王慶花,方柏山

(1.華僑大學(xué)化工學(xué)院,福建泉州 362021; 2.廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,福建廈門 361005)

甘油脫水酶的研究進(jìn)展

王慶花1,方柏山2

(1.華僑大學(xué)化工學(xué)院,福建泉州 362021; 2.廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,福建廈門 361005)

甘油脫水酶是微生物發(fā)酵法生產(chǎn)3-羥基丙醛和1,3-丙二醇過程中的關(guān)鍵限速酶.文中對甘油脫水酶的結(jié)構(gòu)與功能、作用機(jī)制、基因工程研究等情況進(jìn)行綜述,探討了甘油脫水酶的研究進(jìn)展并提出一些建議.

甘油脫水酶;生物轉(zhuǎn)化法;結(jié)構(gòu)功能;作用機(jī)制;基因工程

1,3-丙二醇(1,3-PD)作為合成具有優(yōu)良性質(zhì)的聚酯和聚氨酯的單體,被認(rèn)為是本世紀(jì)具有廣闊應(yīng)用前景的化工原料.近年來,生物轉(zhuǎn)化法以其利用可再生資源、清潔生產(chǎn)、環(huán)境友好型、有利于可持續(xù)發(fā)展,逐漸成為國內(nèi)外研究熱點(diǎn).目前,已發(fā)現(xiàn)了多種能以甘油為底物發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PD的菌種,但還沒有發(fā)現(xiàn)可以利用其他有機(jī)物質(zhì)為底物進(jìn)行生產(chǎn)的天然菌[1].甘油脫水酶(Glycerol Dehydratase, GDHt)是催化甘油轉(zhuǎn)化生成1,3-PD代謝途徑中的關(guān)鍵性限速酶.克雷伯肺炎桿菌(K lebsiella pneumoniae)和丁酸梭狀芽孢桿菌(Clostridia butyricum)具有較高的1,3-PD轉(zhuǎn)化率、甘油耐受力和生產(chǎn)強(qiáng)度,備受研究者關(guān)注.克雷伯肺炎桿菌編碼的是一種依賴輔酶B12的甘油脫水酶,需要在培養(yǎng)基中額外加入價(jià)格昂貴的維生素B12.丁酸梭狀芽孢桿菌屬于嚴(yán)格厭氧菌,其培養(yǎng)條件苛刻,國內(nèi)研究較少.由于丁酸梭狀芽孢桿菌中甘油脫水酶不依賴輔酶[2-3],因而成為新的研究熱點(diǎn).本文主要綜述甘油脫水酶(GDHt)的結(jié)構(gòu)與功能、作用機(jī)制、基因工程等方面的研究進(jìn)展.

1 甘油脫水酶的結(jié)構(gòu)與功能

1.1 輔酶B12依賴型甘油脫水酶

輔酶B12依賴型 GDH t是由α,β,γ3個亞基組成的二聚體,其結(jié)構(gòu)為(αβγ)2[4].輔酶依賴型 GDH t晶體結(jié)構(gòu)中,輔酶B12依賴型的GDHt是α2β2γ26個亞基通過非共價(jià)鍵的疏水相互作用締合成的異六聚體,其中兩個αβγ異型三聚體組成了一個對二聚體.α亞基含一個由8個平行的β鏈構(gòu)成的丙糖磷酸異構(gòu)酶(TIM)桶狀結(jié)構(gòu)[5].這個β-桶狀結(jié)構(gòu)把活性中心圍在中間,所以α亞基是甘油脫水酶最重要的活性中心,活性中心含有必需因子 K+的結(jié)合位點(diǎn).維生素B12與 GDH t的結(jié)合需要 K+,而 K+的結(jié)合能夠輕微改變 GDH t的空間構(gòu)象,使其與輔酶結(jié)合得更緊密.維生素B12位于 TIM桶狀結(jié)構(gòu)和β亞基之間.K+離子、底物分子及輔酶的腺苷一側(cè)只與α亞基結(jié)合.

底物的結(jié)合對酶分子構(gòu)象產(chǎn)生的變化最大的是在β亞基,其前后傾斜了約3°[4,6].與底物結(jié)合后,與輔酶以氫鍵結(jié)合的殘基增加了3個,并且鍵長都明顯縮短.這樣也導(dǎo)致Co-N鍵(Co與DB I部分的作用力)被拉長,而Co-N的鍵長關(guān)系到Co-C鍵的斷裂方式(Co-N鍵的拉長可使Co-C鍵偏向均裂[7]).Co-C鍵的均裂是酶促反應(yīng)的最開始的一步,也是必需的一步.

洪燕等[8-9]通過生物信息學(xué)軟件分析,證明了β亞基是對輔酶B12失活非常重要的一個區(qū)域.GDH t的α亞基和β亞基均與輔酶B12結(jié)合,輔酶B12的脫氧酰苷基團(tuán)朝向α亞基,而β亞基主要與輔酶的DB I部分結(jié)合.通過配體與蛋白質(zhì)結(jié)合(Ligand Protein Contacts,LPC)分析,β亞基中有13個氨基酸殘基與輔酶的DBI部分以氫鍵形式結(jié)合,底物結(jié)合時(shí)氫鍵鍵長都比未結(jié)合時(shí)短,作用面積增大,活性中心變窄,作用更強(qiáng).陳永勝等[10]未檢測到甘油脫水酶的單個亞基及亞基兩兩組合的酶活性,表明甘油脫水酶的單個亞基不能構(gòu)成活性中心;而將3個亞基按等摩爾比在體外混合則能檢測到較低酶活.據(jù)此推測,簡單的混合未能形成合理的空間構(gòu)象.

1.2 輔酶B12不依賴型甘油脫水酶

輔酶B12不依賴型 GDH t為一個單亞基二聚體結(jié)構(gòu)[11].GDHt是一個由單亞基通過非共價(jià)鍵的疏水相互作用締合成的二聚體,兩個單體呈幾乎完美的中心對稱,其單體由10個β/α桶狀結(jié)構(gòu)組成,氨基酸C端作為高度保守區(qū)是與再激活酶結(jié)合的位點(diǎn).

構(gòu)成GDH t單體核心的是兩組5個β-平行結(jié)構(gòu)反向平行排成的桶狀結(jié)構(gòu),其外圍繞若干α-螺旋.這個β/α桶狀結(jié)構(gòu)與丙酮酸甲酸裂解酶(Pyruvate Fo rmate-Lyase,PFL)和厭氧性核糖核苷酸還原酶(Anaerobic Ribonucleotide Reductase,ARNR)中的β/α桶狀結(jié)構(gòu)相似,底物甘油或1,2-丙二醇正是結(jié)合在這個桶狀結(jié)構(gòu)中.在此結(jié)構(gòu)中,GDH t,PFL和ARNR外圍α-螺旋的數(shù)量和位置有明顯的不同,若取其10個β片狀結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對,其均方根偏差(RM SD)為68 nm;若比對區(qū)域包括這些外圍α-螺旋,則均方根偏差大于80 nm,即相似性更低.

GDH t與PFL最保守的區(qū)域在C端,分別對應(yīng)前者的氨基酸殘基731～782和后者的702～754,其均方根偏差僅為7 nm.這個區(qū)域包括一個Gly自由基環(huán)、一個β-反向平行和4個α-螺旋,其中的兩個α-螺旋位于酶的表面.當(dāng) GDH t以二聚體形式存在時(shí),這個保守區(qū)域位于酶的兩個相反方向的表面,經(jīng)過對GDH t和PFL序列和結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對,發(fā)現(xiàn)兩者側(cè)鏈氨基酸具有高度保守性.結(jié)晶分析發(fā)現(xiàn),側(cè)鏈的高保守甘氨酸殘基都采用順式構(gòu)象,GDHt中的R782對應(yīng)PFL中的R753是其中最保守的殘基.從GDHt和PFL的晶體結(jié)構(gòu)分析來看,這兩個殘基都從C端的α-螺旋向內(nèi)延伸,從而與C鏈上距活性甘氨酸僅隔兩個氨基酸的殘基形成氫鍵.Jessica等[11]已通過對R782殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變證明其參與了酶催化過程中的質(zhì)子傳遞,因此有理由相信,前述C端保守區(qū)是GDH t與其再激活酶結(jié)合的位點(diǎn).

2 甘油脫水酶的作用機(jī)制

輔酶依賴型GDHt的作用機(jī)制已研究得比較透徹,其依賴的輔酶有腺苷酰化鈷銨素(Adenosylcobalamin)和甲基鈷銨素(Methylcobalamin)兩種形式.它們的生化作用不同,前者作為一個輔基輔助酶分子催化,而后者則作為催化甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的酶分子的分子伴侶.

依賴腺苷?；掍@素的酶至少有兩種與輔酶B12結(jié)合的模式,即:Base-On模式和Base-Off模式.前者是表示在結(jié)合過程中輔酶分子的DB I(5,6-二甲基苯并咪唑)部分與Co原子的化學(xué)鍵斷裂,而原酶中的一個組氨酸殘基取代其與Co原子結(jié)合;Base-Off模式是指這種取代不會發(fā)生,DB I部分依然與Co原子結(jié)合,而DB I部分與原酶中的一些氨基酸殘基相結(jié)合維持其穩(wěn)定性.Base-Off模式的典型代表即為依賴輔酶B12型甘油脫水酶(GDH t)和二醇脫水酶(DDH).

在 K+和如甘油等底物存在的條件下,輔酶B12與 GDHt結(jié)合,其Co-C鍵發(fā)生了均裂,產(chǎn)生一個5’-脫氧腺苷自由基團(tuán).這個腺苷基團(tuán)是催化過程中關(guān)鍵的部分,它將甘油的C1原子上的H原子掠奪過來,自己轉(zhuǎn)變成脫氧腺苷,而底物形成了一個甘油基團(tuán).與此同時(shí),C2原子上的 H與C1原子上的OH交換,形成HOCH2-˙CH-CH(OH)2中間態(tài).此物將H原子從5’-脫氧腺苷上奪回來后迅速脫水成為1,3-PD,5’-脫氧腺苷自由基,并與鈷胺素結(jié)合重新生成維生素B12;然后,在第2個底物分子與GDH t結(jié)合后,重新可逆均裂,釋放自由基團(tuán),進(jìn)行催化.這所有的過程都被認(rèn)為是在α亞基的TIM桶區(qū)域中進(jìn)行[5].

Stubbe等[12]報(bào)道一類新型的酶.這類酶借助S-腺苷甲硫氨酸(SAM)代替輔酶B12催化反應(yīng),稱之為SAM依賴型酶[13].它們都含有一個與[4Fe-4S]基團(tuán)相匹配的3～4個彼此間隔的半胱氨酸殘基基團(tuán)[14-15].盡管這類酶根據(jù)底物不同而需要不同的輔因子,但其催化機(jī)理相同[16].

3 甘油脫水酶的基因工程

3.1 甘油脫水酶的克隆表達(dá)與共表達(dá)

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展,利用基因工程手段對酶分子進(jìn)行改造越來越受到人們的青睞.目前,已有研究者在不同的菌體和載體中對各種來源的 GDHt進(jìn)行了表達(dá),國內(nèi)的研究大多集中在輔酶依賴型GDH t[17-24].唐悅等[17]將巴斯德梭菌(Clostridium pasteurianum)的甘油脫水酶基因?qū)氪竽c桿菌中并成功表達(dá),用金屬鎳親和層析及S-300H凝膠層析將重組蛋白進(jìn)行分離純化,所得純酶的比活為71.01μkat·g-1.洪解放等[18]在大腸桿菌中表達(dá)了K.pneumoniae編碼的甘油脫水酶基因,所得酶的最高活力為145.86μkat·(g·min)-1,實(shí)現(xiàn)了K.pneumoniae的dhaB在大腸桿菌中的高效表達(dá).平麗英等[19]將羅伊乳酸桿菌(L actobacillus reuteri)的甘油脫水酶基因在大腸桿菌表達(dá),比活力可達(dá)19. 00μkat·g-1,比野生型菌株提高了86.88%.楊仲麗等[20]將C.butyricum的甘油脫水酶基因?qū)氪竽c桿菌中并成功表達(dá),酶活性比野生菌高6倍,比活力約為0.60 m kat·g-1.劉長江等[21-23]已經(jīng)克隆出輔酶依賴型GDH t單個α亞基和整個三亞基甘油脫水酶基因序列,進(jìn)行序列分析并構(gòu)建了表達(dá)載體;周文廣等[24]也做了類似研究.

在甘油代謝酶系共表達(dá)方面,國內(nèi)研究者也做了大量工作.徐小琳等[25]從K.pneum oniaeXJPDLi基因組中克隆表達(dá)了編碼甘油脫水酶的α,β,γ亞基的dhaB,dhaC和dhaE.DNA序列分析顯示,α亞基的氨基酸殘基 H13,S193,N359,E407和M515,亞基的N47,L150和V189跟以前報(bào)道的不同.將其在E.coliBL 21中共表達(dá),SDS-PAGE顯示3個亞基能夠很好的表達(dá).重組甘油脫水酶的活性達(dá)到48μkat· g-1,是野生菌種的3倍.王鳳寰等[26]將dhaB,dhaT和gdrAB在E.coli中共表達(dá),得到酶活很高的重組體,在分批發(fā)酵中消耗14.3 g·L-1甘油,產(chǎn)生8.6 g·L-1的1,3-PD,用yqhD取代dhaT的重組體產(chǎn)1,3-PD質(zhì)量濃度為13.2 g·L-1.馬正等[27]也做了類似的研究,所得 GDH t酶活為138.36μkat· g-1,于37℃培養(yǎng)30 h后,重組體消耗40 g·L-1甘油可產(chǎn)11.3 g·L-1的1,3-PD.

3.2 甘油脫水酶的定向進(jìn)化

酶的體外定向進(jìn)化(簡稱定向進(jìn)化)是近些年興起的改造酶分子的新策略.它是根據(jù)達(dá)爾文進(jìn)化論,在人為創(chuàng)造的進(jìn)化條件下,在試管中模擬自然進(jìn)化機(jī)制(隨機(jī)突變、基因重組和自然選擇),定向選擇出所需性質(zhì)酶分子的一系列操作[28].目前,關(guān)于 GDHt的定向進(jìn)化的文獻(xiàn)報(bào)道也在逐年增加.洪燕等[29]通過LPC分析GDHt與維生素B12的結(jié)合位點(diǎn),預(yù)測出對序列中的所有氨基酸殘基定位突變后ΔG值小于0的所有突變可能;對其進(jìn)行生物信息學(xué)研究,通過定點(diǎn)突變等實(shí)驗(yàn)手段在分子水平上研究 GDH t的酶學(xué)性質(zhì)和作用機(jī)制與蛋白質(zhì)一級序列之間的關(guān)系,從而定向進(jìn)化出高活性的輔酶B12依賴型GDHt.齊向輝等[30]對K.pneumoniae中離甘油脫水酶活性位點(diǎn)19.3A和29.6A的兩個位點(diǎn)進(jìn)行飽和突變得到38個突變體,其中一個突變體β亞基的活性比野生菌種高8.3倍.

3.3 甘油脫水酶的理性設(shè)計(jì)及新酶的開發(fā)

Knietsch等[31]構(gòu)建宏基因組文庫,通過活性篩選和分子雜交,獲得具有甘油脫水酶活性的克隆.經(jīng)檢驗(yàn),其可被甘油造成自殺性失活,也可被再激活因子dhaFG復(fù)活,證明獲得了新的甘油脫水酶基因.Tobimatsu等[32]通過理性設(shè)計(jì)將二醇脫水酶β和γ亞基的N端一部分嵌合到甘油脫水酶中.對所得嵌合酶酶學(xué)性質(zhì)研究表明,短的N端序列可有效地改變酶的溶解性.黃日波等[33-34]采用一種簡便快速的方法從經(jīng)甘油富集培養(yǎng)的土樣中提取出質(zhì)量較好宏基因組DNA,克隆并表達(dá)出肺炎克雷伯氏菌、弗氏檸檬酸菌和丁酸梭菌甘油脫水酶.通過同源建模構(gòu)建了這3個甘油脫水酶的三維結(jié)構(gòu),并對其進(jìn)行亞基之間雜合改組的理性設(shè)計(jì).根據(jù)設(shè)計(jì)結(jié)果,通過基因交換的方法對甘油脫水酶大、中、小亞基進(jìn)行了雜合,可得到6種異源亞基雜合酶,使本沒有活力的來源于宏基因組的甘油脫水酶具有了活力,部分雜合酶的酸堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性得到了明顯的改善.

4 研究展望

對甘油脫水酶的研究主要集中在輔酶B12依賴型GDHt,而對輔酶B12不依賴型GDH t研究較少,還有許多研究方向需進(jìn)一步探究.

首先,在酶的制備方面,由于輔酶B12依賴型GDH t易失活且激活劑相當(dāng)昂貴,很少純化成功;而輔酶B12不依賴型 GDHt較穩(wěn)定且激活劑價(jià)格相對比較便宜,所以應(yīng)對輔酶B12不依賴型 GDHt的酶學(xué)性質(zhì)和分離純化工藝進(jìn)行深入研究.

其次,通過酶分子活性中心的改造,以期得到適應(yīng)性強(qiáng)、酶活高、穩(wěn)定性好的酶系,來適應(yīng)不同反應(yīng)體系.除了定向進(jìn)化和理性設(shè)計(jì)外,還可以采用半理性設(shè)計(jì)[35]對酶分子進(jìn)行改造,也可從酶蛋白序列出發(fā),采用偽氨基酸組成預(yù)測其生物學(xué)特性[36]或構(gòu)建調(diào)和序列[37]以獲得新型 GDHt.

在新酶的開發(fā)方面,可以利用宏基因組的方法尋找新的甘油脫水酶基因,同時(shí)應(yīng)大力篩選新的甘油脫水酶生產(chǎn)菌株.

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(責(zé)任編輯:陳志賢英文審校:劉源崗)

Recent Progress in Research of Glycerol Dehydratase

WANG Qing-hua1,FANG Bai-shan2
(1.College of Chemical Engineering,Huaqiao University,Quanzhou 362021,China; (2.College of Chemistry and Chemical Engineering,Xiamen University,Xiamen 361005,China)

Glycerol dehydratase(GDH t)is a key rate-limiting enzyme in the process of producing 3-hydroxyp ropionaldehyde(3-HPA)and 1,3-propanediol(1,3-PD)by microbial fermentation.In this paper,the research in the structure and functions,catalytic mechanism and genetic engineering of GDHt were reviewed.The research progresses of GDHt were also discussed and some suggestions were given in the end.

glycerol dehydratase;bio transformation;structure and functions;catalytic mechanism;genetic engineering

Q 556

A

1000-5013(2011)02-0125-05

2010-06-23

方柏山(1957-),男,教授,主要從事生物反應(yīng)工程的研究.E-mail:fbs@xmu.edu.cn.

國家高技術(shù)研究發(fā)展(863)計(jì)劃項(xiàng)目(2006AA 020103);國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(20446004, 20676048)