后佳琦，姜楠，馬蓮菊，盧元

（1 清華大學(xué)化學(xué)工程系，北京 100084； 2 沈陽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 沈陽 110034）

合成生物學(xué)是指對生物體進行有目標的設(shè)計、改造、重新合成，甚至創(chuàng)建并賦予其非自然功能的“人造生命”。無細胞合成生物學(xué)正在發(fā)展成為其中一種強大有效的手段，其目的是在不使用整個活細胞的情況下，理解、利用和擴展自然生物系統(tǒng)的功能［1-2］。無細胞蛋白質(zhì)合成（cell-freeprotein synthesis，CFPS）是無細胞合成生物學(xué)的技術(shù)核心，也被稱為體外蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯技術(shù)，該技術(shù)作為基礎(chǔ)和應(yīng)用生物學(xué)的研究工具已經(jīng)使用了近70 年［3］。CFPS 通過提取核糖體、氨酰-tRNA 合成酶、翻譯起始和延伸因子、核糖體釋放因子等轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)折疊和能量代謝所必需的元素，并向其中添加DNA 模板、能量和各種輔因子，模仿胞內(nèi)環(huán)境以合成目標蛋白質(zhì)。CFPS系 統(tǒng) 最 初 是 由Nirenberg 和Matthaei［4］在20 世 紀60 年代開發(fā)的，在發(fā)現(xiàn)遺傳密碼方面發(fā)揮了重要作用。在過去的20 年里，CFPS 系統(tǒng)經(jīng)歷了飛速的發(fā)展，以滿足對廉價和快速重組蛋白表達技術(shù)的日益增長的需求，這導(dǎo)致了眾多高活性CFPS 平臺的發(fā)展［5］。通過PubMed 搜索關(guān)鍵詞“cell-free protein synthesis”分析1953—2020 年公開論文發(fā)表數(shù)量（圖1），可以看到CFPS 技術(shù)一直受到廣泛的使用和關(guān)注。

圖1 每年CFPS論文發(fā)表數(shù)量Fig.1 Numbers of annual CFPS publications

CFPS 之所以能夠飛速發(fā)展，主要是其具有快速表達具生物活性重組蛋白的潛力。具有這種潛力的主要原因是其相較于細胞體系的特有優(yōu)勢（圖2）。首先，CFPS 系統(tǒng)使用細胞提取物來模擬細胞內(nèi)的環(huán)境，無需完整的活細胞且沒有細胞膜的限制，是一個開放的合成系統(tǒng)。該優(yōu)點使蛋白質(zhì)表達操作簡單，可直接在體外控制轉(zhuǎn)錄及翻譯過程，因無跨膜運輸問題、允許外源物質(zhì)直接添加到反應(yīng)體系，對反應(yīng)條件可以進行針對性的調(diào)控，例如促進蛋白質(zhì)的折疊和翻譯后修飾。并且因為不存在活細胞問題，CFPS 系統(tǒng)可以表達一些難表達的蛋白質(zhì)，比如有細胞毒性的蛋白質(zhì)［6］，同時表達過程不受細胞代謝產(chǎn)物影響。其次，系統(tǒng)中的所有物質(zhì)與能量都可以用于生產(chǎn)感興趣的蛋白質(zhì)，大大提高了蛋白質(zhì)的表達效率。這些優(yōu)勢克服了傳統(tǒng)的基于細胞的蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的很多局限性。此外，CFPS可以使用線性DNA作為表達模板，避免了基于質(zhì)粒方法克隆步驟的耗時問題，使CFPS 系統(tǒng)成為有潛力的高通量篩選工具［7］。

圖2 體內(nèi)細胞和體外無細胞蛋白質(zhì)合成比較（在體內(nèi)細胞系統(tǒng)，目的質(zhì)粒導(dǎo)入細胞，通過培養(yǎng)、裂解和離心純化獲得目的蛋白。在CFPS系統(tǒng)中，通過向細胞提取物中添加DNA模板、氨基酸、NTPs、能量底物等輔助因子，離心純化后獲得目的蛋白）Fig.2 Comparison of protein synthesis through in vivo cellular and in vitro cell-free systems(In the in vivo cellular system,the target plasmid is introduced into the cell,and the target protein is obtained through cell culture,lysis,and product purification.In the CFPS system,by adding DNA template,amino acids,NTPs,energy substrates and other cofactors to the cell extract,the target protein is obtained after centrifugation and purification.)

隨著CFPS 的快速發(fā)展，CFPS 系統(tǒng)類型已經(jīng)多種多樣。一類是提取物系統(tǒng)，根據(jù)細胞的提取物類型可分為高使用率模式細胞類型和低使用率非模式細胞類型。高使用率模式細胞類型主要包括大腸桿菌、酵母、小麥胚芽、昆蟲、中國倉鼠卵巢和兔網(wǎng)織紅細胞等［8］。這些系統(tǒng)存在各自的優(yōu)缺點，可根據(jù)想表達的蛋白質(zhì)類型選擇合適的提取物。低使用率非模式細胞類型主要包括神經(jīng)孢霉、鏈霉菌、需鈉弧菌、枯草芽孢桿菌、煙草、擬南芥、惡臭假單胞菌、巨大芽孢桿菌和古生菌等。使用非模式細胞作為底盤進行無細胞體系的構(gòu)建雖然尚未得到廣泛使用或開發(fā)，但未來極有可能成為無細胞體系快速創(chuàng)新的源泉。另一類CFPS 系統(tǒng)是2001 年由Shimizu 等［9］開發(fā)的一種利用重組元素合成蛋白質(zhì)的無細胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)，稱為PURE 體系。PURE 體系是通過最少數(shù)量的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件組合而成，雖然與提取物系統(tǒng)相比成本較高，但因組分明確、可控，在生物化學(xué)基礎(chǔ)研究中具有很大的優(yōu)勢［10］。

由于CFPS 系統(tǒng)的多樣性及其在不同層次方面的優(yōu)勢，使得CFPS 的應(yīng)用領(lǐng)域也越來越廣泛。如今CFPS 系統(tǒng)已在基因電路（原型設(shè)計、生物傳感和代謝工程）研究、蛋白質(zhì)工程（膜蛋白、類病毒顆粒、翻譯后修飾、非天然氨基酸嵌入和蛋白質(zhì)進化）和人工“生命體系”構(gòu)建（噬菌體合成和人工細胞構(gòu)筑）研究中展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。本文對CFPS 系統(tǒng)的發(fā)展進行了全面的綜述，首先介紹了CFPS 系統(tǒng)的組成及不同類型的CFPS 系統(tǒng)的發(fā)展，包括以提取物為基礎(chǔ)的系統(tǒng)以及PURE體系；之后介紹了CFPS 系統(tǒng)的不同反應(yīng)模式；接著介紹了CFPS 在不同領(lǐng)域的應(yīng)用；最后分析了當前CFPS系統(tǒng)遇到的挑戰(zhàn)以及對未來發(fā)展的展望。

1 CFPS系統(tǒng)及多樣性

為合成具有新的特性、結(jié)構(gòu)和功能的蛋白質(zhì)，應(yīng)在CFPS 體系中加入編碼該蛋白的DNA 或mRNA 模板，以及氨基酸和核苷酸等來啟動轉(zhuǎn)錄和翻譯過程。CFPS 系統(tǒng)利用微生物、植物或動物細胞的粗提物產(chǎn)生核糖體、氨酰-tRNA合成酶、翻譯起始和延伸因子、核糖體釋放因子等轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)折疊和能量代謝所必需的元素［3］（圖3）。無細胞蛋白質(zhì)合成啟動后通常會持續(xù)，直到其中一個底物（例如ATP、半胱氨酸等）耗盡或副產(chǎn)物積累量（例如無機磷酸鹽）達到抑制濃度。迄今為止，已經(jīng)開發(fā)了多種提取物的CFPS 系統(tǒng)，每種系統(tǒng)都有其各自的優(yōu)缺點，需根據(jù)要表達的目標蛋白質(zhì)，權(quán)衡考量其產(chǎn)量、成本和翻譯后修飾等要求選擇更合適的系統(tǒng)（表1）。

表1 不同提取物體系優(yōu)缺點對比Tab.1 Comparison of advantages and disadvantages of different extract systems

圖3 無細胞蛋白質(zhì)合成過程（無細胞體系的成分包括細胞提取物、輔助因子、DNA模板等，通過細胞提取物中的轉(zhuǎn)錄翻譯機器，無細胞體系在一定條件下孵育幾個小時即可產(chǎn)生目的蛋白）Fig.3 Cell-free protein synthesis process(The components of the cell-free system include cell extracts,cofactors,DNA templates,etc.Through the transcription and translation machinery in the cell extracts,the cell-free system can produce the target protein after incubating for several hours under designated conditions.)

1.1 微生物提取物

大腸桿菌作為最常用的模式菌株，因其生長速度快、易于培養(yǎng)、在分子生物學(xué)研究中應(yīng)用非常廣泛等原因成為CFPS 系統(tǒng)構(gòu)筑廣泛使用的底盤來源。1961 年報道了第1 個基于大腸桿菌的CFPS系統(tǒng)，經(jīng)過之后的不斷發(fā)展，拓展了其更廣泛的應(yīng)用。大腸桿菌系統(tǒng)能夠成為應(yīng)用最廣泛的CFPS 系統(tǒng)，除了更清晰的基因遺傳背景外，還因大腸桿菌提取物的制備簡單快速且成本效益高，適用于規(guī)?；鞍踪|(zhì)合成技術(shù)的發(fā)展［11］。大腸桿菌提取物來自于多種改造過的大腸桿菌細胞系，包括BL21（DE3）、 BL21 Star（DE3）、 Rosetta、 Rosetta2、C321、C321△A 等［12-13］，適用于不同種類蛋白質(zhì)的表達及應(yīng)用。例如，BL21（DE3）和BL21 Star（DE3）含有rne131 基因突變體，能夠增強mRNA的穩(wěn)定性，從而有效提高蛋白表達能力。Rosetta系列菌株來源于BL21系列宿主菌，Rosetta2（DE3）來源于Rosetta（DE3），該菌株含有pRARE2 質(zhì)粒，除了能夠提供原Rosetta（DE3）宿主菌含有的AUA、AGG、AGA、CUA、CCC 和GGA 6 個稀有密碼子的tRNA 外，還提供了第7 個稀有密碼子CGG 的tRNA。這兩種菌株主要適用于pET 系列載體，及其他T7 啟動子系列載體。C321 是對終止密碼子進行調(diào)整的菌株，C321△A 進一步刪除了釋放因子RF1，主要用于基于終止密碼子手段的非天然氨基酸嵌入。為進一步提升蛋白質(zhì)產(chǎn)量，研究人員已對小型或規(guī)?；竽c桿菌提取物制備方法進行了優(yōu)化。Kwon 和Jewett［12］開發(fā)了一種基于大腸桿菌提取物的快速、穩(wěn)健和高通量的超聲提取方法，使蛋白產(chǎn)量提升至1 mg/mL。在此基礎(chǔ)上， Karig等［14］通過利用糖醇海藻糖（一種簡單、低成本的露天干燥步驟，以及干燥過程中反應(yīng)組分的策略性分離）實現(xiàn)了細胞提取物在高溫下前所未有的長期穩(wěn)定性。合成的CFPS 經(jīng)冷凍干燥處理，在室溫下依舊可以保持活性，從而應(yīng)用于便攜式生物制造、紙基生物傳感器的生產(chǎn)［15］。此外，陳鑫杰等［16］的研究表明，在CFPS 系統(tǒng)中加入納米黏土模擬局部擁擠環(huán)境，可提升無細胞系統(tǒng)的蛋白表達。高偉等［17］在基于大腸桿菌粗提物的CFPS 系

統(tǒng)中成功合成了含有非天然氨基酸的綠色熒光蛋白。姜楠等［18］的研究表明無細胞系統(tǒng)中Mg2+濃度是影響蛋白質(zhì)表達的關(guān)鍵因素。然而，在大腸桿菌CFPS 系統(tǒng)中，缺乏翻譯后修飾系統(tǒng)、內(nèi)源膜結(jié)構(gòu)和有效的分子伴侶，使其合成的真核蛋白具有局限性，因此需開發(fā)其他提取物系統(tǒng)。

釀酒酵母作為重要的模式生物和微生物細胞工廠，已廣泛用于代謝工程、系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)研究［19］。19 世紀70 年代開發(fā)了基于釀酒酵母的酵母提取物，因其易于制備培養(yǎng)，被廣泛用作模型生物，是真核CFPS 系統(tǒng)制備的重要底盤［20］。然而，基于酵母提取物的CFPS平臺蛋白質(zhì)產(chǎn)量相對較低。最初酵母提取物僅用于研究真核生物的轉(zhuǎn)錄和翻譯機制［21］。在真核CFPS 平臺中，翻譯起始通常被認為是蛋白質(zhì)合成中的限速步驟［22］，因此初始的研究聚焦在酵母脫細胞提取物中翻譯起始、延伸和終止元件的優(yōu)化，以提高蛋白質(zhì)的表達量［23］。近年來，已經(jīng)開發(fā)出了多種用于提高酵母CFPS 平臺的蛋白質(zhì)產(chǎn)量的優(yōu)化策略，如酵母提取物的制備、模板優(yōu)化、底物補充和副產(chǎn)物去除等。研究工作者開發(fā)了一種使用葡萄糖和磷酸鹽的新能源再生系統(tǒng)，使用該系統(tǒng)可生產(chǎn)3.64 μg/mL熒光素酶，與磷酸肌酸和肌酸激酶系統(tǒng)相比蛋白質(zhì)產(chǎn)量提高了16%［24］。酵母提取物平臺的優(yōu)點是裂解液制備和翻譯后修飾簡單、快速，可以合成難以在體外合成的病毒樣顆粒和醫(yī)藥蛋白質(zhì)。Wang等［25］開發(fā)了用于體外翻譯人乳頭瘤病毒58（HPV58）L1 mRNA 的無細胞酵母系統(tǒng)，該系統(tǒng)是生產(chǎn)HPVL1 蛋白的潛在工具。Challise等［26］利用基于酵母提取物的CFPS 系統(tǒng)，在24 h內(nèi)生產(chǎn)具有生物活性的促紅細胞生成素?；诮湍柑崛∥锏腃FPS 平臺具有生產(chǎn)重要醫(yī)學(xué)價值的蛋白質(zhì)的潛力。

細菌種類繁多，除了大腸桿菌，其他細菌也已成為CFPS 平臺的重要底盤。作為一種模式生物，革蘭氏陰性菌中的惡臭假單胞菌已被廣泛用于生物燃料、重組抗體片段和天然產(chǎn)物的實驗室研究和工業(yè)化生產(chǎn)。Jewett 實驗室［27］開發(fā)和優(yōu)化了惡臭假單胞菌CFPS 平臺，能夠在4 h 內(nèi)合成大約200 μg/mL 的報告蛋白。Freemont 實驗室［28］嘗試了巨大芽孢桿菌的CFPS 平臺構(gòu)建，這是一種大型革蘭氏陽性細菌，具有生物技術(shù)應(yīng)用潛力，包括生產(chǎn)青霉素G 酰胺酶、β-淀粉酶和維生素B12等，目前該CFPS 平臺被用于遺傳元件的原型設(shè)計，蛋白質(zhì)產(chǎn)量大約為70 μg/mL。Freemont 實驗室［29］還構(gòu)建了1 種基于芽孢桿菌WB800N 的CFPS 平臺，能夠表達0.8 μmol/L GFPmut3b，反應(yīng)可持續(xù)幾個小時。除釀酒酵母外，其他真菌細胞如畢赤酵母已投入CFPS 使用。畢赤酵母是學(xué)術(shù)界和生物制藥行業(yè)中流行的重組蛋白表達宿主，可以合成復(fù)雜的治療性蛋白質(zhì)［30］。最近開發(fā)的新型酵母CFPS系統(tǒng)，通過菌株工程設(shè)計和調(diào)節(jié)，與野生型菌株相比重組蛋白的產(chǎn)量增加了3倍，人血清白蛋白的產(chǎn)量可達到48.1 μg/mL［31］。此外，其他非模式微生物已被用于各種新的CFPS 平臺構(gòu)建，比如古細菌，其中研究較多的為嗜熱古細菌，可將其制備成細胞提取物，用于研究不同抗生素對古細菌翻譯機制的影響?；诠偶毦毎崛∥锏腃FPS 系統(tǒng)有望應(yīng)用于熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)的合成，高溫條件下可能有利于減少基因二級結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的翻譯抑制。

1.2 植物提取物

植物細胞提取物研究最多的是小麥胚芽系統(tǒng)，該系統(tǒng)在真核無細胞蛋白表達方法中具有最優(yōu)的翻譯效率和產(chǎn)量。早在1964 年，Marcus 和Feeley［32］就開發(fā)了第1 個小麥胚芽無細胞翻譯系統(tǒng)。1973 年Roberts 和Paterson［33］確立了商業(yè)化小麥胚芽CFPS系統(tǒng)中煙草花葉病毒RNA的有效翻譯機制。與大腸桿菌相比，小麥胚芽提取物的制備過程需要去除各種抑制酶使得流程更加復(fù)雜。Madin 等［34］通過去除小麥胚芽中的胚乳和抑制劑等，以獲得高活性的無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)。Endo小組［35］基于洗滌分選獲得的小麥胚芽，開發(fā)了一種高產(chǎn)、持久的小麥胚芽無細胞系統(tǒng)，通過穩(wěn)定化mRNA，在1 mL 反應(yīng)體積中合成了高達10 mg的綠色熒光蛋白。

與其他CFPS 系統(tǒng)（例如大腸桿菌）相比，小麥胚芽系統(tǒng)在蛋白質(zhì)表達方面具有多個優(yōu)點，包括蛋白質(zhì)可溶性的增強和毒性蛋白質(zhì)的表達［36］。由于這些優(yōu)點，小麥胚芽系統(tǒng)已被用于生產(chǎn)特異性單克隆抗體，探究病毒-宿主蛋白相互作用機制［37-38］，合成瘧疾疫苗［39］，合成流感病毒全長血凝素和神經(jīng)氨酸酶蛋白［40］，合成膜蛋白細胞色素b5 復(fù)合物［41］。小麥胚芽系統(tǒng)作為先進的真核系統(tǒng)之一，已廣泛用于蛋白質(zhì)篩選、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、生物醫(yī)藥合成等方面。

除小麥胚芽細胞外，研究人員對基于煙草BY-2 和水稻細胞的CFPS 系統(tǒng)也進行了研究。小麥胚芽提取物制備過程需4～5 d，而煙草細胞僅需4～5 h 便可獲得高活性提取物。有研究表明煙草提取物CFPS 系統(tǒng)不僅有利于合成翻譯后修飾蛋白質(zhì)，還有助于糖基化和二硫鍵形成［42］?；谒居鷤M織提取物的無細胞系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，通過強化翻譯元件或分子伴侶、敲除翻譯抑制蛋白（如核酸酶和蛋白酶）等，可以提高水稻愈傷組織無細胞（RCE）系統(tǒng)的蛋白質(zhì)合成能力。

1.3 動物細胞提取物

動物細胞提取物主要包括兔網(wǎng)織紅細胞提取物（RRL）、中國倉鼠卵巢（CHO）細胞提取物以及昆蟲細胞提取物。動物細胞提取物的CFPS 系統(tǒng)，其顯著特性是具備翻譯后修飾功能，有利于真核來源蛋白質(zhì)的合成［43］。昆蟲細胞CFPS平臺可用于生產(chǎn)細胞毒性蛋白質(zhì)，可通過非天然氨基酸嵌入實現(xiàn)對蛋白質(zhì)熒光標記［44］。

RRL 是20 世紀50 年代就成功構(gòu)建的哺乳動物無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)［45］。RRL 雖然易于制備，但是局限性之一是蛋白質(zhì)產(chǎn)量低。目前已提出幾種用于增強蛋白質(zhì)的合成的研究策略，例如在翻譯系統(tǒng)中添加內(nèi)部核糖體結(jié)合位點（IRES）提升蛋白質(zhì)表達［46］，或通過減少ATP 能量消耗使核糖體活性和蛋白質(zhì)產(chǎn)量最大化［47］。RRL 系統(tǒng)可用于Sindbis 病毒蛋白合成［48］；還可以通過將無核糖體的RRL 與人核糖體和體外轉(zhuǎn)錄的報告基因重新組裝來評估核糖體的活性［49］，有助于表征癌癥中的核糖體功能；此外RRL 系統(tǒng)也廣泛用于蛋白質(zhì)-分子相互作用研究、篩選技術(shù)和展示技術(shù)。

CHO 細胞屬于哺乳動物細胞，具有源自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的翻譯活性微粒體結(jié)構(gòu)，因此適合合成具有適當折疊和翻譯后修飾的生物活性蛋白［50］。近70%的治療性蛋白質(zhì)是通過CHO 細胞合成［51］，但是翻譯起始的限制，使基于CHO細胞的CFPS系統(tǒng)的蛋白質(zhì)產(chǎn)量較低。研究表明，基于CHO 細胞提取物的CFPS 系統(tǒng)因為待表達基因mRNA 的5′非翻譯區(qū)中的IRES 元件能夠以不依賴帽的方式啟動翻譯，使來自板球麻痹病毒（CrPV）基因組的基因間區(qū)域（IGR） 的IRES 顯 示 出 最 有 效 的 翻 譯［52］。Thoring 等［53］通過將包含微粒體組分的CHO 無細胞系統(tǒng)與連續(xù)交換無細胞反應(yīng)（CECF）系統(tǒng)結(jié)合使用，可合成高達980 μg/mL的膜蛋白。CHO細胞常用于單克隆抗體（mAb）的合成［54］，Martin 及其同事［55］通過調(diào)節(jié)氧化環(huán)境從而調(diào)節(jié)抗體重鏈和輕鏈質(zhì)粒的表達來優(yōu)化CHO細胞CFPS系統(tǒng)，可合成具有生物學(xué)活性的完整mAb（>100 mg/L）。總之，基于CHO 細胞提取物的無細胞系統(tǒng)可被廣泛用于生產(chǎn)生物醫(yī)藥蛋白，特別是“難表達”蛋白質(zhì)的合成。

昆蟲提取物主要是指草地貪夜蛾（Sf21）的提取物，它是體內(nèi)昆蟲細胞合成蛋白質(zhì)的有效手段之一。大腸桿菌和小麥胚芽系統(tǒng)產(chǎn)量雖高，但它們在合成復(fù)雜蛋白質(zhì)和需要翻譯后修飾和共翻譯的蛋白質(zhì)方面仍存在局限性［56］。昆蟲提取物系統(tǒng)可以修飾真核蛋白質(zhì)，例如蛋白質(zhì)N-肉豆蔻?；?7］、泛素化［58］、二硫鍵［59］、異戊二烯化［60］等。近年來，昆蟲細胞CFPS 系統(tǒng)獲得了進一步優(yōu)化。例如衍生自Sf21 細胞的無細胞翻譯/糖基化系統(tǒng)，提取物借助Mini-Bomb 細胞破裂室通過氮氣壓力處理制備，可穩(wěn)定地保留翻譯和翻譯后修飾組分。然而通過高壓氮來制備昆蟲細胞提取物難以操作，為解決這一問題，另一粉紋夜蛾昆蟲無細胞系統(tǒng)采用在提取緩沖液中凍融昆蟲細胞的方法便于操作、降低成本，并通過進一步優(yōu)化反應(yīng)成分濃度及5′-非翻譯區(qū)序列以增加外源蛋白質(zhì)的產(chǎn)量［61］。最近，Quast等［62］通過使用CECF 反應(yīng)模式，在含微粒體Sf21 無細胞系統(tǒng)中結(jié)合CrPV-IRES 介導(dǎo)的翻譯，延長反應(yīng)的時間，使蛋白質(zhì)產(chǎn)量提高100倍以上，達到285μg/mL；該系統(tǒng)的主要特點是：其固有的真核翻譯和折疊機制可以與具有翻譯活性的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)衍生微粒體相結(jié)合，從而形成正確折疊的功能蛋白質(zhì)。

除上述3種提取物外，基于人類細胞系的細胞提取物也正在被研究和使用，如HEK293 細胞和HeLa 細胞。人類細胞系無細胞系統(tǒng)的特征與基于CHO 的無細胞系統(tǒng)相似，可以獲得不同類型的翻譯后修飾蛋白。人類細胞系CFPS 系統(tǒng)的一個主要優(yōu)勢是天然密碼子的使用，從而促進了高分子量人類蛋白質(zhì)的合成。此外，基于人類細胞系提取物CFPS 系統(tǒng)還適合于合成完整的病毒或病毒樣顆粒。

1.4 PURE體系

無細胞蛋白質(zhì)合成（CFPS）具有許多優(yōu)勢，包括更好地控制系統(tǒng)組分和配比。使用重組元素蛋白質(zhì)合成（PURE）體系的CFPS 系統(tǒng)可強化系統(tǒng)組分控制，該PURE系統(tǒng)的開發(fā)理念是僅使用轉(zhuǎn)錄和翻譯元件的純化組分進行蛋白質(zhì)的體外合成。使用PURE系統(tǒng)，所有元素都是已知的，無核酸酶和蛋白酶，并且可以優(yōu)化每種元素的濃度以實現(xiàn)蛋白質(zhì)最大程度的表達。這些重組元素包括起始因子（IF1、IF2、IF3），延伸因子（EF-Tu、EFTs、EF-G），釋放因子（RF1、RF2、RF3），核糖體再循環(huán)因子，20 個氨酰-tRNA 合成酶，甲硫氨酸t(yī)RNA 甲酰基轉(zhuǎn)移酶和焦磷酸酶。這些重組組分與從大腸桿菌分離的核糖體、tRNA、必需的NTP和氨基酸、ATP 生成催化模塊和重組T7 RNA 聚合酶（RNAP）結(jié)合在一起，使用DNA 模板合成蛋白質(zhì)［63］。此外，可在反應(yīng)混合物中加入伴侶、熱休克蛋白和其他因子，以保持蛋白質(zhì)的可溶性并協(xié)助蛋白質(zhì)折疊［64］。

與原始細胞提取物系統(tǒng)相比，PURE 體系是通過重建轉(zhuǎn)錄和翻譯過程來實現(xiàn)的。PURE 體系完全定義了每個體系組分的類型和濃度，并最終將組分的數(shù)量最小化。因此，通過調(diào)節(jié)反應(yīng)組分可以方便地對反應(yīng)條件進行微調(diào)，在生化研究和蛋白質(zhì)工程中具有很大的優(yōu)勢［10］。此外，PURE體系不存在核糖核酸酶和蛋白酶，因此，mRNA 可以作為翻譯模板在體外合成在體內(nèi)會快速降解的蛋白質(zhì)［64］。上述優(yōu)點使PURE 體系成為高度通用的蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)，有利于核糖核酸/蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成、易于降解的蛋白質(zhì)或肽的合成、高通量篩選分析等［64-66］。然而，與細胞提取物系統(tǒng)相比，PURE 體系生產(chǎn)過程復(fù)雜且成本昂貴，需要對多種蛋白質(zhì)進行大規(guī)模蛋白純化，可以通過商業(yè)途徑獲得（PURExpress，New England Biolabs），但是高成本限制了其使用。目前已經(jīng)有研究者試圖降低其制造成本，比如Lavickova 和Maerkl［67］開發(fā)了一種簡單且成本較低的PURE系統(tǒng)，該系統(tǒng)使用單個燒瓶共培養(yǎng)并誘導(dǎo)大腸桿菌的36 個蛋白質(zhì)的全部單獨表達，并一次性進行了純化。

2 CFPS系統(tǒng)的反應(yīng)模式

傳統(tǒng)的無細胞反應(yīng)模式包括兩類：批式反應(yīng)和連續(xù)交換反應(yīng)系統(tǒng)［圖4（a）、（b）］。批式反應(yīng)裝置簡單，較易實現(xiàn)，所有的無細胞反應(yīng)組分添加到一個試管中，可以快速合成目標蛋白質(zhì)［8］。批式反應(yīng)的這個特點使其適合快速表達蛋白質(zhì)、自動化合成和篩選應(yīng)用，特別是與PCR 產(chǎn)生的線性DNA 模板相結(jié)合快速合成蛋白質(zhì)［68］。然而這種反應(yīng)模式存在局限性，能量和氨基酸的消耗以及副產(chǎn)物的積累，特別是副產(chǎn)物對體外轉(zhuǎn)錄/翻譯有抑制作用，使得產(chǎn)率低下［69］。為克服該缺點，設(shè)計了連續(xù)交換無細胞反應(yīng)系統(tǒng)。該系統(tǒng)需要2 個隔室，由半透性透析膜隔開，CFPS 反應(yīng)通過半透膜與富含反應(yīng)物的進料溶液隔開，這樣新反應(yīng)物進入反應(yīng)與副產(chǎn)物移出同時進行，而蛋白質(zhì)產(chǎn)物保留在反應(yīng)室中。使用該技術(shù)的無細胞表達反應(yīng)可以保持數(shù)十小時，從而提高蛋白質(zhì)的產(chǎn)率［70］。因此，連續(xù)交換無細胞系統(tǒng)有益于中國倉鼠卵巢、酵母和兔網(wǎng)織紅細胞等低產(chǎn)量平臺蛋白質(zhì)產(chǎn)率的提高。

近年來，其他新興的反應(yīng)模式得到研究和應(yīng)用，如套管模式（tube-in-tube）［圖4（c）］和數(shù)字微流控（DMF）［圖4（d）］模式。套管反應(yīng)器使用半透膜內(nèi)管（特氟隆AF 2400）和聚四氟乙烯外管組成，其內(nèi)管具有高氣體滲透性且不滲透液體，可以允許氣體在不直接接觸液體的情況下從氣泵連續(xù)供應(yīng)到內(nèi)管的液體流中，由此可顯著提高氧的傳質(zhì)速率，加快ATP 再生，與批式反應(yīng)模式相比表達速率更快，有望成為一種靈活的按需蛋白質(zhì)合成手段。DMF 模式通過計算機編程來控制Opendrop 板，使不同無細胞組分液滴從接地電極移動至驅(qū)動電極，從而使各組分聚合進而進行無細胞反應(yīng)。DMF 技術(shù)可控制單個液滴的移動、混合、分離等，具有良好的交互性和靈活性，適用于復(fù)雜的液體處理方案，以進行高效的生物篩選和蛋白質(zhì)合成。

圖4 CFPS反應(yīng)模式（a）批式模式。所有反應(yīng)成分添加到一個管中進行，操作簡單、便捷。（b）連續(xù)交換。通過半透膜，營養(yǎng)物質(zhì)和產(chǎn)生的代謝副產(chǎn)物分隔開，克服了代謝產(chǎn)物對體系的抑制作用。（c）套管。氣體通過氣泵不斷地泵入到內(nèi)管中，顯著提高氧的傳遞效率，提高產(chǎn)量。（d）數(shù)字微流控。數(shù)字微流控技術(shù)可控制單個液滴的移動、混合、分離等，具有良好的交互性和靈活性Fig.4 Modes for CFPS operation(a)Batch mode.All reaction components are added to one tube,which is simple and convenient for operating.(b)Continuous exchange.Through the semi-permeable membrane, nutrients are separated from the metabolic by-products, which overcomes the inhibitory effect of the metabolic products on the reaction.(c) Tube in tube.The gas is continuously pumped into the inner tube through the air pump, which significantly improves the efficiency of oxygen transfer and increases the output.(d) Digital microfluidic technology.It can control the movement, mixing, and separation of a single droplet,with good interactivity and flexibility.

此外，冷凍干燥（freeze-dried）技術(shù)可以保障細胞提取物在環(huán)境溫度中長期儲存。通常細胞提取物儲存在?80 ℃左右，如在室溫下僅儲存1 周其活性就會下降50%，1 個月后所有活性都會喪失。相比之下，凍干提取物在室溫下保存90 d 后仍然能保持約20%的活性。重要的是，冷凍干燥過程不會對反應(yīng)產(chǎn)率產(chǎn)生負面影響，在冷凍干燥后直接進行CFPS 反應(yīng)可以獲得與水相反應(yīng)相同的產(chǎn)率［71］。更重要的是，冷凍干燥無細胞反應(yīng)系統(tǒng)可以克服冷鏈運輸問題，以實現(xiàn)按需生物診斷傳感、偏遠地區(qū)的按需藥物合成等［72］。

3 無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的應(yīng)用

CFPS 技術(shù)已實現(xiàn)了廉價且快速的重組蛋白質(zhì)表達，其靈活性、可控性以及操作便捷等優(yōu)勢迅速擴大其用途并逐步商業(yè)化。目前，各種原核和真核生物的無細胞平臺已經(jīng)投入使用。在本節(jié)中，我們將重點介紹CFPS 系統(tǒng)在基因電路、蛋白質(zhì)工程和人工生命體系構(gòu)建中的應(yīng)用及所取得的研究進展。

3.1 基因電路

生命有機體進化出復(fù)雜的基因代謝網(wǎng)絡(luò)并與環(huán)境相互作用，由于合成生物學(xué)的迅速發(fā)展，各種模塊化的基因元件已經(jīng)從這些網(wǎng)絡(luò)中鑒定出來，并被用于構(gòu)建基因電路，包括撥動開關(guān)、振蕩器、反饋回路和布爾邏輯門［73］。相比體內(nèi)基因電路設(shè)計，使用CFPS 系統(tǒng)對基因電路進行建模設(shè)計具備許多優(yōu)點：①基因元件和聚合酶濃度可控；②可定量且快速的報告測量；③可高通量方式評估更大的參數(shù)空間；④允許加速原型設(shè)計，更易對基因電路進行真正的模塊化。基因電路快捷、高效，但在構(gòu)建過程中，仍需要注意DNA 模板在長時間的操作中的遺傳穩(wěn)定性問題。

3.1.1 原型設(shè)計（圖5）

圖5 基因電路原型設(shè)計（轉(zhuǎn)錄單位由單獨質(zhì)?；蚓€性DNA模板進行編碼，可以作為邏輯門的類似物，然后通過無細胞基因表達反應(yīng)在體外執(zhí)行分子計算或遺傳程序，以預(yù)測電路在電路在細胞中的功能）Fig.5 Prototype designs for genetic circuits(The transcription unit is encoded by a single plasmid or linear DNA template,which can be used as an analog of a logic gate,and then molecular calculations or genetic programs are performed in vitro through a cell-free gene expression reaction to predict the function of the circuit in the cell.)

除探測單個遺傳元件功能外，基因電路系統(tǒng)還可以用來分析遺傳元件在遺傳控制網(wǎng)絡(luò)或“電路”中如何共同發(fā)揮作用。利用無細胞策略已經(jīng)組裝和原型設(shè)計了許多基因電路，包括由正交聚合酶或Sigma 因子組成的級聯(lián)電路［74］、溯源性調(diào)制器［75］以及RNA 和/或蛋白質(zhì)介導(dǎo)的單輸入模塊、前饋循環(huán)和負反饋調(diào)節(jié)［76］、環(huán)形振蕩器［77］等。Niederholtmeyer等設(shè)計了新型3、4和5基因環(huán)形架構(gòu)，可實現(xiàn)電路元件的表征和完整基因網(wǎng)絡(luò)的快速分析［77］。因此，使用無細胞系統(tǒng)替代正向工程范式可以準確地捕獲細胞行為［78］。

3.1.2 生物傳感

除了原型設(shè)計，生物傳感器設(shè)計是基因電路的另一重要應(yīng)用，其廣泛應(yīng)用于環(huán)境檢測、疾病診斷等，具有靈敏度高、反應(yīng)速度快的特點。目前生物傳感器的類型主要包括酶催化法、酶聯(lián)免疫法、全細胞傳感器、金屬納米顆粒傳感器和微流控生物芯片傳感器等［79-81］。無細胞生物傳感器具有與全細胞生物傳感器相同的性能，但無細胞生物傳感器穩(wěn)定性更強且不存在生物安全問題，在醫(yī)療診斷和合成生物學(xué)方面已得到了廣泛應(yīng)用。Wen 等［81］優(yōu)化了CFPS 中的模塊化DNA 編碼生物傳感器（LasR 轉(zhuǎn)錄因子和啟動子），用于檢測人痰標本中銅綠假單胞菌感染的細菌標志物。Pellinen等［82］開發(fā)了一種利用MerR 作為識別元件來檢測汞離子的無細胞生物傳感器，與全細胞生物傳感器相比（2～200 nmol/L），無細胞生物傳感器提供了更寬的檢測范圍（1～10 000 nmol/L）。在張鵬等［83］針對光傳感的研究中，藍光調(diào)控的YF1/FixJ雙組分系統(tǒng)被引入到大腸桿菌無細胞系統(tǒng)中來控制蛋白質(zhì)的合成。

3.1.3 代謝工程

在過去的10 年時間里，代謝工程和合成生物學(xué)的快速發(fā)展推動了利用微生物細胞工廠生產(chǎn)化學(xué)品的應(yīng)用研究。然而，由于細胞代謝的復(fù)雜性，優(yōu)化代謝途徑以獲得最大產(chǎn)量是代謝工程面臨的一個巨大挑戰(zhàn)［84］。CFPS 為解決該生物制造的挑戰(zhàn)性問題提供了可行方案，由此發(fā)展出來一個新興的生物技術(shù)手段：無細胞代謝工程（cell-free metabolic engineering，CFME）。目前已經(jīng)有人利用CFME 合成產(chǎn)物，例如李健課題組［85］利用CFME 生產(chǎn)纈氨霉素，產(chǎn)量可達30 mg/L。CFME優(yōu)化代謝途徑主要通過4個方面實現(xiàn)：優(yōu)化細胞提取物的制備、能量板塊的優(yōu)化和設(shè)計、減少副產(chǎn)物的累積以及加快代謝工程的設(shè)計-構(gòu)建-測試（DBT）周期。

激活細胞提取物中蛋白質(zhì)合成能力在優(yōu)化代謝途徑中至關(guān)重要。通過優(yōu)化細胞提取物的制備，可以激活無細胞合成系統(tǒng)的中樞代謝以此給無細胞蛋白質(zhì)合成供應(yīng)能量，而不是由磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）等昂貴的化合物來供應(yīng)能量，這樣可大大降低成本［86］。Jewett 等［87］研究在反應(yīng)中激活中樞代謝中的氧化磷酸化過程，蛋白質(zhì)合成在2 h內(nèi)可達到1.2 mg/mL。在代謝過程中，副產(chǎn)物的累積對合成影響較大，蛋白質(zhì)合成過程中ATP 的水解副產(chǎn)物（無機磷）的累積會降低無細胞反應(yīng)速率，同時會螯合反應(yīng)必需的鎂離子，抑制反應(yīng)?？紤]到這種抑制機制，Caschera 等［88］設(shè)計了含有麥芽糖和麥芽糖糊精的無細胞合成系統(tǒng)，可有效回收無機磷酸鹽并通過糖酵解重新生成ATP。在優(yōu)化代謝途徑的過程中，迭代DBT 周期比較費時。最初CFME 使用純化的酶組裝代謝途徑，但通過細胞表達和純化獲取每一條代謝途徑的酶費時費力。為加快代謝工程的DBT 周期，Jewett 小組［89］構(gòu)建了一種新的CFME 框架，在基于細胞提取物的CFPS 系統(tǒng)中通過添加DNA 模板原位表達不同代謝途徑的酶，以加速DBT 循環(huán)。后續(xù)工作需要將數(shù)學(xué)模型與CFPS 相結(jié)合，進一步加速合成生物學(xué)設(shè)計。

3.2 蛋白質(zhì)工程

圖6示出了無細胞蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用。

圖6 無細胞蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用（無細胞蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用主要包括：膜蛋白、類病毒顆粒、翻譯后修飾、非天然氨基酸的嵌入和蛋白質(zhì)進化）Fig.6 Applications of cell-free protein engineering(The applications of cell-free protein engineering mainly include membrane proteins,virus-like particles,post-translational modification,unnatural amino acid intercalation,and protein evolution)

3.2.1 膜蛋白

膜蛋白在生物體的許多生命活動中起著非常重要的作用，如細胞的增殖和分化、能量轉(zhuǎn)換、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及物質(zhì)運輸?shù)取Ｄさ鞍渍寄壳八幬锇械鞍椎?0%以上，約占細胞蛋白質(zhì)組的30%。由于其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)、疏水跨膜區(qū)域、對宿主的毒性、低效的折疊步驟，使得它們在胞內(nèi)難以大量表達［90］。CFPS 系統(tǒng)由于反應(yīng)條件可控和高的毒性耐受性等特點，已發(fā)展成為重要的膜蛋白質(zhì)表達手段。傳統(tǒng)的手段是在合成系統(tǒng)中添加脂質(zhì)、洗滌劑膠束等助溶膜蛋白質(zhì)，但存在蛋白質(zhì)構(gòu)象改變的問題。為有效解決上述問題，采取的手段包括雙酚增溶［91］、利用納米脂蛋白顆粒（NLP）（或稱為“納米盤”）等［92］，而這些技術(shù)很容易和CFPS系統(tǒng)相結(jié)合。其中以NLP 為代表的人工膜結(jié)構(gòu)可以使膜蛋白質(zhì)穩(wěn)定在原生狀態(tài)，已經(jīng)成為膜蛋白表達的重要手段［93］。將NLP 材料與CFPS 系統(tǒng)相結(jié)合，已成功表達出一些GPCR蛋白質(zhì)，包括細菌視紫紅質(zhì)（BR）、人神經(jīng)激肽（NK1R）、人β 腎上腺素能（β2AR）和人多巴胺（DRD1R）受體等［94-95］。ERBB 蛋白家族是癌癥治療的藥物靶點，通過無細胞表達和NLP 技術(shù)的結(jié)合，成功表達合成了全長的ERBB受體，對推動靶點藥物的發(fā)現(xiàn)具有重要意義［96］。雖然NLPs提供了一個高度靈活的平臺來輔助功能性膜蛋白正確折疊，但需要注意的是膜蛋白-NLP復(fù)合物在形成后可能會穩(wěn)定數(shù)天，但這種復(fù)合物在溶液中的長期穩(wěn)定性仍然存在問題。冷凍干燥是NLP 復(fù)合物長期保存的一種可能方式，但還需進一步研究。

3.2.2 類病毒顆粒

類病毒顆粒（virus-like particles，VLPs）是缺乏基因組材料的病毒衣殼，它和病毒結(jié)構(gòu)相似，但因其不具有病毒基因所以無感染性，以及表面可多價展示抗原從而增強免疫原性的特點，已被廣泛應(yīng)用于疫苗、藥物遞送、顯像劑、生物催化、納米電子學(xué)應(yīng)用等研究［97］。雖然胞內(nèi)合成類病毒顆粒已研究多年，但仍存在產(chǎn)量低、穩(wěn)定性較差、表達哺乳動物病毒蛋白復(fù)雜、純化困難等問題［98］。相比之下，CFPS 系統(tǒng)具有顯著優(yōu)勢，包括通過有效調(diào)控反應(yīng)環(huán)境條件促進顆粒組裝［99］、操縱氧化還原環(huán)境生成穩(wěn)定二硫鍵、通過正交翻譯系統(tǒng)與非標準氨基酸相結(jié)合等方式可以實現(xiàn)類病毒顆粒的功能化修飾［100］，從而實現(xiàn)VLP 高效、穩(wěn)定性合成。目前多種CFPS 平臺已被用于生產(chǎn)不同的VLPs，包括大腸桿菌、HeLa、酵母和兔網(wǎng)織紅細胞CFPS 系統(tǒng)［8］。從大腸桿菌和RRL 提取物CFPS系統(tǒng)中已經(jīng)成功合成乙型肝炎病毒核心抗原VLP［101］；人 乳 頭 瘤 病 毒L1 VLP 已 在 釀 酒 酵 母CFPS系統(tǒng)中成功合成［102］；基于HeLa細胞的CFPS平臺已被用于脊髓灰質(zhì)炎病毒的合成［89］；兔網(wǎng)織紅細胞CFPS 也用于HIV Gag 蛋白病毒組裝［103］；大腸桿菌CFPS 平臺還可合成全功能活性的T7 和T4噬菌體［104］。

3.2.3 翻譯后修飾

蛋白質(zhì)翻譯后修飾（post-translational modification，PTM），可以極大影響蛋白質(zhì)的折疊、活性和穩(wěn)定性，在多種細胞功能和生物過程中發(fā)揮著重要作用［105］。對PTM 效應(yīng)進行系統(tǒng)研究的關(guān)鍵是獲得具有明確基團修飾的重組蛋白質(zhì)，這在異源宿主中通常是很難實現(xiàn)的。相比之下，CFPS 系統(tǒng)的靈活特性允許其組分的加/減，為蛋白質(zhì)折疊和精準化修飾提供了可控環(huán)境。目前已發(fā)現(xiàn)200多種不同的官能團修飾類型，常見的PTM 形式有糖基化、磷酸化、甲基化、乙?；⒎核鼗?。在這里著重介紹糖基化和磷酸化這兩大主要的PTM 修飾在CFPS中的研究和進展。

蛋白質(zhì)糖基化修飾發(fā)生在約50%的真核蛋白質(zhì)上，大多數(shù)臨床前和FDA 批準的生物醫(yī)藥上都具備糖基化修飾，深刻影響蛋白質(zhì)折疊、穩(wěn)定性和免疫原性。但由于細胞代謝的復(fù)雜性和干擾，在細胞中構(gòu)建和測試確定糖基化修飾的糖蛋白仍然具有挑戰(zhàn)性［106］。在無細胞糖基化系統(tǒng)GlycoPRIME 中，糖基化途徑通過混合和匹配糖基轉(zhuǎn)移酶、將結(jié)構(gòu)明確的糖片段修飾在蛋白質(zhì)靶標上，已成功合成含有最小唾液酸修飾的抗體［107］；并在無細胞系統(tǒng)中成功構(gòu)建多個天冬酰胺N-糖基化途徑，實現(xiàn)了約1 g/L的糖基化蛋白質(zhì)合成［108］。

磷酸化修飾是繼糖基化修飾后的第二大類蛋白質(zhì)修飾，然而由于技術(shù)限制，無法以高純度和高產(chǎn)量生產(chǎn)具有特定磷酸化狀態(tài)的磷酸化蛋白，使用CFPS 平臺可以顯著提高磷蛋白合成的產(chǎn)量和產(chǎn)率。使用基于基因重編碼大腸桿菌提取物的CFPS 系統(tǒng)，可特異性將磷酸絲氨酸嵌入人促分裂原激活的ERK 激活激酶1（MEK1），高量合成磷酸化的活性MEK1［109］，其產(chǎn)量遠高于胞內(nèi)合成系統(tǒng)［110］。

除了上述通過外源添加方式實現(xiàn)精準的PTM，另外已經(jīng)有多種類型CFPS 平臺利用提取物中存在的天然后修飾酶系進行蛋白質(zhì)翻譯后修飾。這使得中國倉鼠卵巢、HeLa和昆蟲等真核生物CFPS平臺非常適合這一應(yīng)用［111］。在兔網(wǎng)織紅細胞CFPS平臺上，已經(jīng)研究了各種PTM，包括糖基化、信號蛋白的裂解、預(yù)烯化和二硫鍵的形成［112］。昆蟲細胞CFPS 系統(tǒng)含有內(nèi)源性微粒體，允許信號肽切割、糖基化、磷酸化、N-肉豆蔻酰化、N-乙?；愇煜┗头核鼗?13］。值得注意的是，具有增強折疊活性的CFPS 系統(tǒng)也成功應(yīng)用于合成具有多個二硫鍵的活性蛋白質(zhì)，如纖溶酶原激活劑［114-115］、尿激酶蛋白酶［114-116］、各種抗體［117-119］、病毒樣顆粒［120］。此外，短小抗菌肽，例如富含半胱氨酸的陽離子β-防御素-2（HBD2），也可以利用CFPS 系統(tǒng)生產(chǎn)和正確折疊［121］。

3.2.4 非天然氨基酸嵌入

基于非天然氨基酸的蛋白質(zhì)合成是目前基礎(chǔ)和應(yīng)用科學(xué)研究的一個活躍領(lǐng)域。由于天然氨基酸側(cè)鏈功能基團的有限性，單靠20 種標準氨基酸已不能滿足基礎(chǔ)和應(yīng)用科學(xué)日益增長的需求］［122-123］。 利 用 改 造 過 的 正 交 翻 譯 系 統(tǒng)（orthogonal translation system，OTS）的氨酰tRNA合成酶和tRNA 可以引導(dǎo)具有特殊結(jié)構(gòu)或功能側(cè)鏈基團的非天然氨基酸（unnatural amino acid，UNAA）嵌入目標蛋白的特定位點，從而對合成蛋白的功能進行改造［124］。迄今已有超過150 種非天然氨基酸可以引入生物體內(nèi)，其中大多數(shù)非天然氨基酸是天然氨基酸的衍生物［125］。相比細胞體系，CFPS 具有以下幾種優(yōu)點：①無需考慮UNAA膜轉(zhuǎn)運等問題［126］，不受復(fù)雜的物質(zhì)代謝干擾，所有資源都用于目標蛋白的合成；②可以合成有毒且難以在細胞系統(tǒng)中表達的蛋白質(zhì)［127］；③提高合成效率、保真度，實現(xiàn)更廣泛的特異性［121］。到目前為止，通過CFPS 系統(tǒng)已經(jīng)將超過150 種UNAAs納入到多肽中［128］。

近幾年，UNAA 嵌入技術(shù)在CFPS 中已經(jīng)取得了突破性的進展。例如利用多聯(lián)密碼子手段突破了琥珀抑制只能單一嵌入的局限，允許將非天然氨基酸多次嵌入同一蛋白質(zhì)中。Neumann等［129］在體外翻譯系統(tǒng)中，通過四聯(lián)密碼子手段實現(xiàn)了將多個不同UNAA 結(jié)合到單一多肽中。此外，利用非天然堿基手段將UNAA 嵌入蛋白質(zhì)是該領(lǐng)域的前沿方向，如Zhang 等［130］將含有非天然堿基dNaM 和dTPT3 的DNA 在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄成兩個具有不同非天然密碼子的mRNAs 和具有同源非天然反義密碼子的tRNAs，在核糖體的有效解碼下成功將非天然氨基酸嵌入綠色熒光蛋白，這對遺傳信息的存儲以及創(chuàng)造新的生命形式具有重要意義。

非天然生物藥物蛋白在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域引起了極大的關(guān)注。在抗體-藥物偶聯(lián)物（antibody-drug conjugate，ADC）的開發(fā)中，CFPS 為抗體和抗癌藥物之間的穩(wěn)定連接提供了更有效的UNAA 嵌入和偶聯(lián)方法［131］。UNAA 的嵌入被用于研究功能性人表皮生長因子受體的配體非依賴性二聚化［132］。此外，由D-氨基酸組成的鏡像蛋白質(zhì)或肽是CFPS系統(tǒng)的另一個新興研究領(lǐng)域。在蛋白質(zhì)或多肽中引入D-氨基酸可以改變功能，已經(jīng)有研究工作者設(shè)計出與D-氨基酸兼容的新型核糖體翻譯系統(tǒng)［133］。研究人員還成功地將多達10個D-絲氨酸引入多肽中，成功表達了含有5 個D-氨基酸的環(huán)肽［134］。同時鏡像蛋白或多肽在藥理上展現(xiàn)出的特殊性也顯示出其潛在的應(yīng)用價值［135］。隨著UNAA嵌入平臺技術(shù)的發(fā)展，在分子成像、蛋白質(zhì)相互作用、生物防護、生物材料、治療性蛋白和具有新型結(jié)構(gòu)功能生物催化劑等方面展現(xiàn)出重要的研究價值［136］。但需要注意的是為提高UNAA 的精準嵌入，無細胞體系的添加順序不容忽視，一般先將OTS 組分提前混勻，然后加入無細胞體系，最后再添加細胞提取物。

3.2.5 蛋白質(zhì)進化

定向進化是在有機化學(xué)和生物技術(shù)應(yīng)用中廣泛使用的蛋白質(zhì)工程手段［137］。蛋白質(zhì)定向進化以相當快的方式模擬自然進化過程，一個由起始酶突變體組成的大型文庫在選擇壓力下經(jīng)過幾輪迭代誘變，進而選出最能實現(xiàn)預(yù)期功能的酶［138］。蛋白質(zhì)體外定向進化的第1步是獲得突變體庫，獲取突變的誘變方法包括隨機誘變、位點定向誘變和位點飽和誘變［139］。第2 步是結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)已有知識和計算工具對酶的特定功能和性質(zhì)進行選擇性篩選，從而定向選擇所需的非天然蛋白質(zhì)［140］。此類蛋白質(zhì)通常具有更高的活性、更強的穩(wěn)定性等優(yōu)良性能，具有重要的工業(yè)催化酶應(yīng)用價值。由于無細胞蛋白質(zhì)合成體系的開放性、可控性等，通過對酶進行靈活修飾，可以改善酶的特異性、活性、效率、分泌性和穩(wěn)定性等參數(shù)，從而提高合成和篩選效率。

近些年，蛋白質(zhì)定向進化已經(jīng)在新型蛋白質(zhì)的構(gòu)建以及改善酶性能方面取得了突破性進展。由于膜蛋白的毒性或特殊結(jié)構(gòu)性質(zhì)，膜蛋白的體內(nèi)定向進化一直極具挑戰(zhàn)性。脂質(zhì)體展示作為一種新的方法，能夠在體外定向進化有毒的整膜蛋白。該方法創(chuàng)建了巨型單層脂質(zhì)體，并將單分子DNA 表達模板與無細胞翻譯系統(tǒng)一起包裹，每個脂質(zhì)體具備單個變體的多個拷貝；反應(yīng)發(fā)生后，可將蛋白質(zhì)活性與熒光信號相關(guān)聯(lián)，通過流式細胞熒光分選技術(shù)（FACS）進行后續(xù)分選；應(yīng)用這種方法可進化出一種溶血素突變體，活性是野生型的30倍［141］。也可通過理性設(shè)計與定向進化相結(jié)合的方式進行突變庫創(chuàng)建和篩選，一個例子是通過定向進化優(yōu)化計算設(shè)計和篩選獲得的Kemp 消除酶突變體，反應(yīng)速度提高了6×108倍［142］。此外，將無細胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)整合到高通量篩選應(yīng)用中，可以實現(xiàn)多肽和蛋白質(zhì)的原位和按需表達。與現(xiàn)代微流控技術(shù)相結(jié)合，無細胞合成方法可以在短時間內(nèi)以最小的體積篩選、定向進化和選擇所需的生物分子［143］。如今，生物催化產(chǎn)業(yè)的研究重點是提高酶的活性、穩(wěn)定性、功能表達和細胞定位等，無細胞合成系統(tǒng)的參與節(jié)省了時間成本，并允許創(chuàng)建“更智能”的突變庫和更有效的篩選方法，為蛋白質(zhì)定向進化的發(fā)展提供了新的前景和突破點。

3.3 人工生命體系的構(gòu)建

3.3.1 噬菌體的合成

由于噬菌體對宿主的極端特異性，以及顯示出作為抗菌劑和細菌診斷的巨大醫(yī)學(xué)潛力，噬菌體目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于抗菌劑的研發(fā)、細菌診斷、疫苗研發(fā)、噬菌體聚合酶的合成以及用作遺傳可編程生物材料的支架等多個方面，并且在定向進化研究中發(fā)揮重要作用。然而，大多數(shù)噬菌體的基因組太大（>20 kb），很難在體外進行操作，而且對細菌宿主是致命的；體外轉(zhuǎn)錄翻譯無細胞表達系統(tǒng)，為噬菌體的合成和改造提供了更精確控制的可能性［3］。例如在活體噬菌體的改造方面，借助無細胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)，可成功合成T7、ΦX174等功能性噬菌體［144］。

3.3.2 人工細胞的構(gòu)筑

構(gòu)建具有生命基本特征的人工細胞是合成生物學(xué)領(lǐng)域的一大挑戰(zhàn)（圖7）。由于合成人工細胞需要涉及物理、化學(xué)、生物學(xué)等多種學(xué)科的專業(yè)知識，至今對其仍然沒有一個明確的定義。盡管生命系統(tǒng)具有高度的內(nèi)在復(fù)雜性，但一般認為具備5 個共同特征：區(qū)室化、生長分裂、信息處理、能量轉(zhuǎn)導(dǎo)和適應(yīng)性［145］。利用分子生物學(xué)工具和方法，自下而上將功能分子組裝成人工細胞，雖可實現(xiàn)基本的生命特征，但在實現(xiàn)自組裝、自我繁殖等方面面臨重大挑戰(zhàn)［146］。目前大量利用無細胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)模擬細胞結(jié)構(gòu)和特征的工作已經(jīng)開展，如分子擁擠、區(qū)室化、基因噪聲、網(wǎng)絡(luò)、動態(tài)行為和細胞通訊，致力于構(gòu)建更“完美”的人工細胞［147］。

圖7 人工細胞的構(gòu)建（分子擁擠、區(qū)室化、基因噪聲、網(wǎng)絡(luò)、動態(tài)行為和細胞通訊是維持一個細胞正常生命活動所必須的結(jié)構(gòu)和功能特征，能有效調(diào)控操作細胞的正常運行）Fig.7 Construction of artificial cells(Molecular crowding,compartmentalization,gene noise,networks,dynamic behaviors and cell communications are the structural and functional characteristics necessary to maintain the normal life activities of a cell,which can effectively regulate and operate the cell )

區(qū)室化的存在為本身無序的生命代謝過程在空間和時間尺度上進行有序調(diào)節(jié)，從而加快了生命代謝過程效率。區(qū)室化的構(gòu)筑常需要借助天然或非天然材料，以達到不同的人工細胞構(gòu)筑需求或目的。脂質(zhì)體因其良好的生物相容性、生物可降解性、易制備和高包封性等特點［148］，最常用來構(gòu)筑人工細胞［149］。高分子材料因為具備較強的穩(wěn)定性，并可通過溫度或化學(xué)梯度從外部刺激響應(yīng)，從而可以構(gòu)筑響應(yīng)于生物物理條件的人工細胞［150］；例如Mann團隊［151］最近成功構(gòu)筑了基于高分子材料的人工細胞，進而組裝成人工組織結(jié)構(gòu)。具備較高生物相容性的水凝膠材料，與脂質(zhì)體或高分子材料相比，在形成多區(qū)間結(jié)構(gòu)微環(huán)境時更具優(yōu)勢［148］。凝聚體（coacervates）是Mann 團隊首創(chuàng)的一類材料，沒有隔室邊界，可通過化學(xué)鍵和相分離自發(fā)地隔離化學(xué)物質(zhì)從而形成區(qū)室化［152］。在區(qū)室化構(gòu)筑的研究中，研究最多的是基于囊泡和人工制備脂質(zhì)體的人工細胞，脂質(zhì)囊泡可以高效地包裹無細胞系統(tǒng)實現(xiàn)蛋白質(zhì)的表達［153］，從而形成高效可控的人工細胞系統(tǒng)［154］。此外，微流控技術(shù)可以通過調(diào)整流速和通道尺寸精確控制液滴大小和形狀，在人工細胞構(gòu)筑方面受到越來越多的關(guān)注。Elani 等［155］利用微流體技術(shù)生成復(fù)雜的混合細胞仿生系統(tǒng)；Trantidou等［156］構(gòu)筑的人工細胞，可實時監(jiān)測外部環(huán)境中的乳酸，展示了作為生物傳感器的潛在應(yīng)用價值。

擁擠效應(yīng)和調(diào)控表達在人工細胞內(nèi)部的無細胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)的調(diào)整優(yōu)化中起到至關(guān)重要的作用。分子擁擠被認為是維持基因表達動態(tài)平衡的重要機制，在存在分子擁擠的情況下，蛋白質(zhì)的緊密排布可以增強與底物的親和力，影響人工細胞中發(fā)生的酶反應(yīng)，以增強基因表達的穩(wěn)健性。但利用不同的擁擠劑可能會導(dǎo)致不同的結(jié)果，高濃度的擁擠劑會對蛋白質(zhì)的表達產(chǎn)生不利的影響。由多個生物大分子組成的無細胞系統(tǒng)本身可作為擁擠劑，以構(gòu)建真實的細胞內(nèi)部環(huán)境［157］，將無細胞系統(tǒng)直接封裝到人造細胞中作為“天然”細胞內(nèi)部狀態(tài)［158］?；虮磉_調(diào)控是控制細胞內(nèi)部有序活動的核心，基因表達噪聲在原核細胞和真核細胞中普遍存在，但即使來自同一種屬的兩個獨立細胞的表達率也是不同的［105］。無細胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)提供了一個簡化的細胞內(nèi)環(huán)境，避開了不需要的噪聲源和一些復(fù)雜的因素；無細胞系統(tǒng)中的質(zhì)粒DNA 允許開放的基因網(wǎng)絡(luò)設(shè)計，因此可以被操縱來研究基因表達噪聲。在Huck 及其同事［159］的工作中，他們將包含兩個基因的無細胞系統(tǒng)封裝到液滴中，通過微流控方法獲得人工細胞群，進而研究揭示基因表達噪聲和物理環(huán)境之間復(fù)雜的相互作用?；蛘{(diào)控網(wǎng)絡(luò)是調(diào)控系統(tǒng)的核心，各種基因元件如轉(zhuǎn)錄因子、觸發(fā)開關(guān)、前饋環(huán)路等已經(jīng)在無細胞系統(tǒng)中被構(gòu)建和制造，包括σ 因子［160］、負反饋元件［161］等，這些基因元件允許構(gòu)建具有復(fù)雜行為的人工細胞內(nèi)部調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，如與門、多階段級聯(lián)和負反饋環(huán)［162］。在操控人工細胞內(nèi)的組織和結(jié)構(gòu)時，一般可使用光學(xué)和磁性鑷子，但需要更好的控制措施，因為粒子的引入可能具有極大的破壞性［148］。

細胞通訊或信息傳遞作為生命體系的重要特征，亦是人工細胞構(gòu)建的主要目標之一，通常通過物理或化學(xué)信號遞送來實現(xiàn)。Aufinger 和Simmel［163］在液滴包裹的無細胞轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中，實現(xiàn)了mRNA 分子在兩種類型的無膜瓊脂糖凝膠之間進行信息通訊。Adamala 等［164］在脂質(zhì)體上嵌入孔道蛋白，由此來啟動胞內(nèi)外信息傳遞和人工細胞內(nèi)部信息調(diào)控。除通過對膜操作進行信息傳遞外，在人工細胞內(nèi)部，亦可通過溫控核糖體開關(guān)等實現(xiàn)信息調(diào)控［165］。

隨著基于無細胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)的人工細胞的發(fā)展，從進化生物學(xué)基礎(chǔ)研究到生物醫(yī)療應(yīng)用研究都得到廣泛拓展［148］。Yomo團隊［166］通過使用基于磷脂的囊泡展示了原始細胞的生長-分裂機制；人工細胞的發(fā)展還推動了無細胞生物傳感的研究［167］；在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，可將人工細胞構(gòu)筑用于藥物篩選［148］。然而，要真正實現(xiàn)“完美”人工細胞的構(gòu)建，還需要實現(xiàn)自我復(fù)制、新陳代謝和信息處理等復(fù)雜功能，這仍然需要未來在相關(guān)領(lǐng)域的進一步拓展。

4 挑戰(zhàn)與展望

綜上所述，無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)作為一種強大的合成生物學(xué)技術(shù)平臺，因其開放性、可控性、高效性、靈活性等諸多優(yōu)點，在過去5～10年時間里得到了多樣化的大力發(fā)展，其應(yīng)用跨越了生物制造、生物催化、生物醫(yī)藥、生物傳感、人工細胞等重要基礎(chǔ)和應(yīng)用研究領(lǐng)域。各種不同的CFPS 技術(shù)平臺進一步使具有不同復(fù)雜性和物種來源的蛋白質(zhì)的體外生產(chǎn)成為可能。然而，無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的發(fā)展中，仍然面臨諸多挑戰(zhàn)。

規(guī)?；统杀臼枪I(yè)制造中的兩大關(guān)注點。該系統(tǒng)的進一步發(fā)展需要無細胞蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)規(guī)模的擴大。一些難合成蛋白質(zhì)的生產(chǎn)離不開動物和昆蟲細胞提取物，而這些提取物的制備較為繁瑣，有些耗時較長，是擴大工業(yè)化生產(chǎn)有待解決的一大問題。同時，一些應(yīng)用的發(fā)展常常受到試劑費用的限制。例如，在大腸桿菌CFPS 系統(tǒng)中，如果以質(zhì)粒為表達模板，以葡萄糖為供能系統(tǒng)，合成非天然綠色熒光蛋白每100 μg 的總成本為0.658 美元［168］。為進一步提高產(chǎn)量、擴大生產(chǎn)規(guī)模，可從以下幾個方面尋求解決策略：簡化提取物制備程序、開發(fā)蛋白質(zhì)合成的新能源再生系統(tǒng)、穩(wěn)定底物供應(yīng)和制備高效的正交翻譯系統(tǒng)。

在未來的發(fā)展中，無細胞體系需要進一步優(yōu)化以提高效率、降低成本，同時提高生物大分子（RNA 和蛋白質(zhì)）合成的個性化、多樣化、普適性和穩(wěn)定性；無細胞系統(tǒng)的使用壽命需進一步延長，需要朝著能夠?qū)崿F(xiàn)自我復(fù)制的無細胞合成系統(tǒng)邁進；需要進一步融合先進材料學(xué)、人工智能和生物醫(yī)學(xué)等多學(xué)科領(lǐng)域，展現(xiàn)出無細胞合成系統(tǒng)更廣泛的應(yīng)用潛力。