鐘 成，李文杰，賈士儒* ，范寶慶，王國良，鄭竹琳

(1.教育部工業(yè)微生物重點實驗室(天津科技大學)，天津300457;2.天津科技大學生物工程學院，天津300457)

ε－聚－L－賴氨酸(ε－poly－L－lysine，簡寫 ε－PL)是由25～35個單體 L－賴氨酸通過 α－羧基和 ε－氨基通過酰胺鍵依次連接而成的陽離子型的天然氨基酸聚合物。最早由 Shima和 Sakai在篩選與Dragendorff試劑呈陽性反應的物質時偶然發(fā)現，是由白色鏈霉菌346分泌的一種胞外物質［1－2］。在酸性和微酸性環(huán)境中 ε－聚賴氨酸對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌和霉菌均具有一定的抑制作用，而且其水溶性好、熱穩(wěn)定性高、可降解、可食用，對人體和環(huán)境無毒。因此它和它的衍生物由于其廣泛的工業(yè)應用(如食品，醫(yī)藥，環(huán)境和電子技術)，在過去幾年里已引起了人們廣泛的興趣。ε－PL和它的衍生物有多種不同的應用，如作為食品防腐劑、乳化劑、食療劑、可降解纖維、可高度吸水的凝膠、藥物載體、抗癌劑增強因子和生物芯片。1989年日本批準其用于食品加工中，此后，韓國和美國也陸續(xù)批準其作用食品添加劑［3］。

自發(fā)現白色鏈霉菌Lysinopolymerus strain 346以來，人們針對ε－PL生產菌株的發(fā)酵過程與發(fā)酵條件進行了大量的優(yōu)化，以提高ε－PL的最終產量。如Shima等［1，4］采用了 2 步培養(yǎng)的方法，先將菌體 S.albulus接種于20 g/L甘油，5 g/L酵母浸膏的種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h，溫度30℃;然后通過過濾收集菌體，將富集菌體移入含20 g/L葡萄糖、20 g/L檸檬酸和10 g/L(NH4)2SO4的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通過2步培養(yǎng)的方法，8～9 d后ε－PL的發(fā)酵產量可達4～5 g/L。Kahar等［5］通過 pH值的調控來調節(jié)菌體的生長和 ε－聚賴氨酸的產量，采用菌株 S.albulus 410在5 L機械攪拌發(fā)酵罐發(fā)酵，培養(yǎng)基為M3G，通過半連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)，在消耗大量能量的前提下采用pH值來控制。試驗過程分為2個階段，在前期菌體生長階段控制發(fā)酵液的pH值大于5.0，在后期ε－聚賴氨酸合成階段發(fā)酵液 pH值控制在4.0左右。通過這一半連續(xù)培養(yǎng)后發(fā)現，ε－PL產量由原先5.2 g/L上升到48.3 g/L。

在微生物發(fā)酵過程的研究中，實現發(fā)酵過程優(yōu)化與控制是發(fā)酵過程的重要目標和研究熱點。通過菌株選育得到高產菌株，并通過發(fā)酵過程的優(yōu)化控制，可以最大限度地發(fā)揮菌株的生產潛力。本研究考察了白色鏈霉菌分批發(fā)酵生產ε－聚賴氨酸過程的生長動力學，并建立了菌株生長動力學模型，對模型的動力學參數進行了求解，為發(fā)酵過程的優(yōu)化與控制提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)方法

白色鏈霉菌UV80(Streptomyces UV80)由天津科技大學生化工程研究室保藏［6］。斜面培養(yǎng):取4℃冰箱中保存的菌種，接種至斜面培養(yǎng)基中，30℃恒溫培養(yǎng)5～7 d至長滿灰色孢子。一級搖瓶種子培養(yǎng):取一環(huán)斜面菌體接入裝有100 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，30℃，220 r/min，旋轉式搖床培養(yǎng)一定的時間。二級搖瓶種子培養(yǎng):以體積分數為10%的接種量將一級種子培養(yǎng)液接入裝有90 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，30℃，220 r/min，旋轉式搖床培養(yǎng)一定的時間。發(fā)酵罐培養(yǎng):貝朗5 L發(fā)酵罐。初始pH值為6.8，初始糖質量濃度50 g/L，溫度30℃，通風量1～2 vvm(vvm即通氣比，每分鐘通氣量與罐體實際料液體積的比值)，控制DO 30%(攪拌轉速為300～1 000 r/min)。

1.2 分析方法

菌體干重采用烘干法測量。濾紙預先于烘箱95℃烘至恒重，取10 mL發(fā)酵液，在4 000 r/min條件下離心8 min，沉淀用無菌水洗滌2～3次，濾紙過濾，將濾紙和菌體在烘箱中95℃干燥至恒重，計算菌體干重。殘?zhí)欠治霾捎萌?0 mL發(fā)酵液，4 000 r/min，離心 8 min，取上清液，使用 SBA－40C生物傳感分析儀(山東省科學院微生物研究所)測定發(fā)酵液中的葡萄糖濃度。

發(fā)酵液經初步預處理、離心分離、D392大孔徑弱堿性陰離子交換樹脂、D152大孔徑弱酸性陽離子交換樹脂以及乙醇沉淀和噴霧干燥，得到ε－聚賴氨酸。ε－聚賴氨酸的含量采用高效液相色譜法測量［7］。其色譜條件為:色譜柱為 TSKgel ODS－120T，φ4.6 mm×25 cm。采用紫外分光檢測器，檢測波長為215 nm。柱溫40℃。將磷酸氫二鉀1.70 g和硫酸鈉1.42 g溶于800 mL水中，用磷酸調 pH值至3.4后用水定容至1 000 mL，之后取此溶液920 mL加入80 mL乙腈作為流動相。采用 L－苯丙氨酸作為內標，進樣量為 20 μL。

2 結果與討論

2.1 白色鏈霉菌分批發(fā)酵生產 ε-聚賴氨酸的生長動力學分析

圖1～圖3為5 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵生產 ε－聚賴氨酸過程的底物消耗、菌體生長以及產物生成的變化曲線。圖 1～圖 3中，矩形為實測值，實線為Sigmoid模型擬合的曲線。

圖1 底物濃度隨時間的變化情況Fig.1 Changes of substrate concentration over time

由圖1可以看出，菌體在8～32 h耗糖速度迅速加快，之后耗糖速度緩慢下降，發(fā)酵結束時，發(fā)酵液殘留葡萄糖濃度為38 g/L。圖2表明菌體在8～24 h內長較快，于32 h時到最大值，此時細胞干重(DCW)為5.75 g/L，隨著發(fā)酵的繼續(xù)進行，菌體量緩慢下降。由圖3可見，當白色鏈霉菌生長到一定階段，ε－聚賴氨酸才開始在發(fā)酵液中積累，可能是細胞生長與產物形成存在部分偶聯關系，ε－聚賴氨酸在8～48 h大量合成并于48 h達到最大值，即0.9 g/L。

圖2 菌體量隨時間的變化情況Fig.2 Changes of biomass growth over time

圖3 ε-聚賴氨酸隨時間的變化的情況Fig.3 Changes of ε-pL production over time

2.2 ε-聚賴氨酸分批發(fā)酵生產 ε-聚賴氨酸的Sigmoid模型

由于微生物本身代謝生長的復雜性，要建立它們的結構生長模型非常的復雜。因此實際過程當中，經常用到經驗和半經驗但沒有明確生物學意義的數學方程來描繪其生長規(guī)律，其中常用的方程如Monod以及 Logistic模型等［8］。Sigmoid模型在工程領域中常用來擬合“S”形曲線，其對應的函數(Boltzmann函數)如方程(1)所示。

運用Sigmoid模型對ε－聚賴氨酸發(fā)酵過程的生物量、殘?zhí)?、產物濃度進行擬合，如圖1，圖2和圖3中實線所示。

由圖1可知，模型預測值(實線)基本上能夠較好地吻合試驗所測值(矩形)，表明 Sigmoid模型在白色鏈霉菌生長規(guī)律方面有較好的適應性。生物量、殘?zhí)?、ε－聚賴氨酸?Sigmoid模型擬合后的數學方程見式(2)～式(4)。

Sigmoid模型擬合菌體生長動力學方程為

Sigmoid模型擬合產物形成動力學方程為

Sigmoid模型擬合底物消耗動力學方程為

2.3 動力學參數求解

細胞比生長速率(μ)、葡萄糖比消耗速率(qs)和ε－聚賴氨酸比合成速率(qε－pl)定義式分別為:

當時間間隔很小時，可以近似用式(6)直接計算得到 μ，qs，qε－pl。

利用Origin繪圖軟件對試驗數據進行插值計算(時間間隔0.1 h)，再用Excel軟件求解得到發(fā)酵不同時刻的 μ、qs和 qε－pl，經 Origin 軟件繪圖后平滑處理得到不同時刻白色鏈霉菌生產 ε－聚賴氨酸過程動力學參數變化曲線［9－10］，見圖 4。

圖4表明細胞比生長速率在5.8 h達到最大值，為0.263 55 h－1;葡萄糖比消耗速率在12 h達到一個最大值，為0.004 326 h－1，之后到 30 h以后，它的值隨著時間的延長，不斷地增加;此時可以看出底物的消耗主要用于ε－聚賴氨酸的合成，ε－聚賴氨酸比合成速率在 36 h達到最大值，為0.008 88 h－1。另外，由圖4可知，ε－聚賴氨酸的合成與細胞的生長呈現復雜的部分偶聯關系，符合 Luedeking－Piret方程，通過回歸分析可得ε－聚賴氨酸的合成與細胞生長的偶聯系數關系式。

圖4 ε-聚賴氨酸發(fā)酵過程細胞比生長速率(μ)、葡萄糖比消耗速率(qs)、ε-PL的比合成速率(qε-pL)隨時間的變化曲線Fig.4 Changes of specific growth rate(μ)，specific glucose consumption rate(qs)，specific ε-pL production rate(qε|pL)over time during ε-pL fermentation process

2.4 ε-聚賴氨酸發(fā)酵過程中得率的變化

相應的，根據式(8)可計算得到發(fā)酵過程中細胞對葡萄糖的得率(Yx/s)，ε－聚賴氨酸對葡萄糖的得率 Yε－pl/s隨時間的變化曲線。

圖5 ε-聚賴氨酸發(fā)酵過程中細胞對葡萄糖的得率(Yx/s)、ε-聚賴氨酸對葡萄糖的得率 Yε-pl/s隨時間的變化曲線Fig.5 Changes of Yx/s，Yε-pL/sover time during ε-pL fermentation process

對底物的得率系數表征菌體攝取底物用于自身生長或代謝產物合成的能力［11］。圖5中菌體對葡萄糖的得率系數隨發(fā)酵時間的延長先升高后逐漸降低，表明前期細胞代謝底物主要用于菌體自身的生長，而ε－聚賴氨酸的得率系數隨著時間的延長逐漸的升高，在發(fā)酵停止時仍有升高的趨向，即為0.5 g/g，表明在發(fā)酵后期菌體利用葡萄糖合成 ε－聚賴氨酸的能力在增強，并且逐漸增加。

3 結論

通過對ε－聚賴氨酸分批發(fā)酵過程進行分析，運用Sigmoid模型擬合得出底物消耗、菌體生長和產物形成的動力學方程，并對發(fā)酵過程當中的一些參數進行了動力學分析，模擬結果與試驗數據具有很好的相關性，研究為ε－聚賴氨酸生產的分批發(fā)酵法和補料分批發(fā)酵法提供了重要的理論依據。

參考文獻:

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