王匯濱，車昌麗，游松

（沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016）

自100 多年前首次發(fā)現(xiàn)含鹵素天然產(chǎn)物以來，目前已有5000多種含鹵素天然產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)和鑒定，其中包括強效抗菌劑如萬古霉素和氯霉素等［1］。并且大約40%的小分子藥物和約30%的農(nóng)用化學(xué)品含有鹵素，代表性含鹵素重磅炸彈藥物如恩格列凈、氯吡格雷和孟魯司特等［2-4］。鹵素的摻入會顯著改變化合物的物理化學(xué)特性并可能影響其生物學(xué)活性、代謝途徑和藥物代謝動力學(xué)特征等［5］。此外碳鹵鍵是有機合成反應(yīng)中一類重要的合成砌塊，可用于后續(xù)金屬催化的交叉偶聯(lián)反應(yīng)和親核取代反應(yīng)等［6-7］。在聚合物中引入鹵素單元可以有效提高其方向性和內(nèi)在疏水性，含鹵素材料在下一代材料設(shè)計的應(yīng)用越來越廣泛［8-10］。因此，小分子化合物的選擇性鹵化反應(yīng)在藥物、農(nóng)藥、材料等制造領(lǐng)域具有重要意義。然而，常見的化學(xué)鹵化方法存在原子效率低、選擇性低、毒性高、環(huán)境污染等問題［11-13］。

采取生物催化方法代替?zhèn)鹘y(tǒng)化學(xué)鹵化方法會提供一種選擇性更高、更高效環(huán)保的鹵化物分子合成工藝路線［14-16］。生物催化鹵化反應(yīng)主要由鹵過氧化物酶、氧氣依賴型鹵化酶和氟化酶等催化，根據(jù)其催化機制具體分為：遵循親電芳香取代機制（electrophilic aromatic substitution，SEAr）的亞鐵血紅素依賴型、釩依賴型和黃素依賴型，遵循自由基機制（radical rebound）的Fe/αKG 依賴型和遵循親核機制（nucleophilic substitution，SN2）的S-腺 苷-L-甲硫 氨酸［（S）-adenosyl methionine，SAM］依賴型等［17-21］（圖1）。在親電反應(yīng)中，鹵過氧化物酶以過氧化氫和鹵化物作為共底物，利用游離的次鹵酸鹽（XO?）作為鹵化物種對芳香性和富電子底物進行非特異性鹵化反應(yīng)，黃素依賴型鹵化酶以氧氣、FADH2和鹵化物作為共底物，利用固定在活性位點的次鹵酸鹽（XO?）作為鹵化物種對芳香性和富電子底物進行區(qū)域選擇性鹵化反應(yīng)［圖1（a）］。在自由基反應(yīng)中，F(xiàn)e/αKG依賴型鹵化酶以氧氣、αKG 和鹵化物作為共底物，利用鹵素自由基（X·）作為鹵化物種對脂肪族底物進行區(qū)域和立體選擇性鹵化反應(yīng)［圖1（b）］。在親核反應(yīng)中，SAM 依賴型鹵化酶以SAM 和鹵化物作為底物，利用親核鹵化物（X?）作為鹵化物種對親電子底物進行鹵化反應(yīng)［圖1（c）］。

圖1 不同類型鹵化酶及其相關(guān)反應(yīng)特征匯總Fig.1 Summary of different types of halogenases and their related reaction characteristics

本綜述將重點關(guān)注基于自由基催化機制的Fe/αKG 依賴型鹵化酶在綠色鹵化反應(yīng)中的研究進展，與其他類型鹵化酶相比，它可以通過形成強氧化劑Fe（Ⅳ）＝O ferrel 中間體基于自由基機制區(qū)域和立體選擇性鹵化脂肪族底物［22-24］。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計已發(fā)現(xiàn)的鹵化天然產(chǎn)物中大約一半與鹵素結(jié)合的碳原子是sp3雜化的，區(qū)域和立體選擇性鹵化反應(yīng)對天然產(chǎn)物高效合成至關(guān)重要，但對未經(jīng)活化的C－H 鍵選擇性鹵化充滿挑戰(zhàn)［6，25-27］。鹵代烷的傳統(tǒng)化學(xué)合成方法包括利用相應(yīng)的醇［28］、烯烴［29-30］和酸［31-32］進行官能團轉(zhuǎn)化，現(xiàn)代化學(xué)合成方法包括光驅(qū)動［33-35］和過渡金屬催化等［36-39］。然而，這些合成合成方法存在立體選擇性低并且反應(yīng)條件苛刻等問題［35，40］。相比之下，F(xiàn)e/αKG 依賴型鹵化酶作為生物催化劑可以在溫和條件下高區(qū)域和立體選擇性鹵化未經(jīng)活化的sp3雜化碳中心，為脂肪族底物的生物催化鹵化策略開辟新的方向。本文通過對Fe/αKG 依賴型鹵化酶催化的天然反應(yīng)以及基于結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)工程改造實例等展開分析總結(jié)，豐富鹵化反應(yīng)的酶工具箱。

1 Fe/αKG依賴型鹵化酶的發(fā)現(xiàn)與分類

Fe/αKG 依賴型鹵化酶具體分為載體蛋白依賴型（carrier protein dependent）如Barbamide 生物合成途徑中的BarB1［41］、BarB2［41］，Syringomycin E（丁香霉素E）生物合成途徑中的SyrB2［42］，Armentomycin 生 物 合 成 途 徑 中 的CytC3［43］，Hectochlorin（乙酰氯素）生物合成途徑中的HctB［44］，Coronatine（冠堿）生物合成途徑中的CmaB［45］，Kutzneride 2 生物合成途徑中的KthP、KtzD，Curacin A 生 物 合 成 途 徑 中 的CurA［46］，Jamaicamide 生物合成途徑中的JamE 等和獨立型（free standing）如Welwitindolinone 生物合成途徑中 的WelO5［47］、 WelO5*［48］、Wi-WelO15［49］，Ambiguine 生 物 合 成 途 徑 中 的AmbO5［50］，Adechlorin 生 物 合 成 途 徑 中 的AdeV［51］，（?）-Acutumine 生 物 合 成 途 徑 中 的SaDAH［52］，βethynylserine（β-乙炔絲氨酸）生物合成途徑中的BesD［53］等。基于自由基機制的Fe/αKG 依賴型鹵化酶可以選擇性活化含sp3雜化的碳?xì)滏I，1998 年Gerwick 課 題 組［54］在 來 源 于 巨 大 鞘 絲 藻L.majuscula的天然產(chǎn)物Barbamide結(jié)構(gòu)中首次發(fā)現(xiàn)含有三鹵化甲基的亮氨酸結(jié)構(gòu)單元，推測其生物合成途徑中可能存在未被鑒定的鹵化酶催化含sp3雜化的碳?xì)滏I發(fā)生鹵化反應(yīng)。該課題組利用同位素標(biāo)記亮氨酸并進行底物喂養(yǎng)實驗證實亮氨酸的pro-S甲基沒有與親電試劑反應(yīng)，表明碳鹵鍵形成機制與之前鑒定的鹵化酶完全不同，提出了基于自由基機制區(qū)域選擇性催化Barbamide 三氯甲基部分的形成。2006 年Drennan 課題組［42］首次解析Fe/αKG依賴型鹵化酶SyrB2的晶體結(jié)構(gòu)，其參與來源于丁香假單胞菌Pseudomonas syringaepv.syringaeB301D 中丁香霉素E 的生物合成途徑。2014 年Liu 課題組［55］在來源于Hapalosiphon welwitschiiUTEX B1830的Hapalindole類生物堿生物合成途徑中發(fā)現(xiàn)了首例獨立型Fe/αKG依賴型鹵化酶WelO5。2019 年Chang 課題組［53］發(fā)現(xiàn)并表征氨基酸鹵化酶BesD，其屬于Fe/αKG 依賴型鹵化酶家族。對上述載體蛋白依賴型和獨立型Fe/αKG 依賴型鹵化酶進行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明這兩大分支之間同源性較低，并且不同種類的載體蛋白依賴型Fe/αKG 依賴型鹵化酶同源性較高，而不同種類的獨立型Fe/αKG 依賴型鹵化酶同源性較低（圖2）。自然界通過進化產(chǎn)生豐富多樣的Fe/αKG 依賴型鹵化酶，這類鹵化酶不僅具有一定的底物寬泛性，而且有望發(fā)展成為高效的生物催化劑。

圖2 Fe/αKG依賴型鹵化酶序列一致性比對結(jié)果（利用MEGAX Version 10.2.4軟件進行多重序列比對并通過Clustal 2.1程序分析序列一致性）Fig.2 Sequence identity matrix of Fe/αKG-dependent halogenases(Multiple sequence alignments were created by MEGAX Version 10.2.4 and the similarity percentage of the sequence identity matrix was analyzed by Clustal 2.1).

2 Fe/αKG依賴型鹵化酶的天然反應(yīng)

2.1 載體依賴型Fe/αKG依賴型鹵化酶

2.1.1 終產(chǎn)物中含有鹵素

載體依賴型Fe/αKG 依賴型鹵化酶催化通過共價連接到磷酸泛酰巰基乙胺臂［phosphopantetheine（Ppant）arm］的?；螂幕d體蛋白類底物。首先對非核糖體肽生物合成途徑中的載體依賴型Fe/αKG 依賴型鹵化酶進行歸納總結(jié)，在丁香霉素E 生物合成過程中，SyrB2 催化LThr-SyrB1 的甲基一氯化生成4-Cl-L-Thr-SyrB1 并且不接受L-蘇氨酸作為底物，說明SyrB2催化底物需束縛到鹵素-SyrB1 硫醇化結(jié)構(gòu)域的磷酸鹽臂上以進行氯化［42，56］［圖3（a）］。

Barbamide的生物合成途徑中涉及兩個Fe/αKG依賴型鹵化酶BarB1 和BarB2，它們協(xié)同催化LLeu-（S）-BarA的C5位甲基發(fā)生三氯化反應(yīng)。BarB2可以催化L-Leu-（S）-BarA和一氯化Leu-（S）-BarA氯化生成二氯化Leu-（S）-BarA，而BarB1可以同時催化一氯化和二氯化L-Leu-（S）-BarA 生成（2S，4S）-5，5，5-三氯-Leu-（S）-BarA，表明BarB1 和BarB2 可以催化引入不同數(shù)量的鹵素原子［41］［圖3（b）］。

在來源于鏈霉菌的抗生素Armentomycin 生物合成過程中，CytC3 催化L-氨基丁酰-（S）-CytC2 的氯化反應(yīng)，與SyrB2、BarB1和BarB2類似，CytC3可以催化生成γ-氯-和γ，γ-二氯氨基丁酰-（S）-CytC2，序列比對結(jié)果表明CytC3 和SyrB2 具有較高的同源性（一致性為58%，相似性為71%）［43，57］［圖3（c）］。

除了上述非核糖體肽合成酶相關(guān)案例外，氯化酶可以參與其他類型天然產(chǎn)物的生物合成途徑。脂肪?；u化酶HctB 參與來源于巨大鞘絲藻L.majuscula中乙酰氯素的生物合成，HctB 蛋白結(jié)構(gòu)包含3 個結(jié)構(gòu)域，分別是N 末端Fe/αKG 依賴型鹵化酶結(jié)構(gòu)域、?；o酶A 結(jié)合結(jié)構(gòu)域和酰基載體蛋白結(jié)構(gòu)域。當(dāng)使用與ACP 連接的己酰基作為底物時，HctB可以催化生成5-oxo-（S）-ACP、5-chloro-4-vinyl-（S）-ACP 和5,5-dichloro-hexanoyl-（S）-ACP［44］［圖3（d）］。在Kutzneride 2 的生物合成途徑中，F(xiàn)e/αKG 依賴型鹵化酶KthP 區(qū)域和立體選擇性催化環(huán)狀底物哌嗪基的氯化反應(yīng)，生成（3S，5S）-5-氯哌酸-（S）-KtzC［58］［圖3（e）］。

圖3 載體依賴型Fe/αKG依賴型鹵化酶參與含鹵天然產(chǎn)物的生物合成途徑Fig.3 Carrier-dependent Fe/αKG-dependent halogenases involved in the biosynthetic pathway of halogen-containing natural products

2.1.2 終產(chǎn)物中含有環(huán)丙烷結(jié)構(gòu)

除上述在最終天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)中含有鹵素原子外，天然產(chǎn)物可以在其生物合成途徑中通過形成隱秘的關(guān)鍵氯化物中間體以用于后續(xù)碳碳鍵形成反應(yīng)，代表性案例為通過引入氯原子以形成環(huán)丙烷結(jié)構(gòu)［59］。含有空間剛性環(huán)丙烷的氨基酸是一類重要的合成砌塊［60］，可用于激素、肽類及酶抑制劑等藥物的合成過程，以避免被體內(nèi)酶降解并改善生物物理特性［61］，通過合成生物學(xué)途徑構(gòu)建非天然環(huán)丙烷氨基酸及其衍生物具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。

在丁香假單胞菌毒素冠堿生物合成途徑中，F(xiàn)e/αKG 依賴型鹵化酶CmaB 催化L-allo-Ile-（S）-CmaD 氯化生成γ-氯-L-allo-Ile-（S）-CmaD，隨后通過鋅依賴性酶CmaC催化γ-消除反應(yīng)生成冠狀酸-SCmaD，之后冠狀酸從CmaD 中釋放并作為冠堿的關(guān)鍵生物合成砌塊［45，57］［圖4（a）］。

Kutzneride 2 的生物合成途徑與冠堿生物合成途徑類似，F(xiàn)e/αKG 依賴型鹵化酶KtzD 催化L-Ile-（S）-KtzC 的γ 位發(fā)生氯化反應(yīng)生成γ-Cl-L-Ile-（S）-KtzC，隨后在黃素依賴型?；o酶A 脫氫酶KtzA作用下生成含環(huán)丙烷結(jié)構(gòu)的（1S，2R）-allo-CMAKtzC［62］［圖4（b）］。

大自然在長期進化過程中產(chǎn)生了種類繁多的次級代謝產(chǎn)物，同時編碼生物合成的基因簇存在平行相互作用關(guān)系，大自然采取的共同進化策略進一步豐富了天然產(chǎn)物的化學(xué)多樣性［63-64］。來源于巨大鞘絲藻L.majuscula的Curacin A和Jamaicamide具有相同的起始生物合成途徑，聚酮合酶中的鹵化酶結(jié)構(gòu)域CurA 和JamE 均可催化HMG-（S）-ACP 生成一氯化產(chǎn)物，兩者序列一致性為90%，之后在脫水酶結(jié)構(gòu)域CurE 或JamI 作用下生成3-methylglutaconyl-ACP。在Curacin A 生物合成途徑中，上述前體在CurF結(jié)構(gòu)域中脫羧酶作用下生成含α，β-烯酰硫酯結(jié)構(gòu)的3-methylcrotonyl-ACP，最終在CurF 結(jié)構(gòu)域中烯酰還原酶作用下發(fā)生環(huán)丙烷化。而在Jamaicamide生物合成途徑中，3-methylglutaconyl-ACP 在JamJ結(jié)構(gòu)域中脫羧酶作用下生成含β，γ-烯酰硫酯結(jié)構(gòu)的中間體［46，65-66］［圖4（c）］。

圖4 載體依賴型Fe/αKG依賴型鹵化酶參與催化含有環(huán)丙烷結(jié)構(gòu)天然產(chǎn)物的生物合成途徑Fig.4 Carrier-dependent Fe/αKG-dependent halogenases involved in the biosynthetic pathway of halogen-containing natural products featuring cyclopropane scaffold

2.2 獨立型Fe/αKG依賴型鹵化酶

來源于Hapalosiphon welwitschiiUTEX B1830的Welwitindolinone A 生物堿生物合成途徑中的WelO5是第1個被鑒定的獨立型Fe/αKG依賴型鹵化酶，其可以區(qū)域選擇性和立體選擇性地氯化12-epi-Fischerindole U 和12-epi-Hapalindole C 的脂肪 碳 原子，分別生成12-epi-Fischerindole G 和12-epi-Hapalindole E，并在分子中產(chǎn)生一個新的立體中心［47，55］。通過基因挖掘從產(chǎn)生Ambiguine生物堿的Fischerella ambiguaUTEX1903 中發(fā)現(xiàn)了AmbO5，與WelO5相比，AmbO5具有更寬泛的底物譜，可以選擇性催化Hapalindole、Fischerindole和Ambiguine等不同類型生物堿的鹵化反應(yīng)［50，67］［圖5（a）］。

獨立型Fe/αKG 依賴型鹵化酶不僅可以催化分子量較大的生物堿發(fā)生鹵化反應(yīng)，而且可以催化小分子氨基酸發(fā)生鹵化反應(yīng)。氨基酸鹵化酶BesD參與卡特蘭鏈霉菌Streptomyces cattleya中β-乙炔絲氨酸的生物合成，催化L-賴氨酸的γ位發(fā)生氯化反應(yīng)［68］。BesD 與其他獨立型鹵化酶如WelO5（9%）具有較低的序列一致性，但其與Fe/αKG 依賴型加氧酶同源性更高。通過生物信息學(xué)方法以BesD 為模板進行聚類并篩選分析其同源序列，相關(guān)候選酶被分為8 個不同的簇（HalA～HalH），來自HalA～HalG的19個候選酶可以區(qū)域選擇性催化不同氨基酸如L-賴氨酸、L-鳥氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-正亮氨酸等的氯化反應(yīng)，而來自HalH 的2種候選酶沒有表現(xiàn)出氨基酸鹵化酶活性［53］，以上結(jié)果表明Fe/αKG 依賴型鹵化酶可以區(qū)域選擇性催化多種類型的氨基酸發(fā)生鹵化反應(yīng)［圖5（b）］。

2019 年張勇慧課題組［51］在來源于放線菌Actinomadurasp.ATCC 39365 的含鹵素天然產(chǎn)物Adechlorin 生物合成途徑中發(fā)現(xiàn)了首例鹵化核苷的Fe/αKG 依賴型鹵化酶AdeV。AdeV 與WelO5 具有15%的相似性。AdeV催化游離核苷2′-deoxyadenosine monophosphate（2′-dAMP）發(fā)生鹵化反應(yīng)生成Cl-2′-dAMP。體外實驗結(jié)果表明，不含磷酸基團部分的2′-deoxyadenosine（2′-dA）不與AdeV 反應(yīng)，證實磷酸鹽結(jié)構(gòu)對于底物識別和鹵化反應(yīng)至關(guān)重要。此 外 兩 種 磷 酸 化 核 苷2′，3′-dideoxyadenosine-5′-monophosphate 和2′-deoxyinosine-5′-monophosphate（2′-dIMP）也能與AdeV 反應(yīng)并轉(zhuǎn)化為相應(yīng)氯化產(chǎn)物，但是只有天然底物2′-dAMP 活性較高，未來進一步改造Fe/αKG 依賴型鹵化酶可以豐富核苷酸骨架的多樣性［圖5（c）］。

植物來源鹵化天然產(chǎn)物非常罕見，2020 年Weng 課題組［52］從防己科植物中發(fā)現(xiàn)并鑒定Fe/αKG 依賴型鹵化酶SaDAH（dechloroacutumine halogenase）， 其 催 化 四 環(huán) 氯 代 生 物 堿（?）-acutumine 生物合成的最終氯化步驟。此外系統(tǒng)發(fā)育分析表明，DAH 在防己科植物和細(xì)菌中分別獨立進化，表明不同生命領(lǐng)域的代謝途徑采取平行進化策略，并且這類鹵化反應(yīng)為擴展植物化學(xué)多樣性提供了新的思路［圖5（d）］。

圖5 獨立型Fe/αKG依賴型鹵化酶參與含鹵天然產(chǎn)物的生物合成途徑Fig.5 Non-carrier-dependent Fe/αKG-dependent halogenases involved in the biosynthetic pathway of halogen-containing natural products

3 Fe/αKG 依賴型鹵化酶的結(jié)構(gòu)與催化機理

3.1 Fe/αKG依賴型鹵化酶的結(jié)構(gòu)

Fe/αKG依賴型鹵化酶屬于Fe/αKG依賴型加氧酶超家族成員，F(xiàn)e/αKG 依賴型加氧酶可以催化羥基化、環(huán)氧化、差向異構(gòu)化、去甲基化、環(huán)化等多種反應(yīng)［69］。迄今為止，不同類型的Fe/αKG 依賴型 鹵 化 酶SyrB2［42］、 CytC3［43］、 CurA［70］和WelO5［47］、Wi-WelO15［49］、BesD［53］等的晶體結(jié)構(gòu)已通過X 射線衍射進行解析，F(xiàn)e/αKG 依賴型鹵化酶具有Fe/αKG 依賴型加氧酶典型的DSBH（distorted double-stranded β-helix）桶狀核心結(jié)構(gòu)特征，底物和共底物位于DSBH 核心，外面被α 螺旋和不規(guī)則卷曲包圍［69］［圖6（a）］。Fe/αKG 依賴型鹵化酶中活性位點由鐵離子、鹵化物、αKG 和兩個組氨酸殘基組成［71］，在Fe/αKG 依賴型鹵化酶中鐵離子與鹵化物、αKG 和兩個組氨酸殘基形成配位作用（HXG），而在Fe/αKG 依賴型羥化酶中該鹵化物位置由來自天冬氨酸或谷氨酸的羧酸鹽配體取代（HXD/E）。

Fe/αKG 依賴型鹵化酶在催化過程中表現(xiàn)出顯著的構(gòu)象變化。CurA 的晶體結(jié)構(gòu)在開放和閉合構(gòu)象的不同配體狀態(tài)下被解析，在閉合構(gòu)象中Cap結(jié)構(gòu)域的27個殘基（A40～H66）覆蓋了由αKG結(jié)合引發(fā)的活性位點，之后在αKG 和氯化物作用下識別底物HMG-（S）-ACP 發(fā)生氯化作用。而在不存在αKG 情況下，CurA 處于開放構(gòu)象并且Cap 結(jié)構(gòu)域完全無序［70］。在獨 立型Fe/αKG 依 賴 型鹵化酶WelO5結(jié)構(gòu)中觀察到類似的構(gòu)象變化，WelO5在底物結(jié)合之前采用開放構(gòu)象將活性位點暴露于溶劑中，底物結(jié)合后外部α-螺旋區(qū)域（W210～Q238）移動覆蓋活性位點形成閉合構(gòu)象。并且WelO5晶體結(jié)構(gòu)的解析豐富了對動態(tài)C末端α-螺旋區(qū)域的相關(guān)認(rèn)識，該基序?qū)τ讵毩⑿虵e/αKG 依賴型鹵化酶底物識別至關(guān)重要［47］［圖6（b）］。WelO5 中的C 末端α-螺旋區(qū)域被重組或突變，使其在結(jié)構(gòu)上與AmbO5相似，構(gòu)建的WelO5-AmbO5 嵌合體與野生型AmbO5 底物范圍一樣寬泛［50］。在底物結(jié)合方面，對于載體蛋白依賴型Fe/αKG 依賴型鹵化酶，底物主要位于氯離子配體附近，而對于獨立型Fe/αKG依賴型鹵化酶，底物可以分別位于Fe（Ⅳ）＝O中間體氧結(jié)合位點的兩側(cè)［24］［圖6（c）］。

圖6 Fe/αKG依賴型鹵化酶的結(jié)構(gòu)特征Fig.6 Structural characteristics of Fe/αKG-dependent halogenases

3.2 Fe/αKG依賴型鹵化酶的催化機理

Fe/αKG 依賴型酶的非血紅素亞鐵離子與兩個組氨酸側(cè)鏈和αKG 的兩個氧原子形成4 個配位作用，在羥化酶中天冬氨酸或谷氨酸的側(cè)鏈羧酸部分與亞鐵離子形成第5個配位作用，而在鹵化酶中鹵素原子代替該位置形成第5個配位作用。在沒有底物時與水分子形成第6 個配位作用。Fe/αKG 依賴型鹵化酶催化機制與Fe/αKG 依賴型加氧酶類似［20-21，72］，通過形成高價態(tài)和短壽命的強氧化劑Fe（Ⅳ）＝O ferrel中間體（Ⅵ），底物結(jié)合后觸發(fā)亞鐵離子中心釋放水分子，隨后與氧氣分子結(jié)合引發(fā)催化作用，氧氣分子迅速與αKG 反應(yīng)形成琥珀酸鹽并釋放二氧化碳，從而形成高反應(yīng)性Fe（Ⅳ）＝O ferrel 中間體（Ⅵ）［73-75］。Fe/αKG 依賴型鹵化酶基于自由基機制從底物未活化的碳?xì)滏I中攫取氫產(chǎn)生底物自由基和Fe（Ⅲ）-氯化物/羥基中間體（Ⅶ）。然后氯化物反彈到底物自由基生成鹵化產(chǎn)物，而在羥化酶中羥基發(fā)生反彈生成羥化產(chǎn)物［76］（圖7）。

圖7 Fe/αKG依賴型鹵化酶和羥化酶的催化機理Fig.7 Catalytic mechanism of Fe/αKG-dependent halogenases and hydroxylases

4 Fe/αKG依賴型鹵化酶的應(yīng)用拓展

4.1 靈活引入鹵素

鹵化酶可以將不同鹵素原子（氟化物、氯化物、溴化物和碘化物）引入到各類天然產(chǎn)物骨架中，在海洋天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的鹵化酶通常使用溴化物作為鹵素來源，而在陸生天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的鹵化酶主要使用氯化物［77-79］。氟元素在自然界鹵素存在范圍僅次于氯元素，但氟化天然產(chǎn)物較為罕見，可能由于氟的電負(fù)性較大而導(dǎo)致自然界氟化反應(yīng)較難實現(xiàn)［80］，碘元素在自然界鹵素存在豐度最低而較少存在于天然產(chǎn)物中。迄今為止表征的Fe/αKG依賴型鹵化酶主要與天然產(chǎn)物的氯化反應(yīng)有關(guān)，然而在含有過量NaBr的培養(yǎng)基中培養(yǎng)丁香假單胞菌時可以產(chǎn)生溴代丁香霉素E，此外當(dāng)用更高濃度的NaBr進行檢測時SyrB2表現(xiàn)出溴化能力，但該酶對氯化物的底物偏好性為溴化物的180 倍［81］。CytC3 可以催化其天然底物L(fēng)-氨基丁酰-S-CytC2 發(fā)生溴化反應(yīng)［82］。HctB在用其天然底物和高濃度KBr測定時也表現(xiàn)出溴化活性［44］。此外對于獨立型Fe/αKG 依賴型鹵化酶，WelO5也存在溴化活性可以生成（13R）-Br-12-epi-Fischerindole U［47，83］。HalB 可以催化L-賴氨酸發(fā)生溴化反應(yīng)［53］。但迄今為止還沒有報道過Fe/αKG依賴型鹵化酶催化碘元素或者氟元素的引入（圖8）。

圖8 Fe/αKG依賴型鹵化酶催化的溴化反應(yīng)Fig.8 Bromination reactions catalyzed by Fe/αKG-dependent halogenases

除了在引入氯元素和溴元素方面的靈活性外，F(xiàn)e/αKG 依賴型鹵化酶可以催化生物合成途徑中的多種氯化反應(yīng)。在Barbamide 生物合成途徑中BarB2 催化L-Leu-（S）-BarA 的一氯化和二氯化反應(yīng)，而BarB1催化氯化反應(yīng)生成（2S，4S）-5，5，5-3-Cl-Leu-（S）-BarA，證實了這兩種鹵化酶在生物合成中的協(xié)同性和必要性［41］。此外，CytC3 和HctB可以催化一氯化和二氯化反應(yīng)［43-44］。在未來研究中基于Fe/αKG 依賴型鹵化酶引入鹵素的靈活性可以進一步對其進行蛋白質(zhì)工程改造以實現(xiàn)不同類型和數(shù)量鹵素原子的引入。

4.2 拓展底物譜

大多數(shù)Fe/αKG 依賴型鹵化酶與載體蛋白結(jié)合限制其作為生物催化劑的實際工業(yè)應(yīng)用，然而近年發(fā)現(xiàn)并鑒定的WelO5 在不需要載體蛋白的情況下催化鹵化反應(yīng)［47，84］，為Fe/αKG 依賴型鹵化酶相關(guān)應(yīng)用開辟了新的方向。通過對Fe/αKG 依賴型鹵化酶進行蛋白質(zhì)工程改造可以進一步拓寬其底物譜范圍［85-86］。許多課題組已經(jīng)嘗試通過蛋白質(zhì)工程改造WelO5 以提高生物催化活性和擴展底物范圍。Boal 課題組和Liu 課題組［50］合作通過分析WelO5 的結(jié)構(gòu)特征發(fā)現(xiàn)在催化過程中外部C 末端α-螺旋發(fā)生構(gòu)象變化并向底物活性位點移動，對WelO5 和AmbO5 進行序列比對分析推測C 末端α-螺旋區(qū)域的11 個殘基可能影響底物識別，由于該區(qū)域在WelO5 和AmbO5 靈活度較高，他們分別將WelO5 的N 末端與AmbO5 的C 末端結(jié)合構(gòu)建WelO5-AmbO5 嵌合體，和替換C 末端α-螺旋區(qū)域的18 個殘基構(gòu)建WelO5-AmbO5-18 嵌合體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種嵌合體底物范圍與AmbO5 一樣寬泛［圖9（a）］。

鑒于WelO5 的C 末端α-螺旋區(qū)域?qū)Φ孜锾禺愋缘挠绊?，Liu 課題組［48］進一步鑒定和表征來源于Hapalosiphon weltwitschiiIC-52-3 的hapalosiphon生物堿鹵化酶WelO5*，該酶與WelO5 具有95%的序列一致性，僅有15 個氨基酸不同，其有11 個氨基酸位于C 末端的α-螺旋區(qū)域，結(jié)果表明WelO5*鹵化反應(yīng)活性比WelO5更高。

除了上述對WelO5 的C 末端區(qū)域進行蛋白質(zhì)工程改造以外，Buller 課題組［87］通過分子對接確定關(guān)鍵位點并構(gòu)建WelO5*CA2和CB2兩種突變體用于在Martinelline 類似物的兩個不同位點進行區(qū)域選擇性鹵化反應(yīng)，標(biāo)志著首次將WelO5 家族酶應(yīng)用于非天然底物的鹵化反應(yīng)［圖9（b）］。

在進一步擴展獨立型Fe/αKG 依賴型鹵化酶的底物范圍研究中，Hoebenreich 課題組［49］研究發(fā)現(xiàn)來自Westiella intricataHT-29-1 的Wi-WelO15 能夠選擇性氯化非天然Hapalindoles 類生物堿。以Wi-WelO15 突變體Wi-0（V6I/D284N）晶體結(jié)構(gòu)為起始結(jié)構(gòu)進行4 輪定向進化，最終突變體Wi-11（N47R/V81T/A82M/A88V/V90P/S93L/S103A）和Wi-12（N47R/A82L/V90P/S93D）對12-epi-Hapalindole C底物類似物的轉(zhuǎn)化率高達91%，化學(xué)選擇性高達96%［圖9（c）］。以上對WelO5 同源蛋白改造研究表明，獨立型Fe/αKG 依賴型鹵化酶的底物譜主要取決于相關(guān)關(guān)鍵熱點殘基，未來研究可以將理性設(shè)計和定向進化相結(jié)合以豐富Fe/αKG 依賴型鹵化酶的底物范圍。

圖9 獨立型Fe/αKG依賴型鹵化酶底物譜的拓展Fig.9 Expansion of the substrate spectrum of non-carrier-dependent Fe/αKG-dependent halogenases

4.3 Fe/αKG依賴型鹵化酶與羥化酶

Fe/αKG依賴型鹵化酶與羥化酶的活性位點的主要結(jié)構(gòu)差異在HXG 基序。在2014 年發(fā)現(xiàn)WelO5 之前，F(xiàn)e/αKG依賴型鹵化酶僅由載體依賴型Fe/αKG依賴型鹵化酶組成。因此，許多課題組嘗試將Fe/αKG依賴型羥化酶功能轉(zhuǎn)化為鹵化酶，由于羥化酶Asp/Glu羧酸鹽配體占據(jù)了鹵化物相應(yīng)鹵素原子位置與鐵離子形成配位作用，通常采取用甘氨酸或丙氨酸替換羥化酶HXD/E 基序的天冬氨酸或谷氨酸以重塑Fe/αKG 依賴型酶的二級配位球（second-coordination sphere）模擬鹵化酶的HXG基序［88］［圖10（a）］。但是將上述策略應(yīng)用于代表性Fe/αKG 依賴型羥化酶如?；撬犭p加氧酶（taurine dioxygenase，TauD）等的嘗試失敗了［89-90］。由此產(chǎn)生的突變體不僅沒有發(fā)揮鹵化酶的功能，而且失去其羥化酶活性，推測原因可能是TauD 突變體D101A 鐵結(jié)合效率低下，或者與活性位點中的氯離子結(jié)合能力不足。

通過采取同源二級配位球檢索策略，Boal課題組和Liu 課題組［91］合作利用WelO5 與其天然底物12-epi-Fischerindole U 的復(fù)合物結(jié)構(gòu)以挖掘目標(biāo)羥化酶，來自伯克霍爾德氏菌Burkholderia ambifaria的Fe/αKG依賴型羥化酶SadA（天然底物N-琥珀酰-L-亮氨酸）與WelO5序列一致性僅為19%，但兩者活性位點高度同源。作者首先嘗試用甘氨酸取代SadA 的HXD 基序中的天冬氨酸，突變體SadA D157G在NaCl或NaBr條件下鹵化其天然底物天然底物N-琥珀酰-L-亮氨酸的C3位，具有高區(qū)域選擇性但低鹵化/羥基化比率。鑒于WelO5突變體S189A發(fā)生羥基化作用，作者嘗試將SadA 中對應(yīng)殘基G179 突變?yōu)榻z氨酸以抑制其羥基化活性，但SadA D157G/G179S 的活性比D157G 更低并且化學(xué)選擇性保持不變，表明氧代中間體在野生型SadA 中與WelO5 中以不同方式穩(wěn)定，羥化酶HXD 基序中的單點突變可以轉(zhuǎn)換為鹵化活性［圖10（b）］。

此外，Buller 課題組通過對已知Fe/αKG 依賴型羥化酶進行生物信息學(xué)分析和體外實驗驗證，鑒定來源于細(xì)菌Sinorhizobium meliloti的脯氨酰4-羥化酶（L-prolinecis-4-hydroxylase，P4H）［92］，通過引入單點突變（D108G）將其重塑為鹵化酶，并且具有不同的區(qū)域選擇性。通過采取4輪定向進化策略鑒定突變體SmP4H-7（V57L/S107T/D113E/T115P（off-target）/R274H），與親本酶SmP4H-0（D108G）相比，對L-脯氨酸的氯化活性提升了98 倍。此外，突變體SmP4H-7 展現(xiàn)出對鹵素原子引入的雜泛性，可以催化L-脯氨酸發(fā)生溴化反應(yīng)，但其更偏好氯離子［93］［圖10（c）］。以上將羥化酶重塑為新型鹵化生物催化劑豐富了碳?xì)滏I的功能化鹵化策略。

上述案例表明通過利用重塑Fe/αKG 依賴型羥化酶的二級配位球策略可以成功將其轉(zhuǎn)化為鹵化酶。除此之外，不同課題組嘗試?yán)蒙鲜霾呗詫Ⅺu化酶轉(zhuǎn)換為羥化酶，進一步加深對催化雜泛性的認(rèn)識［88］。Drennan 課題組［42］試圖通過用Asp 或Glu 替換鹵化酶SyrB2 HXA 基序中的Ala 將其轉(zhuǎn)變?yōu)榱u化酶，然而鹵化酶活性消失并且沒有檢測到羥基化，即使該酶保留了其結(jié)合鐵的能力。除了鹵化物調(diào)節(jié)和配位對空間和靜電相互作用的要求外，通過計算方法對SyrB2反應(yīng)性的研究表明，鹵化反應(yīng)時底物位于Fe（Ⅳ）＝O中間體氧的遠端并且靠近鹵化物有利于Fe（Ⅲ）-Cl反彈發(fā)生鹵化反應(yīng)，而非Fe（Ⅲ）-OH 反彈發(fā)生羥基化反應(yīng)［74，94-99］。這一假設(shè)通過使用非天然底物L(fēng)-正纈氨酸進一步證實，L-正纈氨酸與天然底物L(fēng)-蘇氨酸相比含有額外的亞甲基，由于L-正纈氨酸含有較長側(cè)鏈?zhǔn)蛊涓咏醮鶊F，因此被SyrB2羥基化［100］，以上結(jié)果證實SyrB2可以氯化和羥基化不同的底物類似物，并根據(jù)特定底物定位調(diào)節(jié)化學(xué)選擇性［圖10（d）］。

與SyrB2 不同的是，Boal 課題組和Liu 課題組合作［47］通過用天冬氨酸或谷氨酸成功地將WelO5轉(zhuǎn)化為羥化酶，突變體G166D 的晶體結(jié)構(gòu)顯示出在羥化酶中發(fā)現(xiàn)天冬氨酸與鐵離子產(chǎn)生配位作用，此外證明了二級配位球突變體S189A 產(chǎn)生了羥基化和鹵化產(chǎn)物的混合物，突出二級配位球氫鍵作用對化學(xué)選擇性調(diào)控的重要作用［圖10（e）］。

Buller課題組［87］通過以martinelline類似物為底物篩選一組獨立型Fe/αKG 依賴型鹵化酶（WelO5、AmbO5、 WelO5* 和 工 程 化 的SadA D157G），WelO5*主要生成羥基化產(chǎn)物（1%轉(zhuǎn)化為氯化產(chǎn)物，而40%轉(zhuǎn)化為羥基化產(chǎn)物）。為提高活性和化學(xué)選擇性，該課題組通過分子對接選取WelO5* 9 個殘基（N74、F77、V81、A82、I84、A88、V90、R153和I161）進行單位點飽和突變，殘基A82、A88和R153的突變體文庫鹵化活性增加3～5倍，而殘基V81和I161的突變體文庫活性增加10～20倍。在篩選過程中，觀察到了另一種區(qū)域選擇性氯化產(chǎn)物。基于它們不同的區(qū)域選擇性，對來自第1輪進化的最佳突變體CA1和CB1分別進行迭代飽和突變。與CA1相比，第2輪突變體CA2（V181L/I161M）在氯化活性和羥基化區(qū)域選擇性方面進一步提升了10倍，而第2輪變體CB2（V181R/I161S）幾乎完全催化底物氯化，并且CB2也可以催化溴化反應(yīng)，但其對溴化物的偏好低于氯化物［圖10（f）］。此外Hoebenreich課題組［49］發(fā)現(xiàn)Wi-WelO15 I84H 突變體可以催化羥基化反應(yīng)，進一步證明化學(xué)選擇性受二級配位球中底物定位的控制［圖10（g）］。

圖10 Fe/αKG依賴型鹵化酶和羥化酶功能互換實例（a）重塑Fe/αKG依賴型酶二級配位球的策略；（b）工程化改造羥化酶SadA催化鹵化反應(yīng)；（c）工程化改造羥化酶SmP4H催化鹵化反應(yīng)；（d）鹵化酶SyrB2分別催化鹵化反應(yīng)和羥化反應(yīng)；（e）工程化改造具有雜泛性的鹵化酶WelO5*分別區(qū)域選擇性催化羥化和鹵化反應(yīng)；（f）工程化改造鹵化酶WelO5催化羥化反應(yīng)；（g）工程化改造鹵化酶Wi-WelO15催化羥化反應(yīng)Fig.10 Function swap examples of Fe/αKG-dependent halogenases and hydroxylases(a)Strategies to reshape the second sphere region of Fe/αKG-dependent enzymes;(b)Engineering the hydroxylase SadA for halogenation;(c)Engineering the hydroxylase SmP4H for halogenation;(d)Halogenation reaction and hydroxylation catalyzed by halogenase SyrB2,respectively;(e)Engineering the promiscuous hydroxylase WelO5*for hydroxylation and halogenation,respectively;(f)Engineering the halogenase WelO5 for hydroxylation;(g)Engineering the halogenase Wi-WelO15 for hydroxylation.

類似地，Chang 課題組［53］解析BesD 與底物復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn)除了HXG 基序外，殘基His134 和Asn219 分別通過與底物和氧配體的二級配位球相互作用，對化學(xué)選擇性產(chǎn)生重要影響。在未來研究中可以通過結(jié)合理論計算結(jié)果重塑Fe/αKG 依賴型酶的二級配位球［101-102］，鑒定區(qū)域選擇性關(guān)鍵殘基以實現(xiàn)定制化鹵化反應(yīng)和羥化反應(yīng)。

4.4 建立新反應(yīng)類型

Fe/αKG依賴型鹵化酶不僅可以催化碳鹵鍵的形成，而且能催化碳氮鍵的形成，例如野生型SyrB2催化脂肪族底物發(fā)生疊氮化和硝化反應(yīng)［103］。SaDAH 也表現(xiàn)出對（?）-acutumine 的疊氮化催化活性［52］。氨基酸鹵化酶HalB 可以識別疊氮陰離子生成疊氮賴氨酸［53］（圖11）。由HalB 和HalA 催化產(chǎn)生的氯代賴氨酸可以通過體外轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)生成含9個氨基酸的短肽，體現(xiàn)出Fe/αKG依賴型鹵化酶在利用合成生物學(xué)策略生產(chǎn)天然產(chǎn)物類似物的潛能。并且新反應(yīng)類型疊氮化和硝化反應(yīng)為脂肪族底物碳?xì)滏I活化形成碳氮鍵提供了新的生物催化途徑。

圖11 Fe/αKG依賴型鹵化酶的新反應(yīng)類型Fig.11 Novel reaction type of Fe/αKG-dependent halogenases

5 總結(jié)與展望

不對稱鹵化sp3雜化碳中心具有重要研究意義，形成的碳鹵鍵可用于有機合成后期功能化反應(yīng)。自然界通過進化利用Fe/αKG 依賴型鹵化酶催化脂肪族底物不對稱鹵化反應(yīng)，在過去10 多年關(guān)于Fe/αKG依賴型鹵化酶的研究中對天然產(chǎn)物生物合成途徑進行解析不斷有載體依賴型和獨立型Fe/αKG 依賴型鹵化酶被發(fā)現(xiàn)和鑒定。在功能更新方面，鹵素原子的引入可以增強化合物分子的抗癌、抗真菌、抗病毒、抗炎等生物活性［104］，例如抗真菌化合物丁香霉素E中氯原子的引入可以將其抗真菌活性提高4倍［105］，碳鹵鍵可以與靶標(biāo)蛋白形成的鹵鍵相互作用而影響相關(guān)活性，在藥物設(shè)計中引入鹵素原子從而改善相關(guān)化合物的成藥性［106］。此外通過生物合成途徑形成的隱秘的碳鹵鍵可以用于構(gòu)筑環(huán)丙烷合成砌塊和用于合成氨基酸中末端炔基等，類似地，以碳鹵鍵作為重要中間體將Fe/αKG 依賴型氨基酸鹵化酶與后修飾酶進行級聯(lián)可以合成含氮雜環(huán)、二胺、酮酸和肽類等不同類型產(chǎn)物［53］，并且載體依賴型Fe/αKG 依賴型鹵化酶也可以鹵化氨基酸類底物，突出Fe/αKG 依賴型鹵化酶在合成生物學(xué)多酶級聯(lián)反應(yīng)中的應(yīng)用潛力。與其他類型的鹵化酶相比，F(xiàn)e/αKG 依賴型鹵化酶采取獨特的自由基機制區(qū)域和立體選擇性鹵化脂肪族底物，但目前其底物范圍、催化活性等方面有待進一步提升，在未來研究中可以從以下5方面開展：

（1）新酶的挖掘與表征。WelO5 和BesD 等的發(fā)現(xiàn)為進一步探索新的獨立型Fe/αKG 依賴型鹵化酶提供重要參考，未來可以利用生物信息學(xué)方法以已知鹵化酶基因作為模板并結(jié)合關(guān)鍵特征殘基從宏基因組數(shù)據(jù)庫挖掘篩選進而獲得新的Fe/αKG依賴型鹵化酶［107］。

（2）酶催化活性的提升。Fe/αKG依賴型鹵化酶的低周轉(zhuǎn)數(shù)限制其工業(yè)應(yīng)用，目前主要采取在反應(yīng)體系中添加抗氧化劑的策略［108］。未來研究中可以通過采取類似P450為提高周轉(zhuǎn)數(shù)的定向進化方法對Fe/αKG依賴型鹵化酶進行工程化改造以提升其催化活性。

（3）酶區(qū)域選擇性的控制。WelO5* CA2 和CB2 兩種突變體區(qū)域選擇性催化martinelline 發(fā)生鹵化反應(yīng)［87］，此外羥化酶SmP4H 可以區(qū)域選擇性分別催化羥化反應(yīng)和鹵化反應(yīng)［93］。未來可以進一步基于進化視角從酶的結(jié)構(gòu)-功能角度出發(fā)鑒定調(diào)控區(qū)域選擇性的關(guān)鍵殘基以研究區(qū)域選擇性機制，并有利于拓展底物范圍［109］。

（4）酶反應(yīng)類型的拓展。鑒于Fe/αKG 依賴型鹵化酶和羥化酶兩種酶家族活性位點結(jié)構(gòu)高度相似，目前已有研究對羥化酶如SmP4H 進行改造使其具有羥化反應(yīng)活性，對鹵化酶如WelO5進行改造使其具有羥化反應(yīng)活性。未來對Fe/αKG 依賴型酶的二級配位球進行重塑以實現(xiàn)定制化鹵化反應(yīng)和羥化反應(yīng)［88］。此外與Fe/αKG 依賴型羥化酶類似［110］，F(xiàn)e/αKG 依賴型鹵化酶可以催化疊氮化和硝化反應(yīng)形成碳氮鍵［103］，豐富碳氮鍵形成的酶工具箱。

（5）人工生物合成途徑的創(chuàng)建。展望未來，將Fe/αKG 依賴型鹵化酶引入人工生物合成途徑并結(jié)合代謝工程策略可以多樣性高效合成人工天然產(chǎn)物化合物庫。此外在未來通過模擬Fe/αKG 依賴型鹵化酶催化機制可以設(shè)計人工酶和仿生化學(xué)催化劑等［111-113］，與其他生物合成酶進行適配創(chuàng)建全新的人工生物合成途徑［114-116］。

綜上所述，隨著近年來Fe/αKG 依賴型鹵化酶相關(guān)研究的不斷深入，其反應(yīng)類型、底物范圍和選擇性等不斷擴展。大自然是世界上最強大的化學(xué)家，通過解析天然產(chǎn)物生物合成的關(guān)鍵酶可以豐富Fe/αKG 依賴型鹵化酶類型。除此之外，未來蛋白質(zhì)工程策略和機器學(xué)習(xí)結(jié)合將進一步拓展Fe/αKG 依賴型鹵化酶的生物催化范圍。將Fe/αKG 依賴型鹵化酶發(fā)展為高效的生物催化劑并利用生物催化級聯(lián)反應(yīng)或化學(xué)酶法催化策略可以實現(xiàn)未經(jīng)活化sp3雜化碳中心的選擇性鹵化反應(yīng)，為合成生物學(xué)發(fā)展提供關(guān)鍵酶學(xué)催化元件（圖12）。

圖12 合成生物學(xué)理念指導(dǎo)下的Fe/αKG依賴型鹵化酶工程化改造并整合至微生物細(xì)胞工廠Fig.12 Engineering of Fe/αKG-dependent halogenases and their adaption in microbial chemical factories under the guidance of the theory of synthetic biology