al.，2003a)。不少研究支持這一假設(shè) (鳥(niǎo)類(lèi):Hebert et al.，2004b;魚(yú)類(lèi):Ward et al.，2005;鱗翅目:Hajibabaei et al.，2006b)。但在實(shí)際研究中，許多類(lèi)群存在種內(nèi)種間線粒體基因序列差異重疊的現(xiàn)象，而且各類(lèi)群、譜系之間的閾值也不相同。有學(xué)者認(rèn)為種內(nèi)種間差異更多的是經(jīng)驗(yàn)法則，缺乏理論基礎(chǔ)，很難成為適用于所有動(dòng)物類(lèi)群的標(biāo)準(zhǔn)值(Meyer and Paulay，2005;Hickerson et al.，2006;Wiemer and Fiedler et al.，2007;Townzen et al.，2008)。也有學(xué)者指出，物種的形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)的、連續(xù)的過(guò)程，單用種內(nèi)種間差異來(lái)進(jìn)行物種定義不能準(zhǔn)確將其表達(dá) (Rubinoff et al.，2006)。雖然傳統(tǒng)概念上，生殖隔離的不同物種在DNA序列的差異比同一物種之間可能要大，但DNA序列的差異標(biāo)準(zhǔn)難以確定，是否針對(duì)各類(lèi)群制定不一樣的標(biāo)準(zhǔn)，仍需要進(jìn)一步研究 (Vogler et al.，2006)。

物種定義是一個(gè)復(fù)雜的問(wèn)題，雖然僅憑DNA條形碼并不足以解決，但DNA條形碼提出的種內(nèi)種間差異閾值，及存在的種間基因流等現(xiàn)象可以為進(jìn)一步修訂物種定義提供參考。

3.3 DNA條形碼面臨的問(wèn)題

3.3.1 進(jìn)化速率

COⅠ基因在不同生物中的進(jìn)化速率并不一致(Erpenbeck et al.，2006)，如果進(jìn)化太慢，則難以鑒別物種。有研究表明，珊瑚蟲(chóng)線粒體DNA種間差異很小，難以區(qū)分物種 (Shearer et al.，2002)。在高等植物中，COⅠ基因并不適合物種鑒定(Kress et al.，2005;Chase et al.，2005;Pennisi，2007)。在這種情況下，需要增加其它候補(bǔ)基因。CBOL植物工作組 (CBOL Plant Working Group)提出在植物DNA條形碼中利用兩種基因rbcL和matK的組合來(lái)進(jìn)行鑒定。而動(dòng)物中，各個(gè)類(lèi)群并不一致。對(duì)于候補(bǔ)基因的確定，目前并沒(méi)有統(tǒng)一。

3.3.2 假基因現(xiàn)象

核內(nèi)的線粒體基因拷貝 (即假基因NUMTs，Willams and Kowlton，2001;Silva-Brand?ao et al.，2009)很容易用保守的通用引物與同源的線粒體基因同時(shí)擴(kuò)增出來(lái)，由于假基因進(jìn)化速率一般較小，所以會(huì)嚴(yán)重影響DNA條形碼的準(zhǔn)確性。雖然假基因可以鑒定 (Thalmann et al.，2004;Silva-Brand?ao et al.，2009)，但仍然會(huì)有遺漏，且其存在不能預(yù)知，給研究帶來(lái)了較大困難。目前有效避免擴(kuò)增出假基因的技術(shù)正在不斷完善，期待將來(lái)能夠加以妥善解決。

3.3.3 種間線粒體基因交流

因?yàn)榫€粒體基因?qū)儆谀赶颠z傳，所以可能會(huì)出現(xiàn)一些導(dǎo)致錯(cuò)誤鑒定的現(xiàn)象。比如:種間雜交和內(nèi)共生體感染，殺雄微生物和細(xì)胞質(zhì)不親和共生菌 (如:沃爾巴克wolbachia)所導(dǎo)致的在線粒體基因上發(fā)生的間接選擇 (Funk et al.，2000;Whitworth et al.，2007)。沃爾巴克是細(xì)胞內(nèi)寄生、母系遺傳的α-變形菌。約有17% ～76%的節(jié)肢動(dòng)物被沃爾巴克感染，包括昆蟲(chóng)及蛛螨類(lèi)。已有研究發(fā)現(xiàn)，沃爾巴克等內(nèi)共生菌的存在，會(huì)造成寄主mtDNA多態(tài)性降低或提高，從而影響基于mtDNA的DNA條形碼及系統(tǒng)發(fā)育研究。也有學(xué)者正在積極進(jìn)行沃爾巴克共生菌的研究，期待能有效避免其對(duì)DNA條形碼研究的影響。

另外，F(xiàn)unk和Omland(2003)在對(duì)2319個(gè)動(dòng)物種類(lèi)的研究中發(fā)現(xiàn)有23%的動(dòng)物種類(lèi)線粒體DNA呈多系 (polyphyly)或并系 (paraphyly)，另外還有發(fā)生在一個(gè)譜系中的網(wǎng)狀進(jìn)化等現(xiàn)象(Hulcr et al.，2007;Silva-Brand?ao et al.，2009)，如果僅用線粒體DNA條形碼來(lái)鑒定物種，可能會(huì)出現(xiàn)很多錯(cuò)誤 (Meyer and Paulay，2005;Meier et al.，2006)。

3.3.4 取樣的問(wèn)題

一些浸泡標(biāo)本給取樣帶來(lái)了困難。例如浸泡在福爾馬林等溶液中的標(biāo)本，無(wú)法提取DNA(Frézal et al.，2008)。還有一些個(gè)體很小的標(biāo)本，如果用作DNA提取，將會(huì)完全破壞標(biāo)本，或模式標(biāo)本不復(fù)存在。對(duì)于后者，有研究設(shè)計(jì)出超聲波降解法，從體長(zhǎng)在毫米數(shù)量級(jí)的蚋科昆蟲(chóng)標(biāo)本中成功地提取DNA(Mann et al.，2009)。但該方法仍然存在缺陷，由于PCR阻礙物的存在、DNA釋放量不充足以及提取到的DNA片段被過(guò)度縮短等原因，并不是所有標(biāo)本都可按照這種方法提取DNA和進(jìn)行隨后的DNA序列分析。

也有研究者提出，因?yàn)槿拥姆秶^(guò)小和不均勻，才會(huì)出現(xiàn)種內(nèi)種間有差異閾值的現(xiàn)象存在(Meyer and Paulay，2005)，如果增加地理種和近緣種的干擾，DNA條形碼鑒定的準(zhǔn)確率就會(huì)下降。所以取樣時(shí)，盡可能包括同一種群的不同地理亞種，使DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)的覆蓋面盡可能擴(kuò)大，才能達(dá)到準(zhǔn)確鑒定物種的目的。而且，目前對(duì)于DNA樣品的收集和保存還沒(méi)有一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，保護(hù)這些具有潛在價(jià)值的DNA樣品是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。

3.3.5 分析方法

DNA條形碼一般采用K-2-P(Kimura-2-parameter)模型計(jì)算種內(nèi)種間距離。K2P是遺傳距離值很小時(shí)的最佳模型 (Hebert et al.，2003a)，是生物條形碼聯(lián)盟 (CBOL)推薦使用的遺傳距離計(jì)算模型 (barcoding.si.edu/)。也有少數(shù)研究采用多元尺度分析 (Multidimensional scaling，Herbert et al.，2003a)、似然 法 (Likelihood，Matz and Neilsen，2005) 或貝葉斯 (Nielsen and Matz，2006)等方法。

常用的系統(tǒng)發(fā)育分析方法有NJ(Neighbor-Joining)、UPGMA(Unweighted pair group method with arithmetic mean)、ML(Maximum Likelihood)、MP(Maximum Parsimony)、貝葉斯、Austerlitz等。第二次iBOL會(huì)議 (臺(tái)北，2007年9月)對(duì)幾種系統(tǒng)發(fā)育分析方法進(jìn)行了比較，認(rèn)為ML法比基于遺傳距離的系統(tǒng)發(fā)育分析方法更準(zhǔn)確，但ML法運(yùn)算時(shí)間較長(zhǎng)。此外，所有方法的精確性受取樣范圍和分類(lèi)單元內(nèi)變異程度所影響。Lahaye等 (2008)經(jīng)過(guò)研究認(rèn)為，MP法和UPGMA法得到的物種正確識(shí)別率最高，并在最新的論文中只用這兩種方法。但目前DNA條形碼研究使用較多的仍然是基于遺傳距離的系統(tǒng)發(fā)育分析方法，如NJ法。在對(duì)大規(guī)模數(shù)據(jù)組進(jìn)行分析時(shí)，NJ法速度較快，在物種序列同源性較高的情況下，NJ法的準(zhǔn)確性是值得信任的。

一些研究者認(rèn)為基于遺傳距離的計(jì)算方法有缺陷，如種內(nèi)種間差異經(jīng)常發(fā)生重疊的問(wèn)題，而這些缺陷可用基于多種性狀的分析方法 (character-based approach) (DeSalle et al.，2005) 或純粹基于分類(lèi)算法的統(tǒng)計(jì)方法CAOS(characteristic attribute organization system) (Sarkar et al.，2002)加以解決。但這些方法目前僅在蜻蜓目 (Rach et al.，2008)、石鱉 (Kelly et al.，2007) 等類(lèi)群中應(yīng)用。其它計(jì)算方法還有最大似然法、BLAST等，但均未廣泛應(yīng)用。

4 DNA條形碼計(jì)劃在我國(guó)的進(jìn)展

由CBOL主辦的國(guó)際條形碼會(huì)議已經(jīng)舉辦了三屆，我國(guó)均有代表與會(huì)。2008年4月，中國(guó)科學(xué)院代表團(tuán)與iBOL簽訂了合作諒解備忘錄，使我國(guó)成為iBOL四個(gè)中心節(jié)點(diǎn)之一，與加拿大、美國(guó)和歐盟具有同等地位。隨后又成立了iBOL中國(guó)委員會(huì)，該委員會(huì)設(shè)立了南方和北方兩個(gè)分中心，該委員會(huì)的主要宗旨在于加強(qiáng)我國(guó)與iBOL的合作，同時(shí)搭建中國(guó)DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)體系與協(xié)同工作平臺(tái)并召開(kāi)iBOL中國(guó)委員會(huì)會(huì)議，爭(zhēng)取經(jīng)費(fèi)，合理配置人力資源，推動(dòng)學(xué)科發(fā)展。

在中國(guó)科學(xué)院知識(shí)創(chuàng)新工程重要方向性項(xiàng)目的支持下，DNA條形碼技術(shù)規(guī)程和規(guī)范體系已在準(zhǔn)備和探討，對(duì)不同類(lèi)群的啟動(dòng)策略、數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建、人才隊(duì)伍建設(shè)已有比較全面的設(shè)計(jì)。優(yōu)先啟動(dòng)農(nóng)林害蟲(chóng)、藥用昆蟲(chóng)、媒介昆蟲(chóng)、傳粉昆蟲(chóng)、外來(lái)入侵物種、重要保護(hù)動(dòng)物等具有重要經(jīng)濟(jì)及理論價(jià)值的類(lèi)群。中國(guó)DNA條形碼的數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)，在iBOL中國(guó)委員會(huì)南方中心和北方中心的共同努力下已經(jīng)建成，數(shù)據(jù)庫(kù)的整體結(jié)構(gòu)與加拿大的總庫(kù)保持一致。

5 DNA條形碼研究展望

不同物種的傳統(tǒng)鑒定工作常常需要采用不同的方法和技術(shù)，而DNA條形碼大大簡(jiǎn)化了這個(gè)程序，在一定程度上是一個(gè)較為通用的標(biāo)準(zhǔn)方法(Hajibabaei et al.，2007)。DNA條形碼在各個(gè)領(lǐng)域與不同類(lèi)群的研究中，所取得的成果有目共睹。針對(duì)DNA條形碼可行性的爭(zhēng)論似乎已經(jīng)不再繼續(xù)，科學(xué)家們目前正在各自領(lǐng)域爭(zhēng)分奪秒地獲取大量條形碼數(shù)據(jù)，BOLD系統(tǒng)正以每年300萬(wàn)條序列，30萬(wàn)個(gè)樣本的速度擴(kuò)充。DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)不但可以為鑒定物種服務(wù)，同時(shí)獲取的大量資源可為系統(tǒng)發(fā)育學(xué)、種群遺傳學(xué)等學(xué)科提供有用信息。iBOL是一個(gè)龐大的工程，取樣、證據(jù)標(biāo)本、DNA提取都需要大量資金和人力，需要各國(guó)分類(lèi)學(xué)、生態(tài)學(xué)等專(zhuān)家的通力合作才能完成。為了能盡快檢驗(yàn)DNA條形碼的準(zhǔn)確性和便捷性，及早建立一個(gè)完整類(lèi)群的條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)是非常必要的。DNA條形碼的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，使DNA條形碼在生物多樣性調(diào)查研究、保護(hù)生物學(xué)、有害生物控制、流行病傳染源檢測(cè)、法醫(yī)、食品工業(yè)及檢驗(yàn)檢疫等領(lǐng)域都將有廣闊的應(yīng)用前景。

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