李華 王麗

反復應(yīng)用阿片類藥物，機體啟動適應(yīng)機制，神經(jīng)元及突觸功能產(chǎn)生適應(yīng)性改變，導致神經(jīng)元及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)功能發(fā)生長期改變，是機體形成藥物依賴和耐受的機制之一［1］。目前研究認為，阿片和其他成癮藥物具有共同的細胞和解剖通路，而受體后細胞、突觸和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的適應(yīng)性改變是成癮形成的關(guān)鍵［1］。阿片類藥物與其受體結(jié)合后，通過升高胞漿內(nèi)環(huán)磷酸腺普(cAMP)水平［2－4］和游離 Ca2+濃度(intracellular free Ca2+concentration，［Ca2+］i)［5－7］，分別激活 cAMP 依賴蛋白激酶 A(cAMP-dependent protein kinase A，PKA)［2－4］及鈣調(diào)蛋白依賴蛋白激酶(calmodulin-dependent kinase，CaMK)［8－10］，使轉(zhuǎn)錄因子cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element-binding protein，CREB)的Ser-133磷酸化而激活CREB，從而持續(xù)調(diào)節(jié)其下游基因表達，參與神經(jīng)元與突觸的可塑性與適應(yīng)性［2－4，8－10］。本文就 CREB 與阿片類物質(zhì)依賴與耐受形成的關(guān)系作一綜述。

1 CREB及其活性調(diào)節(jié)

1.1 CREB 作為多基因家族的一員，轉(zhuǎn)錄因子CREB主要通過cAMP反應(yīng)元件(cAMP response element，CRE)介導cAMP和Ca2+依賴的基因表達。CRE由TGACGTCA序列組成，主要位于許多基因啟動子內(nèi)TATA盒上游100個核苷酸處［8］。CREB是由結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白組成的一個大家族CREB/ATF(activating transcription factor，ATF)中的一員，該家族與基因起動子內(nèi)的CRE結(jié)合。至少10種基因產(chǎn)物屬于CREB家族的一部分。通過不同的剪接，多數(shù)基因產(chǎn)生幾種異構(gòu)體，從而使因子數(shù)目增大。例如，CREB基因產(chǎn)生3種主要的因子(α、β和δ)。除了轉(zhuǎn)錄激活因子，CREB家族還包括轉(zhuǎn)錄抑制因子。例如，cAMP反應(yīng)元件調(diào)節(jié)因子(cAMP response element modulator，CREM)至少包括4種不同的抑制因子，分別為CREMα，β，γ和可誘導的cAMP早期抑制因子(inducible cAMP early repressor，ICER)，可阻斷CRE依賴的基因轉(zhuǎn)錄［8］。

1.2 CREB的活性調(diào)節(jié) 酶復雜的級聯(lián)反應(yīng)調(diào)控CREB的活性。細胞外刺激通過升高細胞內(nèi)cAMP或游離Ca2+，在數(shù)分或數(shù)秒鐘后，CREB便被激活。隨著胞外刺激引起胞漿內(nèi)cAMP水平升高，PKA的催化和調(diào)節(jié)亞單位迅速分離，催化亞單位被動移位至細胞核，并在細胞受到刺激后15～20 min達到高峰。PKA導致CREB內(nèi)的PKA磷酸化位點(RRPSY)中Ser-133磷酸化。Ser-133磷酸化被認為是介導轉(zhuǎn)錄起始的關(guān)鍵事件，因為Ser-133突變?yōu)楸彼釋⑷∠D(zhuǎn)錄［8，11］。細胞內(nèi)Ca2+水平升高通過Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴蛋白激酶Ⅳ(Ca2+/calmodulin-dependent kinaseⅣ，Ca2+/CaMKⅣ)使 Ser-133磷酸化而激活CREB。Ca2+激活CREB可能通過鈣調(diào)蛋白從胞漿移位到胞核。Ca2+調(diào)節(jié)的其他CREB激酶包括 p70 S6激酶(p70 S6 kinase，p70S6K)、p90 核糖體 S6 激酶(p90 ribosomal S6 kinase，p90RSK)家族成員和PKA。在體外，這些酶均可磷酸化CREB。在激活CREB時，這些激酶均位于細胞核內(nèi)。CREB的磷酸化狀態(tài)也受磷酸酶調(diào)節(jié)。在海馬神經(jīng)元，Ca2+/CaM通過激活calcineurin激活一種核磷酸酶，即蛋白磷酸酶-1(protein phosphatase-1，PP-1)，進而導致磷酸化 CREB(phosphorylated CREB，pCREB)去磷酸化［8－10］。在紋狀體，由多巴胺D1/D5受體誘導的pCREB的持續(xù)時間通過激活PP-1的抑制劑，即多巴胺和3＇，5＇-腺苷酸調(diào)節(jié)的磷蛋白(dopamine and adenosine 3＇，5＇-monophosphate-regulated phosphoprotein，DARPP-32)而得以延長［8］。

另外，CREB活性通過轉(zhuǎn)錄抑制因子而被抑制。例如，CREM α、β和γ，由于缺乏Q區(qū)域而不能與轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)互相作用，從而通過CRE對cAMP依賴的基因轉(zhuǎn)錄起負調(diào)控作用。CREM類抑制因子可通過與CREB激活因子競爭與CRE的結(jié)合或通過與CREB激活因子結(jié)合形成無功能異二聚體，來發(fā)揮抑制作用。值得注意的是，CREB通過調(diào)控ICER抑制因子的激活，從而對其所調(diào)控基因的表達活性進行負反饋調(diào)節(jié)［8］。

1.3 CREB啟動基因轉(zhuǎn)錄的過程 CREB家族成員均包含亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)。這些蛋白通過并列的堿性氨基酸殘基發(fā)生二聚體化，形成識別特定寡核苷酸序列的DNA結(jié)合域。當CREB經(jīng)磷酸化激活形成pCREB時，pCREB便于特定的DNA序列CRE結(jié)合，從而啟動基因轉(zhuǎn)錄［8］。pCREB還可解除CREM類抑制因子的抑制作用［8］。

當CREB的Ser-133發(fā)生磷酸化形成pCREB時，pCREB便與一種轉(zhuǎn)錄共同激活蛋白，即CREB結(jié)合蛋白(CREB binding protein，CBP)或其同源類似物p300結(jié)合。CBP和p300均為包含多種蛋白與蛋白相互作用區(qū)域的大分子。在體外，CBP與轉(zhuǎn)錄因子TFⅡB相互作用，而CBP可能是RNA聚合酶Ⅱ全酶復合物的成分之一。另外，CBP是一種組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyl transferase，HAT)，并與 p300/CBP相關(guān)蛋白 P/CAF(p300/CBP-associated protein，P/CAF)結(jié)合，該蛋白也有 HAT活性。HAT催化組蛋白氨基末端的賴氨酸殘基發(fā)生乙酰化。乙酰化作用能中和介導DNA-組蛋白相互作用產(chǎn)生的電荷。CREB-CBP-P/CAF復合物誘導乙?；饔?，使組蛋白-DNA的相互作用松弛，導致即刻早期基因(immediate early gene，IEG)啟動子上的轉(zhuǎn)錄起始復合物易于裝配。CREB與CBP的相互作用及隨后募集RNA聚合酶Ⅱ，對cAMP依賴的基因轉(zhuǎn)錄來說，尚不充分。啟動基因轉(zhuǎn)錄，仍需要其它成分，如TFⅡD［8］。

除了CRE需要CBP，其它的信號轉(zhuǎn)導通路也需要CBP。這些通路激活佛波醇酯元件(phorbol ester element，TRE)和血清反應(yīng)元件(serum responsive element，SRE)，顯示CBP作為轉(zhuǎn)錄輔助激活因子，具有多種功能。

2 阿片依賴引起CREB經(jīng)磷酸化激活

2.1 阿片依賴引起神經(jīng)元內(nèi)cAMP升高 在慢性嗎啡依賴的動物試驗中，均可發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)cAMP水平明顯升高，與離體培養(yǎng)的原代神經(jīng)元和細胞株在受阿片類長時程作用的結(jié)果一致［11］。已知阿片受體均為具有7個跨膜片斷的G蛋白藕聯(lián)受體。這些G蛋白均為抑制型G蛋白(Gi和G0)［12－13］。慢性應(yīng)用阿片類，配體與其結(jié)合后，抑制腺苷酸環(huán)化酶(adenylyl cyclase，AC)的活性［12］。所以慢性應(yīng)用嗎啡后細胞內(nèi)cAMP升高不是阿片類直接作用的結(jié)果，可能與細胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流增加，從而選擇性上調(diào)對Ca2+敏感的Ⅷ型和Ⅰ型AC有關(guān)［12，13］。cAMP調(diào)節(jié)細胞眾多的功能，如細胞代謝、分泌、增生、分化、凋亡及誘導基因表達。在哺乳動物細胞中，cAMP通過PKA發(fā)揮作用。

2.2 阿片依賴引起神經(jīng)元內(nèi)游離濃度(［Ca2+］i)升高 細胞內(nèi)游離Ca2+作為第二信使參與細胞功能的調(diào)節(jié)，在神經(jīng)元的信號轉(zhuǎn)導中起重要作用。慢性應(yīng)用嗎啡，可導致［Ca2+］i升高［5－7，10］。Ca2+進入突觸后神經(jīng)元的胞漿，主要有四條通路:通過N-甲基-D-天冬氨酸型(N-methyl-D-aspartate-type)和α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionate-type型谷氨酸受體;通過電壓門控Ca2+通道;通過細胞內(nèi)鈣庫釋放。

在電壓門控性鈣通道中，根據(jù)電導值、動力學特性等的不同，又分為幾種亞型，現(xiàn)知有L、T、N和P型。L型(long-lasting)開放時間久，約10～20 ms，表現(xiàn)為持續(xù)長時鈣內(nèi)流，電導值25 pS，激活電位－10 mV，失活電位 －60～－10 mV，衰變時間＞500 ms。T型(transient)的開放時間短暫，引起瞬間短小Ca2+電流，電導值9 pS，激活電位 －70 mV，失活電位－100～－60 mV，衰變時間20～50 ms。N型(neither L nor T)見于神經(jīng)元中，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放，電導值13 pS，激活電位－10 mV，失活電位－100～－40 mV，衰變時間50～80 ms。P型最初在哺乳動物小腦浦肯野細胞中發(fā)現(xiàn)，故名，電導值隨條件不同變動為9 ～19 pS，激活電位 －50 mV，失活極慢，t1/2約1 s。

通過激活質(zhì)膜的電壓或配體門控鈣通道，導致細胞漿和細胞核內(nèi)Ca2+水平升高，激活CaMK。在體外，CaMKⅠ、Ⅱ和Ⅳ均能單獨使CREB的Ser-133發(fā)生磷酸化，CaMKⅣ則被認為在細胞內(nèi)起主要作用。CaMKⅣ位于細胞核內(nèi)［8，10］，其激活的動力學在時間上與CREB的Ser-133磷酸化和去磷酸化相關(guān)［9，10］。采用CaMKⅣ反義寡核苷酸或同源物遺傳重組，使CaMKⅣ失活，而降低激酶活性依賴的CREB的Ser-133磷酸化，表明CaMKⅣ是內(nèi)源性膜去極化激活CREB的激酶活性的重要部分。Ca2+內(nèi)流也引起Ras/MAPK信號通路激活，在激活核Rsk激酶時，Ca2+內(nèi)流達到高峰。在生長因子引起的信號轉(zhuǎn)導中，Rsk2被認為是第一個使CREB的Ser-133發(fā)生磷酸化的激酶。Rsk激酶也通過膜去極化激活，提示其可介導生長因子及Ca2+依賴的CREB磷酸化。對許多不同刺激，Ras/MAPK/Rsk和CaMK信號途徑的激活相同，提示這兩條通路在CREB的激活中可能起協(xié)同作用。根據(jù)CREB賴磷酸化的動力學分析顯示，在膜去極化后，CaMKs似乎控制CREB磷酸化的快速時相，而Ras/MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑激活較慢，便成為以后時間內(nèi)主要的 CREB 激酶［8］。

3 CREB與神經(jīng)元和突觸的適應(yīng)性

3.1 阿片依賴與與神經(jīng)元和突觸的適應(yīng)性 阿片類引起機體穩(wěn)態(tài)重建，使中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能發(fā)生紊亂，從而產(chǎn)生阿片依賴。其中神經(jīng)元與突觸相應(yīng)的適應(yīng)性被認為起重要作用［1］。在大腦某一結(jié)構(gòu)中，神經(jīng)元的可塑性與適應(yīng)性表現(xiàn)為改變轉(zhuǎn)錄活性的刺激隨后可改變這一區(qū)域內(nèi)信息處理方式;在整體水平，可塑性與適應(yīng)性導致個體與其周圍環(huán)境的相互作用發(fā)生改變，如學習、感知、理解及對環(huán)境刺激的行為反應(yīng)發(fā)生改變［4］。

阿片藥物成癮的主要特征為耐受、戒斷綜合征及強迫用藥，而對其形成的生物學基礎(chǔ)尚未闡明［1］。目前認為，反復應(yīng)用阿片類藥物，機體啟動適應(yīng)機制，導致對阿片敏感的神經(jīng)元及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的功能發(fā)生短期及長期改變。適應(yīng)機制之一是耐受的形成，即為了獲得理想效果而需要愈來愈高的劑量。相關(guān)或條件耐受指應(yīng)用嗎啡時，總是伴隨特定的環(huán)境，該環(huán)境在耐受形成中起重要作用，并在動物行為中由特定的神經(jīng)系統(tǒng)所介導。非相關(guān)或細胞耐受過程卻受到廣泛關(guān)注。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、分離組織和細胞中，有2種常見的非相關(guān)耐受，一種發(fā)生在阿片受體水平，此時效應(yīng)器藕聯(lián)減少;另一種發(fā)生在細胞、突觸和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)水平，由于發(fā)生了反適應(yīng)改變，盡管有持續(xù)的藥物活性，仍保持正常功能。反適應(yīng)形成的另一結(jié)果是一旦停止用藥，將顯現(xiàn)一系列反跳癥狀和體征。這一戒斷綜合征具有持續(xù)短期、長期和很長時間的特征，包括在急性戒斷癥狀停止后的很長時間內(nèi)，對藥物的渴望和復吸［1］。慢性應(yīng)用阿片類的結(jié)果，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)形成的最重要的適應(yīng)，是從偶然用藥過渡到強迫用藥。耐受和戒斷確實參與了這一過程。慢性應(yīng)用阿片類藥物造成的這些長期適應(yīng)表現(xiàn)在無誘發(fā)藥物存在的情況下，提示特定的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能發(fā)生了長期改變［1，13，14］。值得注意的是，神經(jīng)元和突觸適應(yīng)過程形成的機制使人聯(lián)想到正常的突觸可塑性形成機制［1，15］。突觸可塑性(synaptic plasticity)指突觸功能強度的改變，這一過程通常是神經(jīng)生物學領(lǐng)域關(guān)于學習和記憶研究的主要焦點。突觸可塑性包括神經(jīng)傳遞強度或效力的短期改變以及突觸結(jié)構(gòu)和數(shù)目的長期改變，如被認為是形成記憶的細胞基礎(chǔ)的突觸傳遞的長時程增強(longterm potentiation，LTP)及長時程減弱 (long-term depression，LTD)。分布在神經(jīng)元連接中的成千上萬的突觸強度的正向和負向調(diào)節(jié)，被認為是形成學習和記憶的物理和生化基礎(chǔ)。在低等動物中，包括蝸牛、果蠅和嚙齒類動物，對這些過程的細節(jié)已知曉很多。事實上，人腦和動物腦的區(qū)別是神經(jīng)元連接的數(shù)目和復雜程度，而不是基本的化學過程［16］。

導致阿片依賴的自發(fā)用藥和適應(yīng)的生理機制代表病理記憶的類型。在細胞和突觸水平，LTP和LTD在濫用藥物誘導的突觸的適應(yīng)與其它的活性依賴的可塑性中，其形成機制相同［1］?；钚砸蕾嚨目伤苄詠碜詥岱葘蝹€細胞的興奮性或遞質(zhì)釋放的直接效應(yīng)。阿片的間接效應(yīng)也同樣重要，例如，盡管海馬的錐體細胞不受阿片類的直接影響，但由于阿片對GABA中間神經(jīng)元的抑制而介導的抑制解除增加錐體細胞的興奮性，從而使一些形式的LTP易于形成。研究表明，在人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)，突觸可塑性的分子機制與自發(fā)用藥直接相關(guān)［1］。

3.2 CREB參與神經(jīng)元和突觸的適應(yīng)性 2000年諾貝爾獎獲得者Eric Kandel描述記憶過程為基因與突觸間的對話［16］。短時程記憶與突觸功能的暫時改變相關(guān)，該過程需要酶的激活及蛋白磷酸化，而無需新蛋白合成。長時程記憶則需要轉(zhuǎn)錄因子，如CREB等激活，啟動基因轉(zhuǎn)錄及合成新的蛋白質(zhì)，從而增強活化突觸的傳遞強度或數(shù)目，而參與突觸的可塑性過程。這一參與長時程記憶的分子機制在蝸牛、果蠅、嚙齒類和人類之間的過程相同。而CREB本身也被認為是參與長時程記憶的記憶分子［1，8，16］。

尋找與成癮有關(guān)的極其穩(wěn)定的分子適應(yīng)機制所遇到的困難，與學習和記憶領(lǐng)域面對的挑戰(zhàn)相同［1，14］。盡管有成熟的學習和記憶的細胞和分子模型，但仍未確定足夠長期的細胞和分子適應(yīng)機制以解釋高度穩(wěn)定的行為記憶?？赡艿臋C制之一是通過CREB介導很短暫的基因表達改變，而介導神經(jīng)元形態(tài)學和突觸結(jié)構(gòu)的長期改變。例如，在海馬錐體神經(jīng)元，增加樹突突起的密度及LTP時谷氨酸能突觸的效力。另一種可能是轉(zhuǎn)錄因子CREB的短暫激活通過修飾染色質(zhì)，導致基因表達更持久的改變。CREB和許多其它的轉(zhuǎn)錄因子被認為通過促進靶基因周圍的組蛋白發(fā)生乙?；蛉ヒ阴；せ罨蛞种瓢谢蜣D(zhuǎn)錄。盡管組蛋白乙?；蛉ヒ阴；l(fā)生非?？?，但是CREB在控制組蛋白乙?；拿赶到y(tǒng)方面產(chǎn)生更持久的適應(yīng)。CREB也可能通過調(diào)節(jié)DNA或組蛋白的甲基化，使基因表達發(fā)生更持久的改變［14］。

綜上所述，在阿片類依賴和耐受形成中，CREB通過介導cAMP和Ca2+信號轉(zhuǎn)導而誘導靶基因表達，參與神經(jīng)元和突觸的適應(yīng)性過程。由于CREB與CRE組成的復合物是多效性的激活劑，參與許多細胞及病毒的基因轉(zhuǎn)錄，而目前不清楚何種基因產(chǎn)物從核內(nèi)移位到特定的突觸，并通過何種機制參與神經(jīng)元與突觸的適應(yīng)性過程［8］。也許從基因組范圍進一步分析，將更有益于理解當CREB發(fā)生改變時所導致的分子改變與濫用藥物所導致的行為反應(yīng)之間的相關(guān)關(guān)系［3］。

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