王 任 王彥波 馮立芳 李學(xué)鵬 李婷婷 勵建榮

魚類為世界上將近2/3的人提供了40%的蛋白質(zhì)，目前全世界人類食用的魚類中接近50%來源于水產(chǎn)養(yǎng)殖。水產(chǎn)養(yǎng)殖的魚類總量在過去的50年里大幅度增長，從20世紀(jì)50年代不到1百萬噸迅速增長到2006年的5.17億噸[1]。但是，隨著研究的深入，魚類安全生產(chǎn)中的諸多問題特別是魚類物種的分子鑒定、品質(zhì)的動態(tài)變化以及鮮度的分子表征等仍需要新的技術(shù)手段來解決。蛋白質(zhì)是幾乎所有生物學(xué)過程的功能單位，而蛋白質(zhì)組是指一個細(xì)胞在特定時間和特定環(huán)境條件下所有蛋白質(zhì)的表達(dá)。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已成為研究包括魚類在內(nèi)的生物系統(tǒng)及其在不同條件下動態(tài)變化的有利工具，在解決有關(guān)魚類生產(chǎn)問題上的研究也取得了顯著成果[2]。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在硬骨魚類安全生產(chǎn)中的應(yīng)用研究清晰表明了環(huán)境對魚肌肉的加工和品質(zhì)的影響[3-5]以及不同物種的魚肌肉在不同貯藏條件下的動態(tài)變化[3,6]。鑒于對魚類水產(chǎn)品的需求日益增長，所以保證和控制其安全生產(chǎn)具有重要的意義[1]。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)將在功能蛋白質(zhì)開發(fā)、魚類病原體檢測、魚類過敏原分析以及品質(zhì)相關(guān)蛋白質(zhì)標(biāo)志物的篩選、魚類品種鑒定等研究領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用[3,7]。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

雙向電泳（2-DE）是蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的基礎(chǔ)方法之一，即先將樣品蛋白質(zhì)根據(jù)其等電點在pH值梯度膠內(nèi)進(jìn)行等電聚焦，按照它們等電點的不同進(jìn)行分離；然后按照它們的相對分子質(zhì)量大小進(jìn)行第二次電泳分離。樣品中的蛋白經(jīng)過等點電和分子質(zhì)量的兩次分離后，可以得到分子的等電點、分子質(zhì)量和表達(dá)量等信息[8]。Unger等[9]考慮使用 MDLC（Multi-dimentionsional HPLC）代替雙向電泳來高分辨率地分離復(fù)雜的蛋白組混合物。而Lubman等[10]開發(fā)了針對全蛋白并結(jié)合了多種液相分離方法的二維分離體系。這些方法的延伸顯著提高了蛋白質(zhì)的分辨率和穩(wěn)定性，促進(jìn)了蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展。20世紀(jì)80年代末，karas[11]和 Fenn[12]先后發(fā)明的基質(zhì)輔助激光電離（MALDI）和電噴霧電離（ESI）技術(shù)可以應(yīng)用到蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析中。質(zhì)譜儀的發(fā)展推進(jìn)了蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用，目前常用于蛋白質(zhì)組學(xué)的商業(yè)化儀器包括MALDI-飛行時間質(zhì)譜儀、ESI-三級四級桿質(zhì)譜儀、ESI-四級離子阱質(zhì)譜儀以及基質(zhì)輔助激光電離-離子阱質(zhì)譜儀、傅里葉回旋共振質(zhì)譜儀、電噴霧-四級-飛行時間質(zhì)譜儀等[8]。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在魚類安全生產(chǎn)中的應(yīng)用

2.1 魚類物種的鑒定

由于魚類加工產(chǎn)品在市場的越來越流行，魚類物種認(rèn)證正迅速成為一個重要的研究領(lǐng)域，具有重要的商業(yè)意義。目前已經(jīng)存在的技術(shù)有以DNA為基礎(chǔ)的物種鑒定[13]，確定原產(chǎn)地的同位素分布技術(shù)[14]等，但都存在一定的問題。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)被證明在這方面是一個強(qiáng)有力的工具，特別是能解決生物安全狀況，養(yǎng)殖的壓力和污染水平等方面的問題[15]。Martinez等[16]研究了利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進(jìn)行魚類等物種的鑒定。由于與基因組不同，蛋白質(zhì)組不是一個靜態(tài)的實體，蛋白質(zhì)會隨著組織和環(huán)境條件的變化而變化，蛋白質(zhì)組學(xué)有可能比基因組學(xué)的方法產(chǎn)生更多的信息，并可表明除了物種鑒定以外的有關(guān)品質(zhì)和組織的信息。因此，雖然以DNA為基礎(chǔ)的方法短期內(nèi)將依舊是鑒定魚類品種的首選方法，但是蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)有可能迅速發(fā)展，并在這個領(lǐng)域體現(xiàn)其商業(yè)價值的用途。較早的研究顯示，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已被確認(rèn)為鑒定魚類物種的潛在方法。20世紀(jì)60年代的一維電泳技術(shù)的開發(fā)，就已經(jīng)被用作鑒定和加工熟食產(chǎn)品的方法[17]，以識別各種不同原料物種[18-19]。最近，利用2-DE為基礎(chǔ)的方法區(qū)分密切相關(guān)的不同物種，如鱈魚和鯧魚類，得到了較好的結(jié)果[20-21]。此外，Lope等[22]研究了3個物種 Mytilus edulis、Mytilus galloprovincialis 和 Mytilus trossulus，發(fā)現(xiàn)可以從凝膠上的原肌球蛋白的差異來區(qū)別Mytilus trossulus與其他兩個物種，而這個差異僅由于一個氨基酸的替換。

2.2 魚肉鮮度品質(zhì)的評價

魚肉鮮度品質(zhì)的評價方法一般分為感官檢驗、物理檢驗、化學(xué)檢驗和微生物檢驗[23]。感官檢驗利用人的嗅覺、視覺、觸覺、味覺來辨別肉品外觀、氣味、色澤、粘度及彈性的改變而鑒定魚肉的質(zhì)量變化[24]。物理檢驗是根據(jù)蛋白質(zhì)分解，低分子物質(zhì)增多，采用導(dǎo)電率、粘度、保水量的變化來衡量肉質(zhì)[25]?；瘜W(xué)檢驗是用定性或定量方法測定蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物，采用非蛋白氮作為鮮度的指示物質(zhì)，如氨、胺類、揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）、三甲胺（TMA）、吲哚等，從而衡量肉的變質(zhì)程度。微生物檢驗則是利用微生物數(shù)量來說明肉類新鮮程度，如細(xì)菌菌落總數(shù)和大腸桿菌群近似數(shù)測定等[26]。結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，可以通過蛋白質(zhì)的分子變化，反映魚肉的鮮度等品質(zhì)。Inger等[27]利用2-DE技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，與新鮮的鱈魚（Gadus morhua）比較，死后鱈魚肌肉有11個蛋白質(zhì)點的豐度發(fā)生了變化，其中8個蛋白質(zhì)點的豐度顯著增加，后續(xù)分析表明這些蛋白質(zhì)點是肌原蛋白、肌漿蛋白、肌肉纖維等肌肉組織的分解產(chǎn)物。由此可見，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對評價魚肉鮮度等品質(zhì)具有重要的現(xiàn)實意義。

2.3 魚肉的生物化學(xué)組成分析

魚類的肌肉除水分以外，主要由蛋白質(zhì)和脂肪組成。其中脂肪由于含有大量易氧化的多不飽和脂肪酸而引起酸敗，尤其是含有較高脂肪的魚類在儲存過程中酸敗會增加，最終導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量下降[28]。然而，脂肪氧化無法解釋魚肉在儲存過程中硬度的增加等性質(zhì)的變化，盡管研究人員對蛋白質(zhì)氧化開展了部分研究，但目前還不清楚是蛋白質(zhì)氧化引起脂肪氧化，還是脂肪氧化引起蛋白質(zhì)氧化[29]。就蛋白質(zhì)氧化的研究方面等[30]采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究了大西洋鱈魚貯藏過程中的幾種蛋白質(zhì)豐度的變化，并提出了魚類死后肌肉蛋白質(zhì)氧化和降解的一般途徑，為蛋白質(zhì)氧化的研究提供了一個新的分析方法。此外，通過整條魚在不同自由基存在的條件下儲存后得出了蛋白質(zhì)氧化的整體水平，并就蛋白質(zhì)氧化/魚肉羰基化的方面通過多種方法進(jìn)行了研究[31-32]。利用二硝基苯肼標(biāo)記的蛋白質(zhì)羰基的2-DE免疫印跡，揭示了包括實際數(shù)量、等電點、易氧化的蛋白質(zhì)的質(zhì)量等羰基化的蛋白質(zhì)信息。這些研究從一定程度上揭示了魚類蛋白質(zhì)氧化水平和分子機(jī)制，從而為分析魚類的生物化學(xué)組成，以最終確定適合人類食用的蛋白質(zhì)的氧化水平和探究污染的魚肉品質(zhì)變化的過程提供參考[33]。

2.4 魚類產(chǎn)品貯藏加工過程變化研究

Love等[34]早在1980年就綜述了影響魚類產(chǎn)品貯藏加工的各種因素。在魚類產(chǎn)品的貯藏加工過程中，魚類品質(zhì)的變化在很大程度上取決于物種自身的理化組成等特性。進(jìn)一步研究表明，一個生物體的表型，包括品質(zhì)特性，是由環(huán)境以及遺傳因素共同決定。Huss等[35]指出，相同魚類產(chǎn)品的內(nèi)部品質(zhì)差異取決于飼喂標(biāo)準(zhǔn)和飼養(yǎng)條件，這些差異會影響其死后的生化過程，而這反過來又影響魚類產(chǎn)品質(zhì)量的變化。在豬、牛等陸地動物中，死前蛋白酶活動已被證明影響肉的品質(zhì)和質(zhì)地[36-37]，這就提示我們魚類死后蛋白質(zhì)分解可能對魚類等水產(chǎn)品品質(zhì)和安全具有相當(dāng)重要的意義。結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的研究表明，當(dāng)以植物蛋白替代鱒魚飼料中的魚粉時，結(jié)果表明飼喂植物蛋白的鱒魚肉硬度更高，汁液較少，顯示了死前的代謝對產(chǎn)品的品質(zhì)和結(jié)構(gòu)的影響[38]。進(jìn)一步研究表明游離氨基酸的數(shù)量和組成也受到了影響，飼喂魚粉的鱒魚魚肉在貯藏期間精氨酸的豐度大大減少，相反飼喂植物蛋白的鱒魚魚肉在儲存過程中精氨酸的豐度大大增加，這表明飼喂不同的蛋白質(zhì)飼料對魚死后蛋白質(zhì)的水解活性同樣具有重要的影響。此外，養(yǎng)殖方式的不同也會導(dǎo)致魚死后體內(nèi)生化反應(yīng)的差異。Martinez等[39]發(fā)現(xiàn)，與野生的鱈魚相比，人工養(yǎng)殖的鱈魚2-DE圖上蛋白質(zhì)分子量在35～45 kDa之間存在顯著差異點。目前蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在魚類產(chǎn)品貯藏加工過程中的研究還處于起步階段，得到的研究結(jié)果有限。然而，鑒于蛋白質(zhì)降解對魚肉品質(zhì)和加工特性有著顯著的影響，借助于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的相關(guān)研究在這一領(lǐng)域內(nèi)將有著相當(dāng)廣闊的前景。

3 研究展望

研究表明，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在探討生活在極端環(huán)境中魚類的生長、發(fā)育和品質(zhì)等特性方面是一個強(qiáng)大的工具，可以提供極端環(huán)境條件下魚類的代謝機(jī)制以及未知的生理功能，并且可能發(fā)現(xiàn)與人體健康相關(guān)的新的蛋白質(zhì)分子。盡管到目前為止，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在魚類生物學(xué)、水產(chǎn)養(yǎng)殖以及水產(chǎn)品品質(zhì)中的應(yīng)用研究仍很有限，但迄今已經(jīng)完成的前期研究結(jié)果證明，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在研究與生理相關(guān)的蛋白質(zhì)分子機(jī)制、魚類生物標(biāo)志物、魚類品質(zhì)變化評價、魚類食品貯藏加工過程品質(zhì)管理以及評估環(huán)境污染對魚類安全生產(chǎn)的影響等方面均具有潛在的應(yīng)用價值和發(fā)展前景。此外，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，部分研究已經(jīng)能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)組學(xué)技術(shù)與其他基因組學(xué)技術(shù)、代謝組學(xué)技術(shù)等現(xiàn)代方法結(jié)合起來，為魚類安全生產(chǎn)中的研究提供更為廣泛的信息。鑒于此，預(yù)計在未來一段時間內(nèi)，現(xiàn)有的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)以及其他相關(guān)的新興技術(shù)將更加廣泛地應(yīng)用于魚類生物學(xué)和安全生產(chǎn)的研究。

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