趙曄，胡占英，佟軍威，趙立勛，蔣建東，張靖溥

·論著·

HCV非結(jié)構(gòu)蛋白NS5A基因的斑馬魚(yú)肝臟表達(dá)模型

趙曄，胡占英，佟軍威，趙立勛，蔣建東，張靖溥

目的建立 HCV 非結(jié)構(gòu)蛋白 NS5A 基因在斑馬魚(yú)肝臟特異表達(dá)的模型，研究 HCV NS5A 的體內(nèi)作用機(jī)制并初步探討 HCV NS5A 對(duì)肝病理標(biāo)志基因表達(dá)的影響。

肝炎病毒屬； 斑馬魚(yú)； 疾病模型，動(dòng)物；基因表達(dá)

www.cmbp.net.cn 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù), 2011, 6(6):437-444

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染引發(fā)的肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）嚴(yán)重威脅著人類(lèi)健康[1-2]。據(jù)WHO 統(tǒng)計(jì)，目前全世界約有 1.7 億人感染 HCV，每年約有 300 萬(wàn) ～ 400 萬(wàn)新增感染者[3]。我國(guó)屬于 HCV 感染的高發(fā)病區(qū)，感染率約為 1.5％ ～3.5％，約有 4000 萬(wàn)感染者[4]。迄今為止，HCV 感染的防治仍缺乏有效的方法。目前臨床用于治療HCV 感染主要的方案是采用聚乙二醇干擾素聯(lián)合利巴韋林，但這種治療手段只針對(duì)不足半數(shù)的患者起作用，治療效果個(gè)體差異性較大，且具有反復(fù)性[5-6]。由于缺少穩(wěn)定可靠的 HCV 感染細(xì)胞模型和動(dòng)物模型，人們對(duì) HCV 致病機(jī)制、抗病毒藥物篩選和疫苗等方面的研究進(jìn)程受到嚴(yán)重阻礙?，F(xiàn)階段只有黑猩猩是公認(rèn)的易感性強(qiáng)的 HCV 天然宿主模型，該模型能夠用于 HCV 整個(gè)生命周期的研究[7]，但是復(fù)雜的倫理問(wèn)題及成本問(wèn)題嚴(yán)重制約了該模型的應(yīng)用。人肝嵌合小鼠模型也被證實(shí)可以感染 HCV[8]，然而，由于該模型操作復(fù)雜，重現(xiàn)性較差，不能大規(guī)模運(yùn)用于科研和藥效篩選。因此，開(kāi)發(fā)新型 HCV 小動(dòng)物模型，成為 HCV 研究中亟待解決的一個(gè)問(wèn)題。

丙型肝炎病毒自 1989 年被 Choo 等[9]首次成功克隆至今，其分子生物學(xué)特性研究取得了很大的發(fā)展。HCV 病毒的基因組為一條線性單股正鏈RNA，全長(zhǎng)約為 9600 個(gè)核苷酸，包含 5′ 端非翻譯區(qū)（5′-non translation region，5′-NTR）、一個(gè)約為9.4 kb 的開(kāi)放式閱讀框（ORF）和 3′ 非翻譯區(qū)（3′-non translation region，3′-NTR）。其中 ORF 編碼一條約含 3000 個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈，經(jīng)過(guò)宿主信號(hào)肽酶和病毒編碼的蛋白酶切割加工后，產(chǎn)生至少 10 種蛋白，包括結(jié)構(gòu)蛋白（核心蛋白 Core、包膜糖蛋白 E1 和 E2、離子通道蛋白 P7）和非結(jié)構(gòu)蛋白（NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A 和NS5B）[10]。其中，核心蛋白 Core 被證實(shí)與肝臟的病理過(guò)程直接相關(guān)，但近年研究表明，NS5A 與病毒的致病過(guò)程和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)也存在密切關(guān)系，包括干擾素抵抗和肝癌形成[11-12]、抑制 ERK MAPK 途徑和抑制 EGF 激活的 p38MAPK 途徑[13]，以及激活 JNK 信號(hào)途徑[14]。NS5A 蛋白還可以通過(guò)多種機(jī)制，抑制細(xì)胞凋亡，與細(xì)胞凋亡調(diào)控相關(guān)的因子 TNF-α，Bcl2 蛋白家族以及 P53 等均被證實(shí)能夠與 NS5A 相互作用[14-16]。NS5A 是一種 447 個(gè)氨基酸的磷蛋白，具有基本的磷酸化（56 kD）和高度磷酸化（58 kD）兩種存在形式，磷酸化位置通常為絲氨酸殘基，少數(shù)蘇氨酸殘基也可被磷酸化[17]。Lemm 等[18]通過(guò) HCV 復(fù)制的細(xì)胞模型篩選出潛在作用于 NS5A、抑制 HCV 復(fù)制的小分子化合物 BMS-824，為 NS5A 作為藥物靶點(diǎn)的研究提供了有力證據(jù)。

近年來(lái)，斑馬魚(yú)作為研究脊椎動(dòng)物發(fā)育的模型已被普遍接受，在醫(yī)藥領(lǐng)域利用斑馬魚(yú)研制疾病模型也正愈來(lái)愈受到重視[19]。斑馬魚(yú)作為新型脊椎類(lèi)模式生物，具有很多優(yōu)于其他傳統(tǒng)模式生物的特點(diǎn)，如個(gè)體小、通體透明、繁殖量大、生長(zhǎng)發(fā)育較快、養(yǎng)殖成本低、操作簡(jiǎn)便等，并具備高通量藥物篩選的優(yōu)勢(shì)。其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程和組織系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與人類(lèi)有較高的相似性[19-20]。在 HCV 研究方面，利用轉(zhuǎn)基因的技術(shù)手段，發(fā)現(xiàn)肝臟毒性化合物硫代乙酰胺（TAA）能夠誘發(fā) Core 轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)產(chǎn)生肝硬化及肝細(xì)胞癌的癥狀[21-22]。該模型為本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用斑馬魚(yú)建立 HCV 非結(jié)構(gòu)蛋白病理模型提供了依據(jù)。

本研究以斑馬魚(yú)作為模式生物，構(gòu)建了肝臟特異表達(dá) HCV NS5A 的基因表達(dá)載體，并首次建立了肝臟表達(dá) HCV NS5A 的斑馬魚(yú)模型，對(duì) NS5A潛在作用的基因進(jìn)行了探討。該模型可以用于HCV NS5A 的體內(nèi)病理機(jī)制的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年斑馬魚(yú) AB 系（Danio rerio，AB line），清華大學(xué)生命科學(xué)院孟安明教授惠贈(zèng)，在（28 ± 1）℃，14 h 光照/10 h 黑暗條件下正常喂養(yǎng)。

1.1.2質(zhì)粒和細(xì)胞系 質(zhì)粒 pDsRed-N1 和pIRES2-DsRed 由杭州師范大學(xué)張亮惠贈(zèng)；HCV J4L6S(1b) 質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存；pMD18-T 和pMD19-T 購(gòu)自日本 Taraka 公司；Huh7 細(xì)胞由本所病毒室惠贈(zèng)。

1.1.3試劑及工具酶 DNA 片段凝膠回收試劑盒、Taq DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶 BamH I、Sal I、Not I、Xho I、Nde I、EcoR I 等、二硫蘇糖醇 （DTT）、dNTP、T4 DNA 連接酶、堿性磷酸酶（CIAP）、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）、均購(gòu)自日本 Takara 公司；Long AMP Taq 聚合酶、限制性內(nèi)切酶 Rsr II，Ase I，BsrG I 購(gòu)自美國(guó) NEB公司；AMV 反轉(zhuǎn)錄酶、Pfu DNA 聚合酶購(gòu)自美國(guó)Promega 公司；DNA 片段凝膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó) Qiagen 公司；抗 HCV NS5A 兔源單克隆抗體購(gòu)自美國(guó) Abcam 公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體 HRP-IgG 購(gòu)自北京中杉金橋公司；DIG RNA Labelling Kit 購(gòu)自瑞典羅氏公司；Supersignal? West Pico 化學(xué)發(fā)光底物購(gòu)自美國(guó) Thermo 公司。

1.1.4儀器 MG96G 型 PCR 擴(kuò)增儀購(gòu)自杭州朗基公司；BINTA 2020D 凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自我國(guó)BINTA 公司；SZX16 型體式顯微鏡與 IX51 型熒光顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司；Basic164-5050型伯樂(lè)電泳儀購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司；500D 型數(shù)碼相機(jī)購(gòu)自日本佳能公司；AlphaEase? FC 成像系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó) Alpha Innotech 公司。

1.2 方法

1.2.1肝臟特異表達(dá) HCV NS5A 載體的構(gòu)建 以本室保存的 HCV J4L6S（1b）質(zhì)粒為模板，在引物中分別引入 Xho I 與 Sal I 的酶切位點(diǎn)，并在其首尾分別加入起始密碼子和終止密碼子，PCR 方法擴(kuò)增 HCV NS5A 的片段。上游引物：5′ AACTGCAGA TGTCCGGCTCGTGGCTAAGGG 3′；下游引物：5′CCAATGCATTGGTTCTGCAGCTAGCAGCAGA CGACATCCT 3′。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性 1 min，55 ℃ 退火 1 min，72 ℃延伸 2 min，循環(huán) 30 次；最后 72 ℃ 延伸 10 min。所得片段大小約為 1400 bp。利用內(nèi)切酶 Xho I、Sal I 將片段切下，連入相同位點(diǎn)酶切后的載體pIRES2-DsRed 中。將斑馬魚(yú)肝脂肪酸結(jié)合蛋白基因（L-FABP）增強(qiáng)子序列（由上海生工公司合成）用Ase I 切出，并與上述構(gòu)建質(zhì)粒在 Ase I 酶切位點(diǎn)拼接，形成肝臟特異表達(dá)的 pFC-5AiR 質(zhì)粒。經(jīng)上海生工科技有限公司測(cè)序鑒定上述基因改造位點(diǎn)和表達(dá)載體拼接正確。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 采用 LipofectamineTM 2000 Reagent 轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行 Huh7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)?；緦?shí)驗(yàn)程序：在 24 孔板進(jìn)行轉(zhuǎn)染，50 μl/孔無(wú)血清DMEM 高糖培養(yǎng)基稀釋 1 μg DNA（根據(jù)需要合并稀釋）；25 μl/孔無(wú)血清 DMEM 高糖培養(yǎng)基稀釋2 μl LipofectamineTM 2000 Reagent（根據(jù)需要合并稀釋），室溫孵育 5 min 后與稀釋的 DNA 合并混勻，室溫孵育 20 min。按照每孔 100 μl DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物溶液加入 80％ ～ 90％ 匯合度且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的 Huh7 細(xì)胞中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃ 培養(yǎng)約 6 h，待細(xì)胞完全貼壁后，吸出轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基；每孔加入 500 μl DMEM 高糖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至 24 h，在顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果。實(shí)驗(yàn)以轉(zhuǎn)染 pIRES2-DsRed 的結(jié)果作為陽(yáng)性對(duì)照，未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組作為陰性對(duì)照。

1.2.3斑馬魚(yú)的顯微注射和熒光顯微鏡觀察 將pFC-5AiR 載體線性化后，注射到 1 ～ 8 細(xì)胞期的斑馬魚(yú)胚胎中，待發(fā)育至 8 dpf（days postfertilization），用熒光顯微鏡在激發(fā)光 556 nm、發(fā)射光 586 nm 下觀察斑馬魚(yú)身體上紅色熒光蛋白的表達(dá)及分布情況。以注射 pIRES2-DsRed 線性片段的斑馬魚(yú)為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.4RT-PCR 檢測(cè) 取注射 pFC-5AiR 后10 dpf 熒光檢測(cè)陽(yáng)性幼魚(yú) 50 條，用 Trizol方法，提取的幼魚(yú)總 RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR，檢測(cè)靶基因NS5A表達(dá)情況。同法，反轉(zhuǎn)錄 6 dpf 和 9 dpf 熒光陽(yáng)性幼魚(yú) cDNA，擴(kuò)增相應(yīng)的肝病理標(biāo)志基因。均以同批野生型幼體為正常對(duì)照組；以β-actin基因的擴(kuò)增為內(nèi)對(duì)照。引物序列見(jiàn)表 1 和表 2。

表1 RT-PCR 所用引物序列Table 1 Primers for RT-PCR

表2 病理標(biāo)志基因引物Table 2 Primers of liver-disease associated marker genes

1.2.5Western blot 檢測(cè) HCV NS5A 蛋白的表達(dá) 用 RIPA 組織裂解液處理 10 dpf 熒光陽(yáng)性幼魚(yú)，每組 100 條，分別提取總蛋白，經(jīng) 12％ SDS-PAGE 電泳分離后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜），用5％ 脫脂奶粉的 TBS（20 mmol/L Tris，pH 7.4，150 mmol/L NaCl）室溫封閉 1 h 或 4 ℃ 封閉過(guò)夜。將該硝酸纖維素膜浸入用 1％ 脫脂奶粉的TBS 液稀釋 1000 倍的 NS5A 抗體中，于 4 ℃ 溫育過(guò)夜，充分漂洗后，加入 HRP 交聯(lián)的羊抗兔二抗，室溫處理 1 h，充分漂洗，加入 Supersignal? West Pico 化學(xué)發(fā)光底物，用 AlphaEase? FC Imaging System成像系統(tǒng)拍照。

1.2.6整體原位雜交 主要參照文獻(xiàn)[23]進(jìn)行。以克隆的 HCVNS5A（nt 6524-6712）基因序列作為模板，利用 DIG RNA Labeling Kit 分別合成NS5A的正、負(fù)鏈 RNA 探針。取 4％ 多聚甲醛固定的 10 dpf 幼魚(yú)，用 1 × PBST 溶液洗去多余的多聚甲醛溶液，分別用蛋白酶 K 和 DNA 酶 I 處理，將幼魚(yú)置于 65 ℃ 水浴進(jìn)行預(yù)雜交 4 h，然后加入合成的 RNA 探針，65 ℃ 水浴雜交過(guò)夜。用0.2 × SSC 溶液洗去未結(jié)合的探針，加入anti-Dig-AP 與 RNA 探針 4 ℃ 結(jié)合過(guò)夜。用 1 × PBST 溶液洗去未結(jié)合的抗體，再加入 BCIP/NBT溶液顯色 30 min，迅速用 1 × PBST 溶液洗去多余的顯色液，在顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果。

1.2.7斑馬魚(yú)肝臟脂肪代謝及纖維化相關(guān)基因及HCV 感染相關(guān)的宿主信號(hào)基因檢測(cè) 對(duì)于肝臟脂肪代謝及纖維化相關(guān)的基因，本文選擇了脂肪細(xì)胞特異性標(biāo)志物脂聯(lián)素（Adiponectin）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、戊二酰輔酶 A 合成酶（HMGS）、3-羥基-3-甲基酰輔酶 A還原酶（HMGR）、低密度脂蛋白受體（LDLR）進(jìn)行了檢測(cè)。通過(guò) RT-PCR 檢測(cè)這些基因的轉(zhuǎn)錄水平，與未注射 pFC-5AiR 的野生型斑馬魚(yú)幼魚(yú)的基因水平進(jìn)行對(duì)比，以β-actin為內(nèi)參。

對(duì)于與丙型肝炎病毒感染相關(guān)的宿主基因，本文選取了精胺基琥珀酸鹽合成酶（Argininosuccinate synthetase，Argsyn）、溶質(zhì)載體家族成員 2（Solute carrier family 2，ScarF2）、致癌基因（Ras-related GTP binding D，Rasgbd）、趨化因子-1（Chemokine-1）、電子傳遞黃素蛋白多肽α（electron transfer flavoprotein alpha polypeptide，ETFA）進(jìn)行了檢測(cè)，以β-actin為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 基因構(gòu)件 pFC-5AiR 的靶基因表達(dá)檢驗(yàn)

為了構(gòu)建可在斑馬魚(yú)肝臟表達(dá)的基因載體，我們將斑馬魚(yú)肝脂肪酸結(jié)合蛋白（L-FABP）基因的增強(qiáng)子序列插入到真核表達(dá)載體 pIRES2-DsRed 的CMV啟動(dòng)子上游，以增強(qiáng)肝組織表達(dá)的選擇性，構(gòu)建了一種紅色熒光蛋白報(bào)告基因DsRed和HCVNS5A基因雙順?lè)醋拥?pFC-5AiR 表達(dá)載體，結(jié)構(gòu)如圖1A 所示。為了檢驗(yàn)該基因構(gòu)件是否可正確進(jìn)行靶基因的表達(dá)，首先在 Huh7 細(xì)胞水平進(jìn)行了DsRed報(bào)告基因的表達(dá)觀察。如圖1B 所示，在熒光顯微鏡下可清晰地觀察到 pFC-5AiR 轉(zhuǎn)染細(xì)胞與陽(yáng)性對(duì)照組均有紅色熒光蛋白的表達(dá)；而未轉(zhuǎn)染的對(duì)照組細(xì)胞則未見(jiàn)紅色熒光。結(jié)果說(shuō)明，所構(gòu)建的 pFC-5AiR 基因表達(dá)載體具有表達(dá)功能。

2.2 HCV NS5A 在斑馬魚(yú)幼體肝臟的表達(dá)

2.2.1報(bào)告基因紅色熒光蛋白DsRed基因在斑馬魚(yú)肝臟的表達(dá) 以 pIRES2-DsRed 為陽(yáng)性對(duì)照組，將注射 pFC-5AiR 的斑馬魚(yú)幼體，在熒光顯微鏡下觀察，如圖2所示，斑馬魚(yú)肝區(qū)出現(xiàn)明顯的紅色熒光。而注射 pIRES2-DsRed 的對(duì)照組中，紅色熒光集中在腹腔，在肝區(qū)未見(jiàn)紅色熒光。這表明L-FABP基因的增強(qiáng)子序列能夠調(diào)控其下游基因在斑馬魚(yú)肝臟的特異表達(dá)。

2.2.2HCVNS5A基因在斑馬魚(yú)體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯 RT-PCR 結(jié)果顯示，注射 pFC-5AiR 質(zhì)粒的斑馬魚(yú)幼體檢測(cè)到較高的NS5A轉(zhuǎn)錄水平（圖3Aa）。同樣，用抗 HCV NS5A 抗體進(jìn)行 western blot 檢測(cè)，檢測(cè)到大小約 56 kD 的蛋白，與 NS5A的大小一致（圖3Ab）。而野生型對(duì)照組中未出現(xiàn)對(duì)應(yīng)的 HCV NS5A 的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和蛋白條帶。結(jié)果表明 pFC-5AiR 表達(dá)構(gòu)件能夠在斑馬魚(yú)幼體中表達(dá) HCV NS5A 蛋白。

圖1 pFC-5AiR 基因表達(dá)載體在 Huh7 細(xì)胞的表達(dá)[A：基因構(gòu)件 pFC-5AiR 結(jié)構(gòu)示意圖；B：熒光顯微鏡觀察基因構(gòu)件pFC-5AiR 熒光蛋白的表達(dá)（400 ×）]Figure 1 Expression of pFC-5AiR in Huh-7 cells [A: Schematic diagram of pFC-5AiR; B: Fluorescence observation of pFC-5AiR expression in Huh-7 cells (400 ×)]

圖2 熒光顯微鏡觀察基因構(gòu)件 pFC-5AiR 在斑馬魚(yú)肝區(qū)特異表達(dá)（8 dpf）Figure 2 Observation of pFC-5AiR injected zebrafish by fluorescence microscopy (8 dpf)

圖3 HCVNS5A基因在斑馬魚(yú)體內(nèi)的表達(dá)與定位Figure 3 Expression and localization of HCVNS5Agene in zebrafish larvae

2.2.3HCVNS5A基因在斑馬魚(yú)肝臟中表達(dá)的定位情況 為了進(jìn)一步驗(yàn)證 pFC-5AiR 中的 HCVNS5A基因在斑馬魚(yú)體內(nèi)的表達(dá)定位情況，采用整體原位雜交技術(shù)，選取在熒光顯微鏡下表達(dá)紅色熒光的 8 dpf 斑馬魚(yú)幼魚(yú)，分別用正義和反義的NS5A探針進(jìn)行原位雜交實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，用NS5A反義鏈探針雜交后在斑馬魚(yú)肝臟區(qū)域可以觀察到陽(yáng)性信號(hào)，而用相應(yīng)的正義探針雜交的對(duì)照組無(wú)陽(yáng)性結(jié)果（圖3B）。說(shuō)明 HCVNS5A基因可在斑馬魚(yú)的肝區(qū)表達(dá)。野生組（WT）也分別用正、反義探針雜交，結(jié)果均為陰性。

2.3 HCVNS5A基因表達(dá)對(duì)斑馬魚(yú)肝臟病理基因表達(dá)的影響

為了探討 HCV NS5A 對(duì)肝臟的病理影響，本研究分析了斑馬魚(yú)胚胎注射 pFC-5AiR 后肝臟脂肪代謝和纖維化的標(biāo)志基因表達(dá)的變化。通過(guò)RT-PCR 檢測(cè)這些基因的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示，Adiponectin、TGF-β、HMGS、HMGR和LDLR在斑馬魚(yú)發(fā)育 6 d 和 9 d 的表達(dá)量較野生型均有所升高，提示 HCVNS5A的表達(dá)影響了斑馬魚(yú)幼魚(yú)肝臟脂代謝水平，可能引發(fā)肝臟內(nèi)脂肪代謝功能異常及肝臟纖維化（圖4）。

圖4 注射 pFC-5AiR 基因構(gòu)件對(duì)斑馬魚(yú)肝臟病理標(biāo)志基因轉(zhuǎn)錄的影響Figure 4 Changes of liver pathological gene expression in 6 dpf and 9 dpf zebrafish injected with pFC-5AiR

另外，本實(shí)驗(yàn)還檢測(cè)了以往文獻(xiàn)報(bào)道的與丙型肝炎病毒感染相關(guān)的宿主信號(hào)基因，結(jié)果顯示，Argsyn的表達(dá)較野生型在 6 dpf 和 9 dpf 時(shí)均顯著升高，ScarF2和Rasgbd在 6 dpf 較野生型更高，而 9 dpf 時(shí)這兩個(gè)基因的表達(dá)較野生型對(duì)照組無(wú)明顯升高趨勢(shì)；Chemokine1和ETFA的表達(dá)量均無(wú)明顯的變化（圖4）。

綜上所述，在 HCV NS5A 模型中，脂代謝及纖維化的相關(guān)因子Adiponectin、TGF-β、HMGR、HMGS，LDLR以及 HCV 感染相關(guān)因子Argsyn、ScarF2、Rasgbd的表達(dá)水平均有不同程度的上調(diào)趨勢(shì)。

3 討論

3.1 HCV 非結(jié)構(gòu)基因NS5A斑馬魚(yú)肝臟表達(dá)模型的鑒定

基因構(gòu)件 pFC-5AiR 質(zhì)粒利用斑馬魚(yú)脂肪酸結(jié)合蛋白增強(qiáng)子（eFABP）與載體CMV啟動(dòng)子配合，共同調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄。這一思路是受到Her 等[24]運(yùn)用eFABP與廣泛性SV40啟動(dòng)子配合的基因構(gòu)件的啟示。本研究通過(guò)熒光顯微鏡觀察到紅色熒光蛋白的表達(dá)均集中在斑馬魚(yú)肝臟區(qū)域，并通過(guò) RT-PCR 和 western blot 方法證實(shí)了 HCV非結(jié)構(gòu)基因NS5A在體內(nèi)的表達(dá)。原位雜交結(jié)果顯示了NS5A基因的肝臟特異性表達(dá)。這是目前已知的第一個(gè) HCV NS5A 的斑馬魚(yú)模型。

3.2 HCV NS5A 表達(dá)導(dǎo)致斑馬魚(yú)模型的病理變化

研究表明 HCV 的感染導(dǎo)致肝臟脂肪變性，可能源于 HCV 利用宿主細(xì)胞脂肪的合成系統(tǒng)，上調(diào)膽固醇和脂肪酸合成相關(guān)的基因表達(dá)[20-21, 25]。羥甲基戊二酰輔酶 A 還原酶（HMGR）和羥甲基戊二酰輔酶 A 合成酶（HMGS）控制膽固醇的合成，兩者在 HCV 感染的患者肝臟中均被證實(shí)上調(diào)[21]。在本研究中對(duì)斑馬魚(yú)胚胎注射 HCVNS5A基因表達(dá)構(gòu)件 pFC-5AiR 后，HMGR與HMGS的轉(zhuǎn)錄水平均被上調(diào)，這與 HCV 感染導(dǎo)致激活宿主細(xì)胞的膽固醇合成途徑相吻合。文獻(xiàn)報(bào)道稱，在 HCV 病毒感染宿主后，宿主細(xì)胞內(nèi) TGF-β 信號(hào)途徑均有所改變，上調(diào)的TGF-β...與肝臟纖維化相關(guān)[25-26]；低密度脂蛋白受體 LDLR 作為 HCV感染的細(xì)胞膜受體[27]，其突變與家族性高膽固醇血癥密切相關(guān)[28]，本研究顯示這兩個(gè)基因在 NS5A 表達(dá)后均有所上調(diào)，推測(cè) NS5A 可能參與了肝脂代謝和纖維化的途徑。

3.3 斑馬魚(yú)肝臟模型的優(yōu)勢(shì)

除了具有胚胎學(xué)和遺傳學(xué)的優(yōu)勢(shì)以外，斑馬魚(yú)的肝臟不同于哺乳動(dòng)物之處在于胚胎期的肝臟不是血管生成的器官，因此肝臟的大小或結(jié)構(gòu)的改變與造血功能障礙導(dǎo)致的變化無(wú)關(guān)。斑馬魚(yú)的肝臟在受精發(fā)育 5 d 后結(jié)構(gòu)和功能趨向成熟，并可以在顯微鏡下直接觀察。Passeri 等[29]利用斑馬魚(yú)幼魚(yú)建立了酒精脂肪肝模型，通過(guò)幼魚(yú)肝臟內(nèi)與脂代謝相關(guān)的細(xì)胞色素 p450 2e1（cyp2e1）、超氧化物歧化酶（SOD）和免疫球蛋白結(jié)合蛋白 BIP 基因表達(dá)量的上調(diào)，證明酒精與肝臟纖維化的關(guān)系。Matthews 等[30]運(yùn)用 S-腺苷水解酶（Ahcy）突變的手段建立了肝臟再生和脂肪變性的斑馬魚(yú) ducttrip突變體，并推斷出腫瘤壞死因子的表達(dá)與 S-腺苷的相關(guān)性。運(yùn)用斑馬魚(yú)突變體基因篩選的方法，Sadler研究小組[19]篩選得到 3 種與肝病相關(guān)的新基因。這些研究為利用斑馬魚(yú)研究肝臟發(fā)病的分子機(jī)理、以及對(duì)肝臟發(fā)育機(jī)制的研究提供了有力證明。本研究建立的 HCV NS5A 斑馬魚(yú)肝臟模型，也為運(yùn)用斑馬魚(yú)模式生物研究 HCV NS5A 致肝臟病變提供了新的思路。

志謝感謝王為先老師提供顯微注射技術(shù)支持；孟杰老師在斑馬魚(yú)材料和管理方面的大力支持。

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A zebrafish model for liver-specific expression of HCV NS5A gene

ZHAO Ye, HU Zhan-ying, TONG Jun-wei, ZHAO Li-xun, JIANG Jian-dong, ZHANG Jing-pu

ObjectiveTo establish a zebrafish model for liver-specific expression of HCV non-structural protein NS5A, and to explore the effects of HCV NS5A on liver pathological marker genes in vivo.MethodsLiver-specific gene expression regulating element zebrafish fatty acid binding protein enhancer (eFABP) sequence and HCV NS5A was cloned. By ligating the eFABP, CMV promoter, NS5A, the IRES of encephalomyocarditis virus (EMCV) and DsRed in turn, a liver-specific gene expression vector pFC-5AiR was constructed. Reporter gene DsRed was detected in Huh7 cells transfected with pFC-5AiR. The linearized vector was subsequently microinjected into zebrafish embryos. Liver-specific expression of pFC-5AiR was detected by observation under fluorescence microscopy and whole mount in situ hybridization methods. Moreover, the transcriptional and translational levels of NS5A were investigated by RT-PCR and western blot. Finally, expression level of some liver pathology associated genes was investigated by RT-PCR.ResultsCell transfection results showed that red fluorescent protein gene DsRed in pFC-5AiR is able to be expressed in Huh7 cells. After microinjection of the vector into zebrafish embryos, red fluorescence was observed to be located in the zebrafish liver under fluorescent microscopy. RT-PCR and western blot results indicated that NS5A is able to be expressed in zebrafish. In situ hybridization results further confirmed that the expression of NS5A in zebrafish liver. In addition, some pathological marker genes, such as Adiponectin, Argsyn, LDLR, TGF-β and HMGR etc., were up-regulated in response to HCV NS5A expression, suggesting that NS5A may be involved in liver lipid metabolism disorder and fibrosis.ConclusionA zebrafish model for HCV NS5A expression in liver has been successfully established. Preliminary investigation shows that HCV NS5A expression in vivo is associated with aberrant genes expression involved in liver pathological process. This model can be used to study the pathological role of HCV NS5A in vivo.

Hepatitis; Zebrafish; Disease models, animal; Gene expression

ZHANG Jing-pu, Email: zjp5577@126.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2011.06.010

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（30772681）；“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)（2009ZX09301-003-6-2）

100050 北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所藥理室

張靖溥，Email：zjp5577@126.com

2011-10-28

方法克隆肝基因表達(dá)調(diào)控序列——斑馬魚(yú)脂肪酸結(jié)合蛋白基因增強(qiáng)子序列（eFABP）和 HCV 非結(jié)構(gòu)蛋白基因NS5A 序列，利用 CMV 啟動(dòng)子序列，構(gòu)建 HCV NS5A 基因和報(bào)告基因綠色熒光蛋白基因 eGFP 在肝臟共表達(dá)的基因構(gòu)件 pFC-5AiR。經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證所建構(gòu)件的報(bào)告基因 DsRed 表達(dá)紅色熒光蛋白后，將該基因構(gòu)件線性化并經(jīng)顯微注射導(dǎo)入斑馬魚(yú)胚胎；通過(guò)熒光顯微鏡觀察和整體原位雜交技術(shù)對(duì)目的基因 NS5A 的表達(dá)進(jìn)行定位，驗(yàn)證其肝臟特異性表達(dá)。采用 RT-PCR 方法和 western blot 方法對(duì)HCV NS5A 基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平進(jìn)行檢測(cè)；并檢測(cè)肝臟病理相關(guān)的標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)錄水平變化。

結(jié)果細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證明基因構(gòu)件 pFC-5AiR 的報(bào)告基因DsRed 能夠在肝癌細(xì)胞 Huh7中表達(dá)；斑馬魚(yú)胚胎注射該基因構(gòu)件后在肝臟能夠觀察到紅色熒光蛋白基因 DsRed的表達(dá)；RT-PCR 和 western blot 結(jié)果顯示 HCV 基因 NS5A能夠在斑馬魚(yú)體內(nèi)正確表達(dá)；原位雜交結(jié)果進(jìn)一步證明了NS5A 的表達(dá)集中在斑馬魚(yú)肝臟內(nèi)。進(jìn)一步 RT-PCR 檢測(cè)表明 HCV NS5A 在斑馬魚(yú)體內(nèi)的表達(dá)可導(dǎo)致一些肝代謝和纖維化相關(guān)基因的上調(diào)，如Adiponectin、LDLR、Argsyn、TGF-β 和 HMGR 等，推測(cè) NS5A 在肝臟脂肪病變和纖維化中具有一定作用。

結(jié)論成功建立了斑馬魚(yú)肝臟表達(dá) HCV NS5A 的模型；初步數(shù)據(jù)表明 HCV NS5A 在斑馬魚(yú)體內(nèi)的表達(dá)與部分肝代謝和纖維化標(biāo)志基因的異常表達(dá)相關(guān)；該模型可以用于HCV NS5A 的體內(nèi)病理機(jī)制的研究。

Author Affiliation:Department of pharmacology, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100050, China

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2011, 6(6):437-444