許四宏，王佑春

·生物診斷技術(shù)·

重大傳染病診斷技術(shù)

許四宏，王佑春

近年來(lái)，我國(guó)在突發(fā)傳染病，尤其是嚴(yán)重急性呼吸道綜合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）和甲型H1N1 流感等的防控經(jīng)驗(yàn)顯示，診斷試劑在傳染病的預(yù)防和控制中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。這些診斷試劑從方法學(xué)上講，主要分為兩大類(lèi)，即免疫學(xué)診斷和分子診斷。本文對(duì)這兩類(lèi)診斷技術(shù)進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述。

1 免疫學(xué)診斷技術(shù)

免疫學(xué)診斷技術(shù)一般是以抗原抗體特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)，主要包括酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）、免疫層析技術(shù)以及最近發(fā)展的以化學(xué)發(fā)光法、時(shí)間分辨熒光分析法等為代表的新型檢測(cè)技術(shù)。

1.1 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）

1971 年，Engvall 和 Van Weemen 分別建立的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)是經(jīng)典的免疫學(xué)診斷技術(shù)，其基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化（包被）及抗原或抗體的酶標(biāo)記[1-2]。包被后的抗原或抗體保留免疫學(xué)活性，可與待測(cè)樣品中的抗體或抗原形成免疫復(fù)合物；酶標(biāo)記后的抗原或抗體可繼續(xù)與抗原抗體復(fù)合物進(jìn)一步形成復(fù)合物，復(fù)合物中的酶可催化酶的底物發(fā)生顯色反應(yīng)，其色度的深淺與待測(cè)樣品中受檢物質(zhì)的量成正比。

根據(jù)反應(yīng)中形成免疫復(fù)合物的種類(lèi)，ELISA 可以分為4 類(lèi)方法，即夾心法、間接法、捕獲法和競(jìng)爭(zhēng)抑制法。夾心法包括雙抗原夾心法和雙抗體夾心法，包被物為抗原（或抗體），以酶[一般為辣根過(guò)氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP）]標(biāo)記的抗原（或抗體）為酶結(jié)合物。間接法的包被物為抗原，以酶（一般為辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶）標(biāo)記的二抗為酶結(jié)合物。捕獲法一般用于 IgM 抗體的檢測(cè)，包被物為抗人 IgM 抗體，用于捕獲待測(cè)樣品中特異性或非特異性的 IgM 抗體，酶結(jié)合物為酶標(biāo)記的針對(duì)特異性抗原的抗體。競(jìng)爭(zhēng)抑制法是先將特異性抗原（或抗體）包被于微孔板，隨后分為兩組，一組僅加酶標(biāo)記的抗原（或抗體），另外一組則同時(shí)加入酶標(biāo)記的抗原（或抗體）和被測(cè)抗原（或抗體）的混合物，最后加入底物顯色，通過(guò)兩組底物顯色的差異判定是否為陽(yáng)性。

目前，ELISA 技術(shù)已廣泛應(yīng)用于重大傳染病的診斷，如雙抗原夾心法用于檢測(cè) HIV 抗體、雙抗體夾心法檢測(cè)HBsAg、間接法用于檢測(cè) HCV 抗體等。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，近年來(lái)，抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑也逐步在中國(guó)上市，比如國(guó)外 20 世紀(jì)末 21 世紀(jì)初研發(fā)成功的 HIV 抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑，就是利用雙抗原夾心法檢測(cè) HIV 抗體的同時(shí)利用雙抗體夾心法檢測(cè) HIV-1 p24 抗原，利用親和素-生物素放大系統(tǒng)（avidin-biotin system，ABS）[3]盡可能在不影響檢測(cè) HIV 抗體性能的前提下，提高檢測(cè) HIV-1 p24 抗原的靈敏度。我國(guó)目前僅 2 家企業(yè)獲得該種試劑的生產(chǎn)文號(hào)，還有至少 6 家企業(yè)正在申請(qǐng)注冊(cè)。

1.2 免疫層析診斷技術(shù)

免疫層析診斷技術(shù)是 20 世紀(jì) 90 年代興起的一種新型快速診斷技術(shù)，其基礎(chǔ)是膠體金標(biāo)記技術(shù)、層析技術(shù)和抗原抗體特異性反應(yīng)。

1.2.1膠體金的標(biāo)記 膠體金溶液是直徑為 20 ～ 40 nm的金顆粒溶液，經(jīng)氯金酸還原制成，其中心的金原子顆粒周?chē)搅艘粚訋ж?fù)電的 AuCl2-離子，由于靜電作用形成穩(wěn)定的膠體金溶液。膠體金的標(biāo)記一般可采用 3 種方式：①依賴(lài)于蛋白質(zhì)上賴(lài)氨酸較強(qiáng)的正電荷，通過(guò)靜電吸附結(jié)合于膠體金；②依賴(lài)于色氨酸的疏水作用與膠體金連接；③依賴(lài)于半胱氨酸的 –SH 與金表面以共用電子的形式形成共價(jià)鍵連接膠體金。

1.2.2硝酸纖維膜（NC 膜）層析技術(shù) NC 膜主要用于蛋白質(zhì)的包被，一般通過(guò)特定的噴膜儀完成。經(jīng)表面活性劑處理后，NC 膜具有很好的親水性，待測(cè)血清從 NC 膜的一端加入后，在毛細(xì)作用下，能在數(shù)十秒之內(nèi)層析到 NC 膜的另一端，這種層析技術(shù)是膠體金快速診斷技術(shù)的基礎(chǔ)。

1.2.3免疫層析診斷技術(shù) 免疫層析診斷技術(shù)中，標(biāo)記的顆粒除了膠體金外，還包括膠體硒、乳膠顆粒、納米磁珠等。膠體硒的性質(zhì)與膠體金相似，可通過(guò)同樣的方法進(jìn)行標(biāo)記。乳膠顆粒的標(biāo)記一般通過(guò)疏水作用或化學(xué)交聯(lián)的方法。

膠體金類(lèi)免疫層析診斷試劑的優(yōu)點(diǎn)主要體現(xiàn)在：快速（一般 5 ～ 30 min 即可觀(guān)察到檢測(cè)結(jié)果）、操作簡(jiǎn)單（不需要專(zhuān)業(yè)人員、實(shí)驗(yàn)室以及儀器）、穩(wěn)定性好、成本低。其缺點(diǎn)是靈敏度低于 ELISA 試劑，使用范圍應(yīng)受到一定限制。

目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于傳染病的檢測(cè)，如常規(guī)的乙肝五項(xiàng)檢測(cè)項(xiàng)目、HCV抗體、HIV 抗體等檢測(cè)項(xiàng)目。2009 年，我國(guó)有多家企業(yè)研制成功甲型 H1N1 流感抗原膠體金試劑，可快速對(duì)甲流進(jìn)行診斷，為我國(guó)甲流的預(yù)防和控制發(fā)揮了比較重要的作用。

1.3 新技術(shù)在免疫診斷中的應(yīng)用

近年來(lái)，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，多項(xiàng)新技術(shù)被廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)診斷，其中以化學(xué)發(fā)光技術(shù)、時(shí)間分辨熒光分析法等為代表。

1.3.1化學(xué)發(fā)光技術(shù) 化學(xué)發(fā)光免疫分析法是 1977 年由Halmann 等[4]將高靈敏度的化學(xué)發(fā)光技術(shù)和抗原抗體的特異性反應(yīng)相結(jié)合而建立，與 ELISA 技術(shù)不同，該技術(shù)采用化學(xué)發(fā)光顯色系統(tǒng)。

依據(jù)標(biāo)記物的不同，化學(xué)發(fā)光免疫分析法可分為 3 種：①標(biāo)記物質(zhì)直接發(fā)光，一般以吖啶酯類(lèi)衍生物標(biāo)記抗原或抗體，在過(guò)氧化氫和堿性條件下，產(chǎn)生高強(qiáng)度、低背景的閃光，但持續(xù)時(shí)間極短，因此對(duì)檢測(cè)儀器有較高的要求；②酶促發(fā)光，主要為辣根過(guò)氧化物酶催化魯米諾發(fā)光以及堿性磷酸酶催化 1, 2-環(huán)二氧乙烷金剛烷衍生物發(fā)光[5-6]。酶促發(fā)光產(chǎn)生的為輝光，持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)檢測(cè)儀器的要求較低，比較易于廣泛推廣應(yīng)用；③電化學(xué)發(fā)光，一般以三聯(lián)吡啶釕作為標(biāo)記物，經(jīng)電激發(fā)釕產(chǎn)生閃光[7]。

化學(xué)發(fā)光分析法結(jié)合 ELISA 技術(shù)中的夾心法、間接法的試劑目前均有研發(fā)成功，應(yīng)用后兩類(lèi)發(fā)光技術(shù)的試劑已經(jīng)在我國(guó)上市。我國(guó)有多家企業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用 HRP/魯米諾酶促發(fā)光系統(tǒng)的乙肝 HBsAg、HCV 抗體、HIV 抗體試劑獲準(zhǔn)上市。應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)，法國(guó)生物梅里埃公司的 HIV 抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑 VIDAS HIV Duo、VIDAS HIV Ultro已在我國(guó)獲準(zhǔn)上市，羅氏診斷的 HIV 抗原抗體試劑已在我國(guó)獲得注冊(cè)。

1.3.2時(shí)間分辨熒光分析法 時(shí)間分辨免疫熒光分析法最早由芬蘭的 Wallac 公司建立，與 ELISA 試劑不同，其標(biāo)記物為 Eu3+標(biāo)記的抗原或抗體，在熒光增強(qiáng)液的作用下，抗原抗體復(fù)合物上結(jié)合的 Eu3+離子從免疫復(fù)合物解離，迅速與熒光增強(qiáng)液中的配體螯合并進(jìn)入疏水內(nèi)核，使得半衰期較長(zhǎng)的 Eu3+熒光得以成千萬(wàn)倍的放大，從而產(chǎn)生高靈敏度的免疫分析。

目前我國(guó)蘇州新波生物技術(shù)公司和廣州達(dá)瑞公司均以時(shí)間分辨熒光免疫分析法技術(shù)為研發(fā)基礎(chǔ)，已有多種傳染病診斷試劑，如 HBsAg、HCV 抗體、HIV 抗體試劑等獲準(zhǔn)上市。

2 分子診斷技術(shù)

早期的分子診斷技術(shù)是采用核酸雜交技術(shù)對(duì)目的核酸進(jìn)行檢測(cè)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子診斷技術(shù)越來(lái)越多地應(yīng)用于傳染病的臨床診斷，如運(yùn)用多種擴(kuò)增放大技術(shù)，將低拷貝的靶序列成對(duì)數(shù)級(jí)放大擴(kuò)增，同時(shí)采用比放射性探針更靈敏的非放射性檢測(cè)系統(tǒng)（如電化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)、實(shí)時(shí)熒光系統(tǒng)等），大大提高了核酸檢測(cè)的敏感性，并減少了放射性物質(zhì)的使用。當(dāng)前應(yīng)用的分子診斷技術(shù)主要包括 3 種類(lèi)型，即靶擴(kuò)增、探針擴(kuò)增和信號(hào)擴(kuò)增，但是目前我國(guó)市面上的分子診斷試劑主要應(yīng)用技術(shù)僅包括靶擴(kuò)增和信號(hào)擴(kuò)增，因此本文僅對(duì)該兩項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

2.1 靶擴(kuò)增

于 1983 年建立的 DNA 聚合酶鏈反應(yīng)（ploymerase chain reaction，PCR）是分子診斷技術(shù)的基礎(chǔ)[8]。隨后研究者們開(kāi)發(fā)出了多種核酸擴(kuò)增技術(shù)，其主要區(qū)別在于擴(kuò)增條件、擴(kuò)增酶的類(lèi)型及是否需要溫度變化循環(huán)等方面，不同方法的擴(kuò)增時(shí)間也存在很大差異。靶擴(kuò)增技術(shù)主要包括 DNA聚合酶鏈反應(yīng)、以轉(zhuǎn)錄為基礎(chǔ)的擴(kuò)增以及環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增。

2.1.1DNA聚合酶鏈反應(yīng) 該技術(shù)是利用耐熱的 DNA聚合酶及與靶序列上某區(qū)域上下游的兩條寡核苷酸引物（序列長(zhǎng)度一般為 15 ～ 30 bp）對(duì)該靶序列進(jìn)行擴(kuò)增。其反應(yīng)一般包括 25 ～ 35 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括 3 個(gè)溫度階段，分別完成變性、退火和延伸功能。在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的實(shí)時(shí)熒光PCR（RT-PCR）技術(shù)，即是以 RNA 為靶，先采用逆轉(zhuǎn)錄酶將 RNA 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA 鏈，然后以該 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。

PCR 結(jié)束后，可以采用多種不同的檢測(cè)技術(shù)對(duì)擴(kuò)增的靶序列進(jìn)行檢測(cè)。早期的檢測(cè)技術(shù)是采用類(lèi)似于 ELISA 式的方法進(jìn)行檢測(cè)，如 Roche 公司的 COBAS Amplicor HIV-1 monitor test 和 COBAS HBV monitor test 試劑，該類(lèi)試劑在兩條 PCR 引物的 5' 末端均標(biāo)記有生物素，利用具有逆轉(zhuǎn)錄和 DNA 聚合酶活性的重組 DNA 聚合酶（rTth Taq酶）經(jīng) PCR 擴(kuò)增后，以親和素標(biāo)記的 HRP 催化四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色，最后通過(guò)設(shè)定的公式計(jì)算出標(biāo)本中所含 HBV DNA 或 HIV-1 RNA 的數(shù)量。

隨著 RT-PCR 技術(shù)的發(fā)展，已有多家企業(yè)開(kāi)發(fā)完成RT-PCR 試劑。其基本原理是：設(shè)計(jì)合成一條能與 PCR 產(chǎn)物雜交的寡核苷酸探針，該探針的 5' 端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，3' 端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)；在兩者距離很近且在同一寡核苷酸探針上時(shí)，3' 端淬滅基團(tuán)吸收 5' 端熒光報(bào)告基團(tuán)的熒光，因而檢測(cè)不到 5' 端熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光；但當(dāng)溶液中存在 PCR 產(chǎn)物（模板）時(shí)，該探針與模板退火，產(chǎn)生適合于核酸外切酶活性的底物，Taq 酶則利用 5' → 3' 核酸外切酶活性，將探針 5' 端的熒光報(bào)告基團(tuán)從探針上切割下來(lái)，破壞了兩個(gè)熒光分子間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET），從而發(fā)出熒光，隨 PCR 的反復(fù)進(jìn)行，PCR 產(chǎn)物成倍累積，熒光探針也成倍被水解，熒光信號(hào)強(qiáng)度的增加將進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期，因此，根據(jù) PCR 反應(yīng)液的熒光強(qiáng)度即可計(jì)算出初始模板的數(shù)量。目前實(shí)時(shí)熒光 PCR（RT-PCR）試劑主要包括：Roche公司的 Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan HIV-1 test version 1.0 和 version 2.0、Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan HBV test version 1.0 和 version 2.0、Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan HCV test version 1.0 和 version 2.0；Abbott 公司的RealTime HIV-1 assay、RealTime HBV assay、RealTime HCV assay 等，這些試劑均采用自動(dòng)化的樣品處理平臺(tái)以處理待測(cè)樣品提取核酸，大大減少人工操作可能帶來(lái)的誤差，同時(shí)大大節(jié)省了人工，提高了試劑的通量。

近年來(lái)，HBV/HCV/HIV-1 核酸聯(lián)合篩查試劑是一個(gè)研究熱點(diǎn)，多家企業(yè)研發(fā)成功基于實(shí)時(shí)熒光PCR（RT-PCR）的定性篩查試劑。我國(guó)該類(lèi)試劑主要包括： HBV/HCV/HIV分別單管擴(kuò)增的試劑（上海科華生物工程股份有限公司和中山達(dá)安公司）和一管聯(lián)合擴(kuò)增多色熒光 PCR 試劑（上海浩源生物科技有限公司）。

2.1.2以轉(zhuǎn)錄為基礎(chǔ)的擴(kuò)增 以轉(zhuǎn)錄為基礎(chǔ)的擴(kuò)增（transcription-based amplification system，TAS）技術(shù)使用逆轉(zhuǎn)錄酶合成 cDNA，同時(shí)使用 RNA 聚合酶合成 RNA。其基本原理為：設(shè)計(jì) A、B 兩條引物，引物 A 的 3' 末端與待擴(kuò)增的 RNA 靶區(qū)互補(bǔ)，其 5' 端含有 T7 RNA 聚合酶的啟動(dòng)子；逆轉(zhuǎn)錄酶以 A 引物為起點(diǎn)合成 cDNA；引物 B與此 cDNA 的 3' 端互補(bǔ)合成 cDNA 第二鏈；逆轉(zhuǎn)錄酶除具有逆轉(zhuǎn)錄活性外，還有 DNA 聚合酶的活性及 RNase H的活性；T7 RNA 聚合酶又以此雙鏈 DNA 為模板，轉(zhuǎn)錄出與待擴(kuò)增 RNA 一樣的 RNA，這些 RNA 又可作為下輪RNA 擴(kuò)增反應(yīng)的模板。T7 RNA 聚合酶的催化效率很高，理論上一個(gè)模板可轉(zhuǎn)錄 10 ～ 103個(gè) RNA 拷貝，因而反應(yīng)液中待檢 RNA 的數(shù)量以 10 的指數(shù)方式擴(kuò)增。

目前利用該技術(shù)的試劑主要包括生物梅里埃公司的以NASBA 技術(shù)為基礎(chǔ)的NucliSENS HIV-1 QT 和 NucliSENS easyQ HIV-1 試劑以及 GeneProbe 公司的以 TMA 技術(shù)為基礎(chǔ)的 HBV/HCV/HIV-1 檢測(cè)試劑，兩者進(jìn)行核酸擴(kuò)增的不同之處主要在于逆轉(zhuǎn)錄酶，NASBA 技術(shù)采用 AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶，而 TMA 試劑采用莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）逆轉(zhuǎn)錄酶。

NucliSENS HIV-1 QT 試劑采用硅膠提取核酸，運(yùn)用NASBA 技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)利用電化學(xué)發(fā)光技術(shù)進(jìn)行終點(diǎn)檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)，HIV-1 RNA 和內(nèi)標(biāo)采用不同的探針進(jìn)行雜交，擴(kuò)增產(chǎn)物和金屬釕標(biāo)記的探針形成的雜交復(fù)合體磁珠被電極所捕獲，引發(fā)電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。探針發(fā)出的光與擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量成比例，所產(chǎn)生的光的量直接代表著反應(yīng)物中釕的量，其動(dòng)力范圍至少為 6 個(gè)數(shù)量級(jí)。

NucliSENS easyQ HIV-1 試劑則是采用磁性硅顆粒提取核酸，運(yùn)用 NASBA技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)運(yùn)用靶特異的分子信標(biāo)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)，采用兩個(gè)不同的分子信標(biāo)，分別針對(duì) HIV-1 RNA 的擴(kuò)增子和內(nèi)標(biāo) RNA Calibrator 的擴(kuò)增子，兩者均為包含一段可特異結(jié)合 HIV-1 RNA 或內(nèi)標(biāo)RNA Calibrator 序列的 DNA 寡核苷酸。兩個(gè)分子信標(biāo)5' 端分別連接兩個(gè)不同的熒光基團(tuán)，3' 端均連接淬滅基團(tuán)。當(dāng)靶 RNA 互補(bǔ)鏈不存在時(shí)，分子信標(biāo)維持內(nèi)部發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使淬滅基團(tuán)處于非常接近熒光素的位置，熒光信號(hào)被淬滅。當(dāng)分子信標(biāo)與靶序列互補(bǔ)結(jié)合，發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開(kāi)并釋放熒光信號(hào)，系統(tǒng)結(jié)果報(bào)告為存在靶序列[9-10]。熒光信號(hào)的動(dòng)力學(xué)分析可以顯示 HIV-1 RNA 和內(nèi)標(biāo)物 RNA 的轉(zhuǎn)錄速率，因此可以計(jì)算出樣本中 HIV-1 RNA 數(shù)量[11-14]。目前 NucliSENS easyQ HIV-1 試劑在我國(guó)注冊(cè)的共有兩個(gè)版本，v1.1 版本和v2.0 版本，v2.0 版本改進(jìn)了試劑的引物，以增加對(duì)不同基因型 HIV-1 RNA 的包容性[15]。

采用 TMA 技術(shù)的試劑主要包括諾華公司申請(qǐng)注冊(cè)的HBV/HCV/HIV-1 檢測(cè)試劑（Ultra 試劑）。該試劑核酸提取采用結(jié)合有特異的寡核苷酸的磁珠，檢測(cè)時(shí)，采用的是雙動(dòng)力學(xué)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。通過(guò)在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入與 RNA 擴(kuò)增子互補(bǔ)的 AE 分子標(biāo)記的探針（內(nèi)標(biāo)特異性探針標(biāo)記的為閃光發(fā)光分子 Ortho-flroro-AE，病毒特異性探針標(biāo)記的為輝光發(fā)光分子 1-methyl-AE），60 ℃ 孵育可使探針與可能存在的病毒和內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增子進(jìn)行雜交，形成雙鏈分子。由于兩種AE 分子具有不同的發(fā)光特性，閃光型分子在發(fā)光試劑的作用下，會(huì)迅速發(fā)出相對(duì)強(qiáng)烈的光，延續(xù)時(shí)間很短（毫秒級(jí)）光強(qiáng)度會(huì)很快下降；而輝光性分子在發(fā)光試劑作用下，卻可以緩慢發(fā)出一定強(qiáng)度的光，持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)（秒級(jí)），利用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀，在樣品加入發(fā)光試劑后對(duì)樣品管的發(fā)光情況進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)（50 次/2 秒），可以繪制光強(qiáng)度曲線(xiàn)，通過(guò)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，可以對(duì)內(nèi)標(biāo)的結(jié)果及是否存在病毒核酸進(jìn)行判斷。

2.1.3環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增 環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增（loopmediated isothermal amplification，LAMP）是由日本學(xué)者Notomi 等[16]于 2000 年開(kāi)發(fā)的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，根據(jù)針對(duì)不同靶序列設(shè)計(jì)的兩對(duì)特殊的內(nèi)、外引物，即正向內(nèi)側(cè)引物（forward inner primer，F(xiàn)IP）、正向外側(cè)引物（forward outer primer，F(xiàn)3）、反向內(nèi)側(cè)引物（backward inner primer，BIP）、反向外側(cè)引物（backward inner primer，B3），特異性識(shí)別靶序列上的 6 個(gè)獨(dú)立區(qū)域，利用鏈置換 DNA 聚合酶（Bst DNA 聚合酶），在 60 ～ 65 ℃ 溫度范圍啟動(dòng)循環(huán)鏈置換反應(yīng)，內(nèi)引物雜交在目標(biāo) DNA 區(qū)，啟動(dòng)互補(bǔ)鏈合成，導(dǎo)致啞鈴狀 DNA 產(chǎn)生，這種結(jié)構(gòu)很快以自身為模板，進(jìn)行 DNA 合成延伸，形成莖-環(huán) DNA 結(jié)構(gòu)，然后以此結(jié)構(gòu)作為 LAMP 循環(huán)的起始結(jié)構(gòu)。由于內(nèi)引物雜交在莖-環(huán)的環(huán)上，引物鏈置換合成的 DNA 產(chǎn)生一個(gè)有缺口的莖-環(huán) DNA中間媒介，在莖上附有目標(biāo)序列。再通過(guò)外引物，在莖的末端形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，結(jié)果在同一鏈上互補(bǔ)序列周而復(fù)始形成有很多環(huán)的花椰菜結(jié)構(gòu)的莖-環(huán) DNA 混合物（圖1），從而在較短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸的大量有效擴(kuò)增，形成明顯的白色焦磷酸鎂沉淀，可通過(guò)對(duì)濁度的觀(guān)察或加入熒光染料，直接通過(guò)肉眼觀(guān)察顏色變化判定反應(yīng)結(jié)果。該技術(shù)具有高特異性、高效性、快速、簡(jiǎn)便、易檢測(cè)等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)等病原體的檢測(cè)研究。2009 年甲型 H1N1 流感流行時(shí)，國(guó)內(nèi)有個(gè)別企業(yè)即運(yùn)用該技術(shù)研制成功H1N1 核酸診斷試劑。目前國(guó)內(nèi)也有部分企業(yè)運(yùn)用該技術(shù)研制開(kāi)發(fā)一些病原體分子診斷試劑，如結(jié)核桿菌、HBV 等。

圖1 LAMP技術(shù)原理

2.2 信號(hào)擴(kuò)增

該技術(shù)通過(guò)將 Sandwich 雜交技術(shù)和信號(hào)擴(kuò)增技術(shù)偶聯(lián)來(lái)檢測(cè)液態(tài)介質(zhì)中的 RNA 或 DNA。典型的信號(hào)擴(kuò)增技術(shù)主要為 Branched DNA（bDNA）技術(shù)，其核心是由若干組相關(guān)聯(lián)的人工合成寡脫氧核苷酸組成的探針系統(tǒng)。第一組探針?lè)Q為 5' 端標(biāo)記生物素的捕獲探針，可與已預(yù)先包被在介質(zhì)（如微孔板、瓊脂糖珠）上的親和素特異結(jié)合。第二組探針 3' 端一段序列與捕獲探針互補(bǔ)，其余序列與病毒基因組上不同區(qū)域互補(bǔ)。第三組探針與第二組相似，在雜交過(guò)程中，一端與靶分子特異結(jié)合，另一端則與放大探針互補(bǔ)。放大探針（即分枝鏈探針）的一級(jí)結(jié)構(gòu)呈釵狀或疏狀，在釵柄（即主鏈的一端）連接了 45 根由 18 個(gè)寡核苷酸組成的分枝鏈，主鏈的其余部分則是可與第三組探針互補(bǔ)的序列。第五組探針與第四組探針的分支鏈互補(bǔ)，另一端用 AP 修飾。通過(guò) AP 酶促化學(xué)發(fā)光的原理進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)，以發(fā)光信號(hào)的強(qiáng)弱判定待測(cè)標(biāo)本中病毒基因組含量，發(fā)光信號(hào)經(jīng)系列探針逐級(jí)放大，敏感度比 AP 直接加底物顯色后的 OD 值大大提高。bDNA 技術(shù)的核心和關(guān)鍵是探針，其制備是一個(gè)比較復(fù)雜的過(guò)程。

目前應(yīng)用 bDNA 技術(shù)，已經(jīng)上市的試劑主要有西門(mén)子公司 HIV-1 bDNA 3.0試劑。

3 展望

綜上所述，重大傳染病病原體的診斷技術(shù)發(fā)展很快，不斷有新方法以及新技術(shù)應(yīng)用于病原體的診斷，而且目前的發(fā)展趨勢(shì)是將幾種方法優(yōu)化后整合到一種診斷試劑中，使試劑的敏感性以及特異性明顯增強(qiáng)。尤其近幾年新發(fā)或突發(fā)傳染病不斷爆發(fā)，對(duì)診斷試劑簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的要求，又進(jìn)一步促進(jìn)了診斷技術(shù)的發(fā)展。相信隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及實(shí)際需求的提高，現(xiàn)有的診斷技術(shù)也將會(huì)不斷地改進(jìn)和提高，以滿(mǎn)足實(shí)際需要。

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10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2011.06.005

“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2009ZX10004-801）

100050 北京，中國(guó)食品藥品檢定研究院

王佑春，Email：wangyc@nifdc.org.cn

2011-11-14