(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院，北京 100053)

碳酸酐酶(CA)是一組含鋅的金屬酶，廣泛參與機(jī)體的多種生理過程［1，2］。研究表明，抗CAⅡ和抗CAⅣ抗體參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡、自身免疫性胰腺炎、硬皮病、子宮內(nèi)膜異位癥等疾病的發(fā)生發(fā)展［3～6］。但國內(nèi)尚無自身免疫疾病患者和健康人群的血清CAⅢ抗體水平的報(bào)道。2009年5月～2010年2月進(jìn)行本研究，著眼于建立適用于臨床的抗CAⅢ抗體的ELISA檢測方法，并對健康人群和自身免疫疾病患者抗CAⅢ抗體水平進(jìn)行初步調(diào)查。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者40例，男7例、女33例，年齡20～35歲、平均29歲;皮肌炎患者9例，男3例、女6例，年齡25～35歲、平均31歲;高血壓腎病患者30例，男女各半，年齡65～75歲、平均70歲;2型糖尿病腎病患者30例，男18例、女12例，年齡65～75歲、平均68歲;選取性別、年齡匹配無上述疾病的健康人為對照。所有受試者均知情同意。按照已建立的方法分別使用小牛血清和健康人血清為陰性對照，對上述人群血清的抗CAⅢ抗體水平進(jìn)行測定，根據(jù)健康對照測定均值+2SD 確定 cutoff值［6］。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 酶標(biāo)板，Costar;洗板機(jī)，雷杜RT-3000;酶標(biāo)儀，雷杜RT-6000。重組人CAⅢ(33.9 kDa，貨號(hào):ab82823)，abcam公司;小鼠抗人 CAⅢ單克隆抗體(貨號(hào):ab54913)，abcam公司;抗CAⅣ抗體(貨號(hào):sc-25598)，Santa Cruz公司;HRP標(biāo)記的二抗、四甲基聯(lián)苯胺，KPL公司;Tween-20、小牛血清、H2O2，上海生工;其他為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 ELISA操作步驟 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使用包被緩沖液稀釋CAⅢ至5 μg/ml;包被的酶標(biāo)板用保鮮膜封好，置4℃過夜;使用洗滌液緩沖液清洗5次，每孔加入封阻緩沖液，于室溫下放置30 min，用洗滌液洗板5次;每孔加入100 μl經(jīng)1∶50稀釋后的血清樣品及陰性對照，室溫(20℃)放置1 h，洗滌緩沖液洗板5次;每孔加入封閉緩沖液稀釋的二抗100 μl，室溫放置 1 h;每孔中加入 100 μl底物緩沖溶液，室溫避光反應(yīng)30 min;每孔加入25 μl終止液，讀取450 nm處(參考波長630 nm)OD值。

1.3.2 抗體工作濃度的確定 抗原包被濃度為5 μg/ml，標(biāo)準(zhǔn)樣品按照 1∶1 000～1∶32 000 倍比稀釋，在每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品倍比稀釋孔中分別使用不同稀釋倍數(shù)(1∶500～1∶8 000)的酶標(biāo)二抗，其他實(shí)驗(yàn)條件一致，比較各孔450 nm處(參考波長630 nm)OD值，確定酶標(biāo)二抗的稀釋倍數(shù)，最后建立標(biāo)準(zhǔn)方程。

1.3.3 方法學(xué)考證 精密度:取高(OD=3.0)、中(OD=1.2)、低(OD=0.5)3 個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，每份樣品同批測定20次，計(jì)算批內(nèi)精密度;每份樣品每天測定1次，連續(xù)測20 d，計(jì)算批間精密度。穩(wěn)定性［7］:①試劑穩(wěn)定性:新鮮配制的試劑置4℃冰箱，分別于第2、4、8、15和30天測定同一中值標(biāo)準(zhǔn)品，計(jì)算變異系數(shù);②標(biāo)本穩(wěn)定性:3份OD中值患者血清分裝為2組，第1組保存于室溫(約20℃)，并于第2、6、12小時(shí)進(jìn)行測定，第2組保存于4℃，于第6、12、24 小時(shí)進(jìn)行測定。靈敏度［8］:使用公式OD靈敏度=OD零劑量+t0.95×SD/n 計(jì)算 95%可信區(qū)間下的靈敏度(n=20)?；厥諏?shí)驗(yàn):測定中值抗CAⅢ抗體標(biāo)準(zhǔn)品，后于該標(biāo)準(zhǔn)品中加入高濃度抗CAⅢ抗體溶液，使其終濃度計(jì)算值為中值標(biāo)準(zhǔn)品的110%，根據(jù)前后測定結(jié)果計(jì)算回收率。干擾實(shí)驗(yàn):標(biāo)本性狀的干擾:分別使用正常、乳糜、黃疸及溶血的血清標(biāo)本(排除自身免疫性疾病)稀釋抗CAⅢ抗體標(biāo)準(zhǔn)品，使用已建立的方法分別對其進(jìn)行檢測;CA同工酶的干擾:分別對抗CAⅣ抗體(1∶100稀釋)及抗CAⅣ抗體中值標(biāo)準(zhǔn)品與抗CAⅢ抗體(最終稀釋倍數(shù)為1∶100)的混合物進(jìn)行檢測。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.0軟件進(jìn)行One-Way ANOVA分析，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的建立 方陣滴定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OD值在酶標(biāo)二抗稀釋倍率為1∶2 000～1∶4 000時(shí)開始出現(xiàn)明顯變化，考慮其OD值應(yīng)大小適中，選擇酶標(biāo)二抗的稀釋倍數(shù)為1∶2 000。在上述反應(yīng)條件下，以抗CAⅢ抗體標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋倍數(shù)(T)的自然對數(shù)(logeT)為橫軸，以O(shè)D值A(chǔ)為縱軸，使用SPSS11.0軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示logeT與其OD值之間存在良好的線性關(guān)系，R2=0.95，標(biāo)準(zhǔn)方程為:Y= －0.13logeT+1.59。

2.2 方法學(xué)評價(jià) 3個(gè)水平標(biāo)準(zhǔn)品的批內(nèi)精密度為 5.6%～6.7%、平均 6.2%，批間精密度為 7.5%～8.8%、平均 8.2%。靈敏度為 0.025。試劑穩(wěn)定性和標(biāo)本穩(wěn)定性試驗(yàn)中，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)測定結(jié)果之間的變異程度均低于10%。經(jīng)測定并計(jì)算，回收率為106%。血紅蛋白濃度為12 g/L的溶血標(biāo)本、甘油三酯為23.5 mmol/L的乳糜標(biāo)本、膽紅素為571 μmol/L的黃疸標(biāo)本及抗CAⅣ抗體均不能對本實(shí)驗(yàn)造成顯著影響。

2.3 臨床樣本檢測應(yīng)用 分別使用小牛血清和健康人血清作陰性對照，前者的測定結(jié)果略低但不存在顯著性差異，為減少基質(zhì)效應(yīng)的影響，對患者標(biāo)本進(jìn)行測定時(shí)均使用健康人血清為陰性對照。糖尿病腎病組的血清抗CAⅢ抗體水平(0.33±0.06)高于健康對照組(0.03 ±0.02)(P ＜0.05);高血壓腎病組的血清抗CAⅢ抗體水平(0.04±0.02)略高于健康對照組(0.03±0.02)，但無顯著性差異(P＞0.05)。系統(tǒng)性紅斑狼瘡組的血清抗CAⅢ抗體水平(1.12 ±0.19)高于健康對照組(0.04 ±0.01)(P＜0.05)?？笴AⅢ抗體陽性率在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者為43%，糖尿病腎病患者為18%，皮肌炎、高血壓腎病患者和健康對照未出現(xiàn)陽性結(jié)果。

3 討論

自身抗體的檢測在很多疾病尤其是自身免疫性疾病的診治中的重要性日益凸顯，CAⅢ抗體作為自身抗體的一種已經(jīng)引起了很多科研工作者的重視［2］。但對其進(jìn)行的研究大多還基于免疫印記、原位雜交等［3，9］，這些方法雖然靈敏可靠但操作復(fù)雜，成本偏高，不能廣泛應(yīng)用。目前國內(nèi)并沒有對CAⅢ抗體檢測的試劑盒，本研究成功建立了人血清CAⅢ抗體的ELISA檢測方法，其精密度、穩(wěn)定性、抗干擾能力等技術(shù)指標(biāo)均能滿足ELISA常規(guī)檢測的要求，且操作方法簡單，檢測結(jié)果穩(wěn)定，所用試劑市場均有銷售，檢測成本與常規(guī)ELISA檢測類似，可上機(jī)進(jìn)行大批量分析，具備進(jìn)入臨床應(yīng)用的潛質(zhì)。

已有研究表明，抗CAⅢ抗體可出現(xiàn)于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者［9］，抗CAⅠ、CAⅡ和CAⅣ抗體可出現(xiàn)于自身免疫性胰腺炎患者［6］;人體內(nèi)CAⅡ抗體與CAⅡ的結(jié)合可使CA發(fā)生空間構(gòu)象改變并影響酶的活性位點(diǎn)，導(dǎo)致酶活性降低30%以上［5］，而抑制CA的功能可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)環(huán)境紊亂和功能障礙，甚至引起細(xì)胞內(nèi)酸中毒［10］。人體內(nèi)如果累積過多的抗CAⅢ抗體必然會(huì)與CAⅢ發(fā)生免疫反應(yīng)，干擾CA的正常功能，進(jìn)而可能對疾病的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生不利影響。

本研究結(jié)果提示，抗CAⅢ抗體可出現(xiàn)于系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者和2型糖尿病腎病患者。由于細(xì)胞和體液免疫功能障礙，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者體內(nèi)產(chǎn)生多種自身抗體，約50%患者有腎臟疾病臨床表現(xiàn)，大部分患者在某一階段發(fā)生一項(xiàng)或幾項(xiàng)血液系統(tǒng)異常，CAⅢ在腎臟和紅細(xì)胞中的含量較豐富，其自身抗體很有可能參與了本病的發(fā)生發(fā)展［11］。皮肌炎的主要特點(diǎn)是肌肉和皮膚受累，較少累及CAⅢ含量較豐富的血液系統(tǒng)和腎臟，這可能是皮肌炎患者血清抗CAⅢ抗體與健康對照無顯著性差異的原因。2型糖尿病腎病是2型糖尿病的重要慢性并發(fā)癥之一，自身免疫在2型糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中占據(jù)重要作用，細(xì)胞外基質(zhì)在腎小球、腎小管聚集導(dǎo)致的腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化是其特征性病理改變。研究表明［5］，當(dāng)免疫復(fù)合物在腎單位沉積時(shí)，能刺激浸潤的淋巴細(xì)胞及腎小球細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，包括補(bǔ)體、生長因子、血管活性物質(zhì)、細(xì)胞活素類物質(zhì)等，從而促進(jìn)2型糖尿病腎病的進(jìn)展。本研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病腎病患者血清中抗CAⅢ抗體濃度與健康對照組相比有顯著差異，且與國外使用免疫印記方法進(jìn)行的測定具有相同的變化趨勢［12］，提示抗CAⅢ抗體可能參與了本病的發(fā)生發(fā)展。高血壓腎病患者血清的抗CAⅢ抗體水平與對照組無顯著性差異，這一結(jié)果從側(cè)面印證了糖尿病腎病具備自身免疫性疾病的特點(diǎn)，因此使用本法對同時(shí)患有糖尿病和高血壓的患者進(jìn)行監(jiān)測可能對確定其腎臟損傷的病因提供幫助。在健康對照組實(shí)驗(yàn)中，年齡較高受試者的抗CAⅢ抗體水平略高于低齡受試者，但不存在顯著性差異，這種現(xiàn)象可能是增齡性的自身抗體水平升高所致。

目前國內(nèi)外已有越來越多的學(xué)者關(guān)注CA自身抗體的研究，并在多種疾病中發(fā)現(xiàn)其自身抗體，但這些研究大都處于臨床觀察階段，各型CA同工酶自身抗體的疾病特異性、對相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展的影響及其機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

［1］Linser PJ，Smith KE，Seron TJ，et al.Carbonic anhydrases and anion transport in mosquito midgut pH regulation ［J］.J Exp Biol，2009，212(Pt 11):1662-1671.

［2］Sánchez-Castanón M，de las Heras-Castano G，López-Hoyos M.Autoimmune pancreatitis:an underdiagnosed autoimmune disease with clinical，imaging and serological features ［J］.Autoimmun Rev，2010，9(4):237-240.

［3］Hardt PD，Ewald N，Brockling K，et al.Distinct autoantibodies against exocrine pancreatic antigens in European patients with type 1 diabetes mellitus and non-alcoholic chronic pancreatitis［J］.JOP，2008，9(6):683-689.

［4］Hosoda H，Okawa-Takatsuji M，Shinmura W，et al.Potential for differential diagnosis of autoimmune pancreatitis and pancreatic cancer using carbonic anhydraseⅡ antibody［J］.Pancreas，2008，37(1):e1-7.

［5］Ono M，Watanabe KA.Study of anti-carbonic anhydraseⅡ antibodies in rheumatic autoimmune diseases［J］.Dermatol Sci，1999，21(3):183-186.

［6］Nishimori I，Miyaji E，Morimoto K，et al.Serum antibodies to carbonic anhydraseⅣ in patients with autoimmune pancreatitis［J］.Gut，2005，54(2):274-281.

［7］Bidlingmaier M，Suhr J，Ernst A，et al.High-sensitivity chemiluminescence immunoassays for detection of growth hormone doping in sports［J］.Clin Chem，2009，55(3):445-453.

［8］李金明.臨床酶免疫測定技術(shù)［M］.北京:人民軍醫(yī)出版社，2005.

［9］Robert-Pachot M，Desbos A，Moreira A，et al.A new target for autoantibodies in patients with rheumatoid arthritis［J］.Ann N Y Acad Sci，2007，1108(1):382-391.

［10］張蓬，李學(xué)軍.碳酸酐酶的生物學(xué)研究進(jìn)展［J］.生理科學(xué)進(jìn)展，1997，28(4):359-361.

［11］汪鶯昱，朱漢威，蔣更如.腎小球系膜細(xì)胞表面抗原及其抗體的研究進(jìn)展［J］.國外醫(yī)學(xué):泌尿系統(tǒng)分冊，2004，24(4):503-506.

［12］Grazyna A，Landon K.Autoimmunity against carbonic anhydraseⅡ affects retinal cell functions in autoimmune retinopathy［J］.J Autoimmun，2009，32(2):133-139.