楊璐，瞿旭東

（上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，微生物代謝國家重點實驗室，教育部代謝與發(fā)育科學(xué)國際合作聯(lián)合實驗室，上海 200240）

手性胺作為手性助劑以及關(guān)鍵中間體［1-4］，在醫(yī)藥、精細(xì)化工、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值。據(jù)統(tǒng)計超過40%的手性藥物中均含有手性胺結(jié)構(gòu)單元［5］，其中，具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的手性胺因同時具有胺的特性和雜環(huán)化合物的特殊活性，被作為中間體廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物和手性藥物的合成，例如新型喹諾酮類抗菌藥物加雷沙星（Garenoxacin）以及用于治療膀胱過度綜合征的索非那新（Solifenacin）等（圖1）。手性胺可以通過化學(xué)合成、酶催化、外消旋體拆分及組合催化等方法合成［6-10］。相較于傳統(tǒng)化學(xué)合成方法，酶催化具有反應(yīng)條件溫和、催化效率高、立體選擇性強、環(huán)境友好等優(yōu)點，近年來被廣泛應(yīng)用于手性胺的合成中［11-13］，在藥物研發(fā)與生產(chǎn)領(lǐng)域展示出巨大的潛力。

圖1 含有手性胺結(jié)構(gòu)的藥物Fig.1 Pharmaceuticals containing chiral amine motifs

目前已報道的可用于手性胺合成的酶有脂肪酶［14-15］、轉(zhuǎn)氨酶［16-19］、單胺氧化酶［20-21］、氨基脫氫酶［22］、亞胺還原酶［23-25］（含還原胺化酶）和裂解酶［26-27］等。與轉(zhuǎn)氨酶（只產(chǎn)生伯胺）、氨基脫氫酶（底物譜有限）等其他家族的酶相比，亞胺還原酶（IRED）具有極高的立體專一性和更廣泛的底物選擇性，不僅適用于合成手性伯胺，還能用于仲胺以及叔胺產(chǎn)物的合成［28］。此外，IRED 還被廣泛用于還原環(huán)狀亞胺合成手性含氮雜環(huán)，因此IRED的研究及應(yīng)用備受學(xué)術(shù)界與工業(yè)界的關(guān)注。本文總結(jié)了IRED的發(fā)掘、開發(fā)以及在催化合成手性胺方面的研究進(jìn)展，并對IRED的未來發(fā)展方向進(jìn)行了展望。

1 亞胺還原酶的發(fā)現(xiàn)與催化機制

亞胺是指含有碳氮雙鍵（C===== N 鍵）的有機化合物；在生物體內(nèi)亞胺常出現(xiàn)在含氮化合物的代謝過程中，其經(jīng)過還原酶的作用被還原成胺化合物用于合成代謝產(chǎn)物，例如葉酸［29］［圖2（a）］、鐵載體［30-31］［圖2（b）］以及嗎啡合成途徑的關(guān)鍵中間體牛心果堿（Reticuline）等［32-33］［圖2（c）］。盡管對亞胺的還原過程早已熟知，但是由于還原酶的底物普適性較低，限制了這些酶對其他亞胺底物的應(yīng)用拓展。同時亞胺在水中極不穩(wěn)定，對于IRED 的篩選工作帶來了巨大挑戰(zhàn)，導(dǎo)致近10 年才有了較大突破。

圖2 天然代謝過程中的亞胺還原過程Fig.2 Imine reduction in the biosynthesis of natural products

1.1 亞胺還原酶的發(fā)現(xiàn)

IRED 是一類可將前手性亞胺不對稱還原為相應(yīng)胺化合物的NAD（P）H 依賴的氧化還原酶。1988年，Nardini 等［34-35］從豬腎和牛腦分離得到了能將環(huán)狀酮亞胺催化生成手性環(huán)狀氨基酸的酮亞胺還原酶，之后Hallenh等［36］又從人體中發(fā)現(xiàn)了類似的酮亞胺還原酶。隨著研究的深入，在微生物體系中也發(fā)現(xiàn)了類似的酮亞胺還原酶：2004年Li等［37］對亞胺底物采用動態(tài)組合篩選方法，發(fā)現(xiàn)了厭氧菌Acetobacterium woodii具有亞胺還原酶活性，可將芐苯亞胺和丁苯亞胺還原為相應(yīng)的胺。同年Muramatsu 等從Pseudomonas putidaATCC 12633 分離得到一個還原酶，可高效催化L-氨基酸酮酸的還原氨化生成R-甲基氨基酸［38］；隨后該課題組又從該菌株中發(fā)掘出編碼蘋果酸/L-乳酸脫氫酶基因dpkA，在大腸桿菌中異源表達(dá)并對其產(chǎn)物進(jìn)行了表征，發(fā)現(xiàn)該酶既不具有蘋果酸脫氫酶活性，也不具有乳酸脫氫酶活性，但可分別催化亞胺合成L-哌酸鹽和L-脯氨酸［39-40］。2008 年Vaijayanthi 等［41］報道了一種高對映選擇性的不對稱還原芳基亞胺的生物催化方法， 利用近平滑假絲酵母Candida parapsilosisATCC 7330 催化產(chǎn)生R構(gòu)型芳香仲胺。2010年Espinoza-Moraga等［42］篩選到能夠不對稱催化還原β-咔啉亞胺的貝氏酵母Saccharomyces bayanus，以45%～68%的收率和50%～97% ee 的立體選擇性得到了一系列手性胺類產(chǎn)物。

2011 年Mitsukura 等［43-44］發(fā)現(xiàn)了幾株來源于鏈霉菌的具有亞胺還原活性的氧化還原酶，能夠催化不對稱還原2-甲基吡咯啉生成2-甲基吡咯烷。其中來自Streptomycessp.GF3587 的R型亞胺還原酶（RIR）能高效催化2-甲基吡咯啉生成R構(gòu)型產(chǎn)物，而來自Streptomycessp.GF3546 的S型亞胺還原酶（SIR）則可生成S構(gòu)型產(chǎn)物。2-甲基吡咯啉結(jié)構(gòu)簡單，而且在水中穩(wěn)定性高，這一研究迅速推動了亞胺還原酶在環(huán)狀亞胺不對稱催化的發(fā)展。隨后Turner 等［45］將這兩例亞胺還原酶在大腸桿菌中進(jìn)行了異源表達(dá)，實現(xiàn)了多種環(huán)狀亞胺的不對稱還原，拓展了底物圖譜，并報道了在亞胺不對稱還原和生物催化級聯(lián)反應(yīng)的應(yīng)用。RIR 的重組活性很高，且底物普適性也較好［46］；SIR 雖然活性較低，但仍能高效催化五元環(huán)、六元環(huán)、七元環(huán)亞胺及多環(huán)二氫異喹啉的不對稱還原［47］。至此，兩個亞胺還原酶為后續(xù)亞胺還原酶的基因挖掘提供了重要參考，越來越多的亞胺還原酶被鑒定報道出來，大大拓展了亞胺還原酶家族［48-52］。

2012 年Meneely 等［30］從Yersinia enterocolitica分離得到了一株NADPH 依賴的噻唑啉還原酶（Irp3）并解析了其晶體結(jié)構(gòu)。2013 年，Mirabal-Gallardo等［53］在Eisenia foetida上清液中實現(xiàn)了β-咔啉類亞胺的不對稱還原，得到高立體選擇性的R構(gòu)型化合物。2016年P(guān)eng等［54］在研究聚酮合成過程中發(fā)現(xiàn)了一步不尋常的亞胺還原過程，該酶屬于?；o酶A 脫氫酶家族，是一類新型的亞胺還原酶，為生物堿的生物合成提供了一條新的途徑。同年Li等通過基因序列比對，構(gòu)建并表達(dá)了15個亞胺還原酶，以3H-吲哚類化合物為模式底物進(jìn)行篩選，成功找到性能較好的3個亞胺還原酶PlSIR、PlRIR和SnIR，并進(jìn)行了酶改造，提升了催化活性及立體選擇性［55］；隨后他們又鑒定了SnIR對于1-甲基-3，4-二氫異喹啉的催化效率較其他亞胺還原酶有25～1400倍提升［56］。2017年Zhu等［24］構(gòu)建了含有88個亞胺還原酶的大型酶庫，以1-芳基取代的二氫異喹啉化合物為底物進(jìn)行篩選，成功挖掘了一組耐受大空間位阻二氫異喹啉化合物的亞胺還原酶，其中IR45、IR2能分別催化產(chǎn)生S和R構(gòu)型化合物，ee值>99%。同年，Aleku 等［23］從米曲霉中發(fā)現(xiàn)了一個IRED同系物，顯示出強大的還原胺化活性，將其命名為RedAm。這一發(fā)現(xiàn)使得羰基化合物和胺的分子間還原胺化成為可能，開辟了新的領(lǐng)域。2020 年Zhang等［57］通過對天然亞胺還原酶的研究，發(fā)現(xiàn)了能夠識別2-芳基取代吡咯并且能催化得到兩種構(gòu)型產(chǎn)物的亞胺還原酶。利用具有R立體選擇性的ScIR和S立體選擇性的SvIR，合成了多個具有良好對應(yīng)選擇性的2-芳基取代的吡咯烷類手性中間體。

1.2 亞胺還原酶的結(jié)構(gòu)及催化機理

由于IRED 具有巨大的應(yīng)用前景，而理解其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)有助于酶工程的應(yīng)用提高IRED 的性能。Rodríguez-Mata 等［58］解 析 了 來 源 于Streptomyces kanamyceticus的R型IRED Q1EQE0 的 晶 體 結(jié) 構(gòu)（PDB：3ZHB）。IRED 由兩條相同的單體通過相互作用組成二聚體，每個單體的N 端區(qū)域與NAD（P）H 結(jié)合形成羅斯曼折疊（Rossman-fold），并通過一個長螺旋連接到C 末端（圖3）；IRED 的活性口袋處于兩個單體的N端結(jié)合部。

圖3 R-IRED Q1EQE0的同源二聚體的結(jié)構(gòu)Fig.3 Structure of the R-IRED Q1EQE0

結(jié)構(gòu)上Q1EQE0 與一類β-羥基酸脫氫酶HIBDH（PDB：2CVZ）［59］高度類似。HIBDH 同樣屬于NAD（P）H 依賴的氧化還原酶，但催化的反應(yīng)不同；其催化酮酸還原形成羥基酸。在催化過程中，HIBDH首先利用NAD（P）H的活性氫對酮酸的羰基進(jìn)行親核加成生成氧負(fù)離子，而后再由165位的賴氨酸提供質(zhì)子將氧負(fù)離子轉(zhuǎn)化成羥基并完成催化［圖4（a）］。對比HIBDH 和Q1EQE0 的晶體結(jié)構(gòu)，HIBDH 中165 位賴氨酸在Q1EQE0 中對應(yīng)為187 位的天冬氨酸，并且該氨基酸在絕大多數(shù)的RIRED 中保守。 基于HIBDH 的催化機制，Rodriguez-Mata 等［58］推測了R-IRED 的催化機制：其利用187 位的天冬氨酸與亞胺的氮原子形成氫鍵，將亞胺底物固定住，而后再由NAD（P）H 的活性氫對亞胺進(jìn)行親核加成，生產(chǎn)氮負(fù)離子，再由周邊的電正性氨基酸或水分子提供質(zhì)子，最后將氮負(fù)離子轉(zhuǎn)化成胺并完成催化［圖4（b）］。

隨著第1例IRED晶體結(jié)構(gòu)被解析出來，陸續(xù)又報道了多個亞胺還原酶的晶體結(jié)構(gòu)，如來自Streptomycessp.GF3546 的S-IRED（PDB：4OQY），來 自Streptomyces aurantiacus的S-IRED（PDB：4OQZ）， 來 自Bacillus cereus的S-IRED（PDB：4D3F，4D3D），來自Nocardiopsis halophila的S-IRED（PDB：4D3S），來自Pseudomonas putidaKT2440 的RIRED （PDB：3L6D） 以 及 來 自Mycobacterium smegmatis的S-IRED（PDB：6SMT）［60-63］等。與R型IRED 對比，S型IRED 對應(yīng)的催化位點為酪氨酸。為了驗證該位點的作用，Rodríguez-Mata 等［58］對IRED 進(jìn)行了一系列點突變實驗。將R-IRED 中的187 位的天冬氨酸突變?yōu)椴粠щ姾傻谋彼岷吞於０泛螅甘チ嘶钚?；類似的，將S-IRED 的酪氨酸突變?yōu)椴粠щ姾傻谋彼?，酶也失去了催化活性，這些實驗證實了這兩個氨基酸位點對催化活性的重要作用?；谠摻Y(jié)果，Rodriguez-Mata 等隨后推測了S-IRED 的催化機制：其利用酪氨酸與亞胺形成氫鍵起到固定底物和極化亞胺鍵的作用，而后再由NAD（P）H 的活性氫對亞胺進(jìn)行親核加成，最后通過酪氨酸的酚羥基提供質(zhì)子形成胺并完成催化過程［圖4（c）］。

圖4 HIBDH、R-IRED和S-IRED催化機理Fig.4 Catalytic mechanisms of HIBDH,R-IRED and S-IRED

除了催化機制外，Zhu 等［24］為了探究R-IRED和S-IRED結(jié)合位點的差異，以Q1EQE0為模板，模擬得到了可以形成S構(gòu)型化合物的IR45和形成R構(gòu)型化合物IR2的結(jié)構(gòu)模型，并以1-芳基二氫異喹啉為底物進(jìn)行了分子對接。結(jié)果表明，底物位于IR45的活性口袋中，被183位的天冬氨酸和NADPH所包圍，符合之前推測的機理。同時底物的苯環(huán)指向191位的色氨酸和254位的甘氨酸形成的空腔，這種朝向使得底物分子位于NADPH的Si面，利于形成S構(gòu)型化合物。而與IR2的對接結(jié)果表明底物的苯環(huán)指向右上的活性空腔，從而利于形成R構(gòu)型化合物。該工作對IRED催化1-芳基二氫異喹啉的立體選擇性提出了一種較為可靠的模型。

2 亞胺還原酶的改造

野生型的酶一般存在底物選擇性窄、酶活性較差等局限，為了獲得催化活性良好的酶，需要進(jìn)行酶工程改造［64］。酶工程改造，主要包括酶分子的理性設(shè)計和非理性設(shè)計。其中理性設(shè)計包括定點突變、拼接和從頭設(shè)計［65］。非理性設(shè)計是構(gòu)建隨機突變或重組文庫，對該多樣性文庫的基因產(chǎn)物進(jìn)行篩選，通過定向進(jìn)化的方式獲得編碼改進(jìn)功能產(chǎn)物的基因，同時用來繼續(xù)下一輪進(jìn)化，直至獲得目的酶突變體。表1列出了一些較為典型的亞胺還原酶改造案例。

表1 亞胺還原酶改造實例Tab.1 Examples of imine reductase modifications

2.1 定向進(jìn)化

定向進(jìn)化是一種強大的酶工程方法，在近20 年的化學(xué)合成中取得了巨大的成功［69］。通過反復(fù)誘變和篩選，可以有效優(yōu)化酶的性質(zhì)，如對非原生底物的活性、底物選擇性、產(chǎn)物選擇性和穩(wěn)定性，并巧妙地繞過對酶序列和結(jié)構(gòu)、活性物質(zhì)和反應(yīng)機制不清楚的限制。但使用該方法篩選量大，一般需要與高通量篩選方法相結(jié)合［70］。

Hestericová 等［71］采用定向進(jìn)化的方法，對一株人工設(shè)計的亞胺還原酶進(jìn)行改造。采用無細(xì)胞提取液代替純酶的催化方法，篩選了300 個突變體。在幾輪進(jìn)化中，找到了5個催化活性增強，對環(huán)狀亞胺還原性較強的關(guān)鍵位點S112、N118、K121、S122 和L124Y，成功獲得了2 個效率較好的多位點組合突變體，S112A-N118P-K121A-S122M和S112R-N118P-K121A-S122M-L124Y。該突變體相較于野生型酶，可得到較高立體選擇性的R構(gòu)型產(chǎn)物（95%ee）和S構(gòu)型產(chǎn)物（86%ee）。

Schober 等［66］對1 株野生型IRED 進(jìn)行了定向進(jìn)化改造，通過3輪進(jìn)化，使得突變體催化效率較野生型提高了38 000 倍，并且以84%收率得到賴氨酸特異性去甲基化酶-1 （LSD1） 抑制劑GSK2879552的關(guān)鍵中間體，光學(xué)純度高達(dá)99.9%，發(fā)揮了酶在工業(yè)化生產(chǎn)帶來的經(jīng)濟(jì)、綠色可持續(xù)、高產(chǎn)量的優(yōu)勢。

2.2 理性設(shè)計

對于結(jié)構(gòu)和功能已知的酶進(jìn)行改造，可以采用理性設(shè)計的方法來提升酶的活性［72］。一般而言，與底物結(jié)合和參與反應(yīng)的關(guān)鍵氨基酸殘基均在活性口袋附近，對這些關(guān)鍵氨基酸殘基進(jìn)行突變可以改變酶的性質(zhì)。雖然遠(yuǎn)離活性中心的突變有時可提升酶的活性和熱穩(wěn)定性，但是對活性口袋周圍的氨基酸突變影響明顯高于遠(yuǎn)離活性中心位置［73］。肌氨酸是一種N-甲基化氨基酸，可用于合成抗精神病類藥物。Mindt 等［74］從Pseudomonas putida分離得到IRED DpkA，并對底物結(jié)合位點進(jìn)行定點突變，得到突變體DpkA-F117L，提升了乙醛酸的甲基化和乙基化的比活性（較野生型提升了1.18 倍），使該突變體在生產(chǎn)菌株中表達(dá)時可以更快地發(fā)酵生產(chǎn)肌氨酸，容積生產(chǎn)率可達(dá)0.16 g/（L·h）。天然來源的酶活性通常不高，底物選擇性較窄，通常要經(jīng)過改造來提升酶的活性及選擇性［75］。提高立體選擇性可以簡化有機合成的下游提純步驟。Aleku等［23］通過對特殊亞胺還原酶AspRedAm（又稱還原胺化酶）晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，找到了影響產(chǎn)物構(gòu)型的關(guān)鍵氨基酸位點W210，單突變體W210A 實現(xiàn)了R構(gòu)型向S構(gòu)型的反轉(zhuǎn)。Zhu 等［24］將野生型IR45與1-苯基-1，2-二氫異喹啉進(jìn)行分子對接，發(fā)現(xiàn)W191 對于空間位阻大小和維持酶活性至關(guān)重要，對該位點進(jìn)行飽和突變后，找到了一個優(yōu)勢突變株W191F，酶活力較野生型提高了1.5倍。

四氫異喹啉生物堿是一類龐大的手性含N 雜環(huán)化合物，是很多藥物和天然產(chǎn)物的分子骨架。Yang 等［8］通過IR45 與二氫異喹啉底物的分子對接模擬，找到了兩個關(guān)鍵的氨基酸殘基位點F190 和W191，并對其進(jìn)行了飽和突變，成功篩選到兩個催化活性優(yōu)于野生型的突變體。其中IR45-F190LW191F 對于兩個空間位阻最大的化合物實現(xiàn)了100% 轉(zhuǎn)化且ee 值>99%，而野生型沒有活性。IR45-F190M-W191F 對于底物的催化活力也有1.8～6.8倍提升，轉(zhuǎn)化率可達(dá)100%，ee值>99%。

手性七元氮雜環(huán)在天然產(chǎn)物和藥物具有廣泛的應(yīng)用，其中手性1，4-二氮雜烷是重要的結(jié)構(gòu)單元，具有多種生物學(xué)特性和藥用價值，例如治療青光眼和高壓眼癥的Ripasudil［76］。Xu 等［67］通過酶庫篩選，獲得了一系列具有較好催化活性和立體選擇性的IRED。進(jìn)一步對其中的一個酶IR1 進(jìn)行了改造和迭代組合突變，得到雙突變體Y194FD232H，其催化效率是野生型酶的61 倍，底物投料濃度可達(dá)100 mmol/L，具有工業(yè)化前景。該工作為通過IRED 催化相應(yīng)氨基酮的分子內(nèi)還原胺化為手性1，4-二氮雜烷提供了一種有效的方法。

盡管一些IRED 偏好NADH［77］，大部分IRED仍依賴于NADPH。由于NADPH 的價格遠(yuǎn)高于NADH，因此IRED 對于NADPH 的偏好性，限制了其在生物催化中的應(yīng)用。因此輔因子偏好性的改造，對于IRED 在工業(yè)應(yīng)用拓展方面有著重要作用。Gand 等［78］對對從鏈霉菌GF3587 分離得到的IR-Sgf3587 進(jìn)行了合理的設(shè)計，從15 個突變體中篩選到1 個單突變體K40A，使得酶對NADH 依賴度增加了3 倍，并且利用該突變體實現(xiàn)了2-甲基吡咯啉的制備級轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率可達(dá)88%。為了改變NADPH 到NADH 的 特異 性，Borlinghaus 等［79］以 來 自Streptomyces kanamyceticus的R-IRED（PDB：3ZHB，同源性42%）為模板，應(yīng)用了“輔因子特異性反向結(jié)構(gòu)分析和庫設(shè)計”（CSRSALAD）誘變策略，得到了野生型的R-IRED模型［圖5（a）］，并對R-IRED 的6 個氨基酸位點進(jìn)行改造［圖5（b）］，將NADH 的偏好性提高了900 倍。在此基礎(chǔ)上將37 位賴氨酸（K37）進(jìn)一步突變?yōu)楸彼幔蹐D5（c）］，最終將NADH 的選擇性提高了2900倍。

圖5 R-IRED及突變體與NADH的對接模型Fig.5 Docking models of R-IRED and its mutants with NADH

3 亞胺還原酶的應(yīng)用拓展

在工業(yè)生物技術(shù)中的生物催化具有化學(xué)催化無可比擬的優(yōu)勢。例如酶的專一性強，具有高效的底物選擇性，包括立體選擇性、區(qū)域選擇性及化學(xué)選擇性；酶法反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)能耗低，較化學(xué)方法可控度高；酶法對于環(huán)境友好，減少了相應(yīng)的上保護(hù)、脫保護(hù)等步驟，可降低成本，減少污染物排放。

IRED 的研究雖然起步發(fā)展較晚，但隨著測序技術(shù)的發(fā)展，每年數(shù)據(jù)庫收錄的基因序列越來越多，大量未知功能的IRED 被挖掘出來，在合成應(yīng)用方面取得了不少成效。

3.1 多酶串聯(lián)的合成應(yīng)用

IRED 與其他功能酶串聯(lián)，可以實現(xiàn)更廣泛的功能，得到更多復(fù)雜化合物的生物合成。Heath等［80］開發(fā)了一種胺氧化酶-亞胺還原酶體系。通過將R-6-羥基-D-尼古丁氧化酶（6-HDNO）與亞胺還原酶R-IRED 偶聯(lián)，實現(xiàn)了一系列哌啶衍生物和吡咯烷的去外消旋化，產(chǎn)生高收率和對映體過剩值的S構(gòu)型胺化合物。France 等［68，81］開發(fā)了一種IRED 和ω-轉(zhuǎn) 氨 酶（ω-TA）合 成dibenz［c，e］azepine 骨架的方法，并對亞胺還原酶進(jìn)行改造，提升了酶的活性和立體選擇性。又開發(fā)了羧酸還原酶（CAR）、ω-轉(zhuǎn)氨酶（ω-TA）和IRED 的生物催化級聯(lián)反應(yīng)，獲得了手性單取代和雙取代的哌啶和吡咯烷。利用這個策略，可以從酮酸或酮醛開始，一鍋（one-pot）合成各種取代的哌啶或吡咯烷，并且每種酶在催化過程中均表現(xiàn)出高度化學(xué)選擇性、區(qū)域選擇性和立體選擇性（圖6）。Hepworth 等［82］將該級聯(lián)方法應(yīng)用于全細(xì)胞催化中，以較高轉(zhuǎn)化率（>93%）和對映體過量值（>93%）得到一系列哌啶衍生物。Montgomery 等［83］將還原胺化酶（AspRedAm）與醇脫氫酶（ADH）偶聯(lián)，實現(xiàn)了外消旋的醇到手性胺的過程。Ford等［84］利用半乳糖氧化酶（GOase）和IRED 的級聯(lián)作用，合成了芐氧基羰基保護(hù)的氨基氮雜烷和氨基哌啶，一鍋法避免了潛在的外消旋化合物形成不穩(wěn)定中間體，最終得到54%收率的高對映體純度產(chǎn)物。

圖6 一鍋法多酶串聯(lián)合成哌啶和吡咯烷Fig.6 One-pot cascade synthesis of piperidines and pyrrolidines

3.2 化學(xué)-酶串聯(lián)的合成應(yīng)用

化學(xué)與酶相結(jié)合是一種更簡單、高效、經(jīng)濟(jì)的方法，既具有化學(xué)方法合成原料經(jīng)濟(jì)易得、合成工藝簡捷高效的特點，又兼具酶法催化效率高、立體選擇性好的優(yōu)勢，使其在高附加值手性化合物的合成方面得到廣泛應(yīng)用。

Cosgrove 等［85］開 發(fā) 了 一 種IRED 與 鈀 發(fā) 生Buchwald-Hartwig 交叉偶聯(lián)反應(yīng)生產(chǎn)N-芳胺的方法，最終轉(zhuǎn)化率可達(dá)90%，并且IRED 催化步驟建立的手性中心不受后面交叉偶聯(lián)反應(yīng)的影響。Yang 等［8］通過一步簡單的化學(xué)合成，高效地得到一系列二氫異喹啉底物，再與IRED 和甲基轉(zhuǎn)移酶串聯(lián)，一鍋法可完全轉(zhuǎn)化得到N-甲基化的四氫異喹啉生物堿（圖7）。

圖7 化學(xué)-酶法高效合成四氫異喹啉生物堿Fig.7 High efficient synthesis of tetrahydroisoquinoline alkaloids by the chemo-enzymatic method

3.3 其他應(yīng)用

發(fā)展更快速、更簡單的篩選蛋白質(zhì)序列空間的方法，來鑒定用于不對稱合成的IRED，是目前面臨的挑戰(zhàn)和限速步驟。IRED 不對稱催化制備手性胺的策略愈發(fā)誘人，為許多高價值化合物的生物合成提供了一條有效的途徑。Marshall 等［86］發(fā)現(xiàn)了300 余種新的IRED，建立了包含384 種序列多樣的用于篩選的IRED庫，對36個氨基底物進(jìn)行高通量篩選，通過動態(tài)動力學(xué)拆分實現(xiàn)了高收率和高立體選擇性的N-取代β-氨基酯衍生物的制備級合成。也是迄今為止報道的最大的關(guān)于IRED 的鑒定、克隆、生產(chǎn)和合成應(yīng)用方法。

4 總結(jié)與展望

手性胺是非常重要的結(jié)構(gòu)單元，廣泛存在于天然產(chǎn)物、藥物、表面活性劑和農(nóng)用化學(xué)品中。由于手性化合物的不同對映體對生物體的生理活性不同，分離和制備純凈的對映體一直以來都是研究熱點和難點。通過外消旋體拆分法制備手性胺化合物，是目前工業(yè)上應(yīng)用最為廣泛的方法，選擇合適的拆分試劑進(jìn)行多次拆分純化，進(jìn)而得到所需構(gòu)型手性胺。但是該方法理論上僅有50%的收率，會造成原料的浪費及成本的增加。亞胺的化學(xué)不對稱還原通常采用金屬催化或小分子催化方法［87-91］，但金屬催化劑不僅價格昂貴，對環(huán)境也會造成嚴(yán)重污染。隨著酶催化方法的脫穎而出，IRED被越來越廣泛地應(yīng)用于手性胺的合成。

IRED 發(fā)展歷史較短，但隨著近10 年基因測序手段及酶工程改造技術(shù)的飛速發(fā)展，越來越多的功能性IRED 晶體結(jié)構(gòu)被解析報道出來。IRED 在環(huán)狀亞胺的不對稱催化合成方面取得了驕人成績，效果明顯優(yōu)于拆分和去消旋化，吸引了眾多研究者的目光。同時胺基供體選用有機胺，大大增加了產(chǎn)物的寬泛性，逐漸成為合成手性胺的重要的途徑之一。為了獲得更具價值的化合物，IRED 可與其他酶偶聯(lián)，發(fā)展多酶級聯(lián)策略，這無疑賦予了IRED 更大的發(fā)展空間。將化學(xué)與酶法結(jié)合制備手性胺，可以極大豐富前體化合物骨架，提前預(yù)裝目的官能團(tuán)，有效避免了天然合成路徑中某些活性差、表達(dá)量低的酶參與，將化學(xué)合成的優(yōu)勢與酶催化的特點相結(jié)合。

雖然IRED 在不對稱催化合成手性胺方面得以開發(fā)和利用，但仍面臨著不小的挑戰(zhàn)。目前已知的IRED 晶體對于理解其立體選擇性仍缺乏有力解釋。此外，已報道的IRED 普遍存在底物選擇性不夠?qū)挿?、穩(wěn)定性不高、酶活力不足等問題，需要發(fā)展高通量篩選、酶工程改造等技術(shù)，不斷對酶進(jìn)行優(yōu)化，擴大底物圖譜，提高立體選擇性。目前已知的IRED 大多是NADPH 依賴的，僅有極少數(shù)是NADH 依賴，雖然有一些方法可以改變輔因子的選擇性，但是這些策略的通用性還需要驗證。此外，IRED 對于非環(huán)狀亞胺的活性遠(yuǎn)小于環(huán)狀亞胺，因此提高IRED 在非環(huán)狀亞胺反應(yīng)中的應(yīng)用，也是未來重要的研究方向。其次，復(fù)雜化合物體外酶催化全合成途徑中，與IRED 串聯(lián)反應(yīng)的其他功能酶，可能面臨酶不兼容、反應(yīng)條件不合適、中間產(chǎn)物或輔因子抑制酶活性等問題，很大程度上影響多酶串聯(lián)的級聯(lián)反應(yīng)效率。相信隨著合成生物學(xué)、蛋白質(zhì)改造和酶工程的不斷發(fā)展，IRED的應(yīng)用發(fā)展將愈加成熟，成為復(fù)雜化合物合成的重要手段之一。