孫麗娟 孫 淑媛 朱 寶申 尹華春

我國是乙型肝炎(HBV)高發(fā)區(qū)，隨著乙肝疫苗和乙型肝炎免疫球蛋白的應(yīng)用，乙型肝炎的母嬰傳播已明顯減少，但HBV宮腔內(nèi)感染仍是乙型肝炎母嬰阻斷工作中的難題，孕婦血清中HBV病毒達(dá)到一定量時(shí)可使胎盤組織受染，繼而引起宮腔內(nèi)感染。胎盤Hofbauer細(xì)胞是存在于胎盤中的免疫細(xì)胞，具有游走和抗原提呈的特性，可對外來抗原(細(xì)菌和病毒等)進(jìn)行吞噬、加工和提呈［1］。目前文獻(xiàn)報(bào)道垂直傳播組胎盤Hofbauer細(xì)胞總數(shù)及結(jié)合HBV的Hofbauer細(xì)胞數(shù)明顯高于非垂直傳播組。而在未感染HBV母親的胎盤中，Hofbauer細(xì)胞非常少，提示Hofbauer細(xì)胞在HBV經(jīng)胎盤母嬰垂直傳播中具有重要作用。孕期是否注射乙肝免疫球蛋白(HBIG)進(jìn)行阻斷一直以來是個(gè)存在爭議的話題，我們經(jīng)過長期的臨床觀察及對比研究，發(fā)現(xiàn)孕期注射乙肝免疫球蛋白可中和部分乙肝病毒，但對母嬰阻斷不能起到?jīng)Q定性作用，甚至?xí)?dǎo)致乙肝病毒變異從而增加宮內(nèi)感染的幾率。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選 擇2008至2010年在河北省石家莊市第五人民醫(yī)院分娩的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)陽性孕婦及其所生新生兒100例為研究對象，其中50例孕婦于孕28、32、36、39周分別肌內(nèi)注射乙肝免疫球蛋白(成都蓉生制藥生產(chǎn))200/400 U，(HBsAg、HBeAg雙陽性孕婦和/或 H BV-DNA ＞500 U/ml每次注射400 U，HBsAg陽性且HBV-DNA＜500 U/ml孕婦每次注射200 U)，行產(chǎn)前母嬰阻斷。50例產(chǎn)前未給予任何治療。另外選擇同期該院住院分娩的HBsAg陰性，且HBVDNA＜500 U/ml孕婦20例作為對照。孕婦平均年齡27歲;孕周37～42周，新生兒平均體重(3 250±859)g，其中男嬰56例，女嬰64例，無畸形兒。排除慢性乙型肝炎肝功能中度以上異常，妊娠期高血壓綜合征，孕期或產(chǎn)前6個(gè)月給予抗病毒藥物等干擾因素，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢查包括垂直傳播組［母嬰血HBsAg和(或)HBV-DNA均為陽性］;非垂直傳播組［母親血HBsAg和(或)HBV-DNA均為陽性;新生兒外周血HBsAg和HBV-DNA均為陰性］。均排除皰疹病毒、梅毒、丙型肝炎、弓形體、艾滋病(HIV)及其他病毒感染。

1.2 方法 血 清檢測:采集孕婦肘靜脈血3 ml，胎兒娩出6 h內(nèi)股靜脈血2 ml，1 500轉(zhuǎn)/min離心分離血清，20℃保存?zhèn)溆?。新生兒采血? h內(nèi)常規(guī)注射HBIG和乙肝疫苗。測定采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA，廈門英科新創(chuàng)科技公司)測定孕婦及新生兒外周血清 HBsAg，采用PCR技術(shù)測定孕婦及新生兒外周血清HBV-DNA(中山醫(yī)科大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司)結(jié)果檢測全在自動(dòng)酶聯(lián)檢測儀 (MultiskanMK 3)上進(jìn)行。檢測步驟:胎盤娩出后5 min內(nèi)，取胎盤組織中央、邊緣、中央與邊緣1/2處各1 cm3，用10%戊二醛進(jìn)行固定，然后沖洗、脫水、滲透包埋、切片制作。免疫組織化學(xué)細(xì)胞周圍棕黃色為陽性染色，每張切片選擇5～6個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)不少于500個(gè)細(xì)胞，取均數(shù)并評分:不著色為0分，著色淡為1分，著色深為2分;著色細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞百分率:≤5%為0分，6% ～20%為1分，21%～49%為2分，≥50%為3分，染色程度與染色細(xì)胞百分率得分乘積為最后得分。宮內(nèi)感染陽性標(biāo)準(zhǔn):新生兒出生6 h內(nèi)未接受主被動(dòng)聯(lián)合免疫前靜脈血 HBsAg和/或HBV-DNA陽性。0～1分為陰性病例，2分以上為陽性病例。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用 SAS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胎兒宮內(nèi)感染 檢出率為8.0%(8/100)，其中垂直傳播(母親及新生兒HBsAg均為陽性)8例，其中新生兒HBV-DNA陽性2例。8例宮內(nèi)感染新生兒中產(chǎn)前注射乙肝免疫球蛋白及未注射乙肝免疫球蛋白的各4例，2例HBV-DNA陽性新生兒為產(chǎn)前阻斷新生兒。非垂直傳播 (母親HBsAg陽性，新生兒HBsAg陰性)92例。對照組無1例檢出。

2.2 胎盤HBsAg的免疫組織化學(xué) 胎盤組織中的 HBsAg呈現(xiàn)棕黃色信號(hào)，垂直傳播8例全部胎盤均檢測出棕黃色信號(hào)，陽性率為100.0%;非垂直傳播92例胎盤檢測出 HBsAg陽性41例，陽性率為44.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

2.3 HE染色 光學(xué)顯微鏡下垂直傳播組和非垂直傳播組孕婦的胎盤病理學(xué)改變基本相同，均有大量淋巴細(xì)胞、多形核白細(xì)胞、顆粒細(xì)胞浸潤，及組織壞死水腫;絨毛及絨毛間質(zhì)的病理改變中有絨毛水腫，干絨毛動(dòng)脈硬化，絨毛間質(zhì)纖維化和纖維素樣沉積。對照組孕婦的胎盤間質(zhì)較致密，結(jié)構(gòu)完整，絨毛分支細(xì)而密，極少有水腫和壞死。于垂直傳播組的胎盤Hofbauer細(xì)胞中可見圓形或卵圓形成熟病毒顆粒，形狀不規(guī)則，大而飽滿，由雙層膜樣結(jié)構(gòu)包繞密度較高的同心圓顆粒樣核心抗原組成。而在非垂直傳播組，Hofbauer細(xì)胞中偶可見到病毒顆粒，但極少見到大而飽滿的成熟病毒顆粒。

3 討論

HBV宮內(nèi)感染的母嬰阻斷一直以來是母嬰阻斷工作中的難題，是導(dǎo)致母嬰垂直傳播的主要途徑。本研究通過比較對照組、垂直傳播組和非垂直傳播組胎盤組織結(jié)構(gòu)、胎盤HBV感染及其與 Hofbauer細(xì)胞的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)垂直傳播組受到 HBV感染的胎盤結(jié)構(gòu)被破壞。HBV主要感染胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞、Hofbauer細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞。已有資料表明，某些病原體如人類獲得性免疫缺陷病毒(HIV 1)感染胎盤后，可在一定程度上激發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)，滋養(yǎng)層細(xì)胞可釋放趨化因子，誘導(dǎo)胎盤血管中的免疫細(xì)胞游離出血管進(jìn)入胎盤組織，參與炎性反應(yīng)［2，3］。單核細(xì)胞是許多病毒隱匿和復(fù)制的場所。Hofbauer細(xì)胞也屬于單核細(xì)胞系統(tǒng)，因而也可能成為HBV在胎盤中隱匿和復(fù)制的場所［4］。研究發(fā)現(xiàn)，病毒感染胎盤后多聚集在絨毛間質(zhì)的 Hofbauer細(xì)胞內(nèi)或其周圍;Hofbauer細(xì)胞獲取病毒后不能完全殺死病毒，反而成為了病毒寄生、復(fù)制的場所，并進(jìn)一步成為傳播的媒介［5］。研究發(fā)現(xiàn)HBV感染孕婦76%的胎盤受到 HBV感染，病毒多聚集在絨毛間質(zhì)的 Hofbauer細(xì)胞內(nèi)或其周圍，提示Hofbauer細(xì)胞能富集胎盤靠近母體面的病毒［6－8］。正常情況下Hofbauer細(xì)胞可捕獲并殺滅HBV病毒，但HBV病毒感染可使Hofbauer細(xì)胞殺滅病毒能力減弱，反而成為病毒傳播的載體，及復(fù)制場所，導(dǎo)致宮內(nèi)感染。本研究在 Hofbauer細(xì)胞周圍及其細(xì)胞內(nèi)找到了各種病毒樣顆粒(管狀病毒包涵體、空心病毒抗原顆?；虺墒斓牟《绢w粒)，提示Hofbauer細(xì)胞在可能是導(dǎo)致HBV母嬰垂直傳播的罪魁禍?zhǔn)?。空心的病毒抗原顆粒為尚未組裝的抗原，而管狀病毒樣顆粒為病毒芽生的特殊時(shí)期，成熟的病毒顆粒(Dane)具有高度傳染性，這些反映病毒可在Hofbauer細(xì)胞內(nèi)增生復(fù)制。本次研究發(fā)現(xiàn)8例宮內(nèi)感染新生兒中產(chǎn)前注射HBIG及未注射乙肝免疫球蛋白的各4例，2例HBV-DNA陽性新生兒為產(chǎn)前阻斷新生兒。由此可推測孕期注射HBIG后，可能會(huì)導(dǎo)致部分個(gè)體HBV病毒體在一定程度S區(qū)變異，變異的HBV感染胎盤后，感染其中的免疫細(xì)胞(Hofbauer細(xì)胞)，使免疫功能受損，甚至宿主免疫耐受，病毒不宜被識(shí)別，從而不能被完全殺死，胎盤的Hofbauer細(xì)胞可游走于胎盤母體與胎兒之間，而大量的Hofbauer細(xì)胞位于絨毛毛細(xì)血管周圍，并隨著細(xì)胞進(jìn)入胎兒血液循環(huán)致使胎兒宮內(nèi)感染。胎兒和新生兒免疫細(xì)胞尚未發(fā)育成熟，當(dāng)其受HBV抗原物質(zhì)，尤其是小分子量HBeAg直接刺激和誘導(dǎo)時(shí)，Th細(xì)胞可發(fā)生免疫耐受，導(dǎo)致被感染胎兒或新生兒的CTL殺傷力降低，B細(xì)胞分泌特異性抗體減少，不能產(chǎn)生足夠的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致免疫耐受［9］，雖然HBIG和基因重組乙肝疫苗的免疫效果得到了充分肯定，但由于HBV變異及宿主免疫耐受等因素，接種乙肝疫苗仍可能失?。?0］，從而導(dǎo)致母嬰垂直傳播的阻斷失敗。本研究首次對孕期注射HBIG后感染HBV病毒的 Hofbauer細(xì)胞進(jìn)行了超微結(jié)構(gòu)變化觀察，發(fā)現(xiàn)在 HBV垂直感染組中，胎盤 HBV感染可使Hofbauer細(xì)胞胞漿內(nèi)線粒體腫脹，胞漿突起減少，胞漿內(nèi)線粒體峭減少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體萎縮，說明細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)水、電解質(zhì)及吞噬功能減弱;胞漿內(nèi)溶酶體減少，溶解和消化病原體的能力減弱，這將削弱胎兒在宮內(nèi)受到免疫保護(hù)的能力。HBIG能中和體內(nèi)表面抗原，并將病毒清除，但是此種蛋白不能進(jìn)入肝臟，特別是肝細(xì)胞內(nèi)，因此，HBIG必須在乙型肝炎病毒進(jìn)入肝細(xì)胞前應(yīng)用才能有效。故認(rèn)為孕期注射乙型肝炎免疫球蛋白能減少體內(nèi)病毒數(shù)量的說法并不可靠。但HBIG有被動(dòng)免疫功能，孕期注射HBIG，抗HBs可通過胎盤到達(dá)胎兒體內(nèi)，使胎兒在宮內(nèi)獲得被動(dòng)保護(hù)而減少HBV感染幾率［11］。但當(dāng)孕婦體內(nèi)乙肝病毒HBVDNA濃度達(dá)到108U/ml以上時(shí)，即使孕婦從28周后多次注射HBIG等，仍有43%的嬰兒發(fā)生宮內(nèi)傳播。有研究分析比較了全程接種后的嬰兒和母體內(nèi)相關(guān)的基因序列，發(fā)現(xiàn)有堿基突變現(xiàn)象，而且比較普遍，主要是在免疫的壓力下產(chǎn)生的。這個(gè)基因突變使疫苗的免疫功能下降，從而使機(jī)體的抗體水平下降，導(dǎo)致了宮內(nèi)傳播阻斷失?。?2］。這次研究中2例HBV-DNA陽性新生兒的母親血液HBV-DNA均在107～108U/ml，故考慮胎兒宮內(nèi)感染的原因可能與HBV病毒變異有關(guān)。

綜上所述，對于HBV-DNA定量較高的孕婦不建議孕期注射乙型肝炎免疫球蛋白，防止人為干預(yù)誘導(dǎo)病毒發(fā)生基因突變，導(dǎo)致宮內(nèi)感染。應(yīng)采取其他阻斷方案，例如孕晚期服用抗病毒藥物等，通過減少體內(nèi)病毒數(shù)量，從而減少宮內(nèi)感染機(jī)率，增加母嬰阻斷成功率。

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