孫 寧，葛春林

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，沈陽110005)

脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性菌(G-)細胞壁的主要成分，它能被Toll樣受體4(TLR4)所識別，并且TLR4是LPS跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要受體。已有研究表明，TLR4的表達在發(fā)生胰腺炎的胰腺中存在上調(diào)趨勢，且急性壞死性胰腺炎時，肝、肺等組織中TLR4 mRNA的表達明顯增強［1］。所以，在SIRS和早期MODS，TLR4受體的激動即可被認為是誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)失控的最初因素之一。本文主要就髓樣分化蛋白2(MD2)在TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的重要作用，及在其誘導(dǎo)下產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)對重癥急性胰腺炎(SAP)的影響和臨床意義加以闡述。

1 MD2的發(fā)現(xiàn)及結(jié)構(gòu)特點

1999年，Miyake發(fā)現(xiàn)了一種能夠協(xié)同TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白質(zhì)——MD2，它由160個氨基酸組成，是一種分泌型糖蛋白，因為其N端有一段由16個氨基酸殘基組成的信號肽，使其具有分泌功能。除此之外，MD2還可以和TLR4在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/高爾基體結(jié)合，或直接可以表達于細胞表面，不僅能與TLR胞外區(qū)結(jié)合促進細胞對LPS的反應(yīng)，而且還能直接與LPS結(jié)合，引發(fā)炎癥反應(yīng)，是TLR4的重要輔助分子。

國內(nèi)外均有研究證明，MD2的氨基酸序列上有兩個糖基化結(jié)合位點，分別是Asn26和Asn114，雖然當糖基化位點突變后，MD2仍可表達于細胞表面并與TLR4結(jié)合，但對于輔助TLR4引起的核因子κB(NF-κB)的活化功能卻明顯減弱，所以MD2糖基化位點突變的細胞在LPS刺激后只能引起細胞輕度的活化［2］。

2 MD2與TLR4、LPS的聯(lián)系

2.1 與TLR4、LPS的結(jié)合 有研究證明，MD2存在TLR4和LPS兩個相對獨立的結(jié)合區(qū)，分別是C2末端的LPS結(jié)合區(qū)，N2末端的TLR4結(jié)合區(qū)［3］。在前者，MD2可以直接與LPS結(jié)合形成MD2-LPS復(fù)合體，再與TLR4結(jié)合，形成MD2-LPSTLR4復(fù)合體;在后者，MD2與TLR4結(jié)合形成MD2-TLR4復(fù)合體后，在CD14呈遞下，與LPS結(jié)合，形成MD2-TLR4-LPS復(fù)合體。這就說明:MD2可以直接與LPS結(jié)合，但如果TLR4要與LPS結(jié)合，則另需要先與MD2結(jié)合形成復(fù)合物并要經(jīng)過 CD14轉(zhuǎn)導(dǎo)［3］。

近年來的研究還發(fā)現(xiàn):MD2與TLR4的胞外區(qū)結(jié)合，定位于細胞表面，增加TLR4對LPS的反應(yīng)性并增強信號轉(zhuǎn)導(dǎo)強調(diào)，然而僅轉(zhuǎn)染TLR4或是TLR4-CD14的細胞，均未發(fā)現(xiàn)TLR4與LPS結(jié)合［4］，另外，轉(zhuǎn)染了 TLR4基因的 HEK293細胞也不能被LPS-CD14激活，也不能引起NF-κB的活化?？墒侨绻擬D2-TLR4-CD14共同表達時，就能檢測到TLR4與LPS結(jié)合，同樣也發(fā)現(xiàn):當轉(zhuǎn)染了MD2和 TLR4基因后的HEK293細胞在受到LPS-CD14刺激時出現(xiàn)NF-κB的活化［5］，活化后的NF-κB能夠引起前炎癥基因轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致級聯(lián)反應(yīng)擴大，最終造成胰腺持續(xù)壞死和多臟器功能障礙。

這些都說明了 TLR4不能與 LPS直接結(jié)合，MD2是TLR4必需的輔助因子，TLR4必須在MD2的參與和CD14的呈遞下，形成MD2-TLR4-CD14復(fù)合物后，才能進一步形成MD2-LPS-TLR4復(fù)合物，從而介導(dǎo)免疫信號傳遞，誘發(fā)炎癥反應(yīng)。

2.2 促進TLR4的表達 TLR4必須有MD2的幫助才能識別LPS，單獨轉(zhuǎn)染TLR4的HEK293細胞不能產(chǎn)生反應(yīng)，而合并有MD2轉(zhuǎn)染的細胞則顯示出很好的反應(yīng)性［6］，說明MD2能夠促進TLR4的表達。MD2的基本功能之一就是與TLR4結(jié)合，形成MD2-TLR4，這種復(fù)合體為TLR4提供了足夠的結(jié)合位點，從而易化了TLR4的級聯(lián)反應(yīng)，并且當MD2與TLR4共同轉(zhuǎn)染時，在細胞內(nèi)的TLR4能與聚合程度不同的MD2寡聚體形成特異性結(jié)合，多余的MD2分泌入血，在液相中仍然具有活性，使MD2可以產(chǎn)生遠程調(diào)控作用［7］。

2.3 影響TLR4在細胞內(nèi)的分布 Nagai等研究發(fā)現(xiàn):MD2能夠影響TLR4在細胞內(nèi)的分布。將TLR4轉(zhuǎn)染至野生型小鼠胚胎成纖維細胞(EF)后，不僅在細胞內(nèi)有表達，而且在細胞表面也有表達;同時，對照將TLR4轉(zhuǎn)染至MD2基因缺如的小鼠EF，則只能在細胞內(nèi)檢測到TLR4的表達，細胞表面幾乎無TLR4表達。

2.4 對LPS信號的調(diào)控 已有大量研究證明，LPS能夠直接與MD2結(jié)合并發(fā)揮作用，而Hyakushima等［6］的研究也證明LPS不能與TLR4單獨結(jié)合，需要和細胞表面的MD2-TLR4復(fù)合體作用，盡管TLR4與LPS作用后，會發(fā)生配體依賴的聚合反應(yīng)，但是，這種配體依賴的TLR4低聚化和細胞表面MD2-LPS-TLR4復(fù)合物的形成幾乎同步，如果缺乏MD2，則這種低聚化就不能發(fā)生。

3 MD2在SAP中的表達與組織損傷

通過上述資料我們可以了解到，MD2除了能夠通過促進TLR4的表達、促進TLR4轉(zhuǎn)導(dǎo)LPS信號而對SAP時釋放炎癥介質(zhì)產(chǎn)生重要影響外，在一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程中，MD2能夠促進NF-κB的活化，這也是影響SAP發(fā)生發(fā)展的另一重要因素。NF-κB是一類能與多種細胞因子(TNF-α、IL-1、IL-6)、黏附分子基因啟動子部位的κB位點結(jié)合并增強這些基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。目前已有多數(shù)研究表明NF-κB參與了SAP的發(fā)病，那么通過抑制MD2參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從另一方面間接抑制NF-κB的活化，則也可以阻斷促炎因子的產(chǎn)生，對SAP起到治療和保護作用。

在正常情況下，機體能夠通過調(diào)節(jié)MD2的表達水平來調(diào)控LPS信號，但是如果機體內(nèi)出現(xiàn)如TNF-α和(或)IFN-γ這些炎癥因子能夠刺激MD2表達上調(diào)時，LPS信號就可以通過TLR4-MD2復(fù)合體傳遞，活化NF-κB從而引起下游信號的瀑布反應(yīng)，產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)，造成組織損傷和器官功能障礙。

由于胰腺炎早期主要的病理生理改變是胰腺組織的自身損傷，而這種無菌性炎癥首先激活機體非特異性免疫系統(tǒng)，并通過各種模式識別受體識別病原體相關(guān)分子模式，活化單核巨噬細胞系統(tǒng)，從而導(dǎo)致細胞內(nèi)多種信號反應(yīng)，釋放比如 IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α 等介質(zhì)，刺激 MD2 的表達上調(diào)。而當病情不斷進展至SAP時，胰腺組織開始由最初的充血、水腫發(fā)展至出血、壞死，進而并發(fā)胰腺本身及周圍組織的感染(主要是G-菌感染)，啟動特異免疫系統(tǒng)，再次刺激MD2的表達上調(diào)，機體分泌大量炎癥介質(zhì)，級聯(lián)反應(yīng)擴大。這些充分說明了MD2在SAP早期，甚至急性胰腺炎時，就已經(jīng)參與到這一系列抗感染免疫中，并發(fā)揮重要的作用。

4 阻斷MD2的表達實現(xiàn)SAP的早期干預(yù)

既然MD2能夠通過促進TLR4的表達、影響TLR4的分布以及促進TLR4與LPS結(jié)合，活化NF-κB等輔助手段刺激機體免疫細胞分泌炎癥介質(zhì)，那么，能否通過阻斷MD2的表達來預(yù)防或干預(yù)SAP的發(fā)生、發(fā)展呢?已有研究證明:能與LPS競爭結(jié)合MD2的物質(zhì)能抑制LPS信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，比如可溶性的TLR4(sTLR4)、可溶性的MD2(sMD2)及LPS的類似物，均能達到抑制炎癥介質(zhì)產(chǎn)生和釋放的目的，起到減輕炎癥的作用。

Rallabhandi等［8］研究了MD2的表達量對TLR4及LPS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，發(fā)現(xiàn)在HEK293細胞中，隨著MD2轉(zhuǎn)染量的增加，TLR4的表達量也逐漸增加。而達到峰值后，繼續(xù)增加MD2劑量，TLR4的表達反而不再增加，NF-κB活性卻反而降低。說明一定量的MD2可促進TLR4的表達，增強TLR4對LPS的敏感性，但過量的MD2和TLR4-MD2競爭性結(jié)合LPS，從而生成MD2-LPS及MD2-TLR4-LPS兩種復(fù)合體，與單一復(fù)合體存在時相比MD2-LPS和MD2-TLR4-LPS的反應(yīng)性都很低，而這就在一定程度上抑制LPS信號激活。

另外，在LPS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，TLR4和MD2結(jié)合是重要的一步，可以通過阻止TLR4和MD2結(jié)合，達到阻止信號激活的目的。已有研究發(fā)現(xiàn)，可溶性的CD14(sCD14)，同樣能夠呈遞 MD2-TLR4與 LPS結(jié)合，形成 MD2-TLR4-sCD14-LPS復(fù)合體。但這種復(fù)合體不能激活正常的細胞反應(yīng)。所以若能增加sCD14的量，就能夠抑制細胞信號的激活，同樣可以起到減輕炎癥反應(yīng)的作用。

5 未來研究方向

近年來國內(nèi)外對于SAP的研究多集中于如何在SAP發(fā)病早期即能對其進行正確的判斷以及根據(jù)實際情況制定個體化治療方案，如基本的抗感染、抑制胰酶分泌，以及腹腔灌洗和(或)動脈灌注療法、持續(xù)的血液透析濾過，甚至腹膜后引流、胰腺及其周圍壞死組織清除術(shù)等治療方案上。但是隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，對于SAP在發(fā)生、發(fā)展及其發(fā)生機制特別是其病理生理變化再次成為人們關(guān)注的對象。所以，探究在SAP發(fā)生、發(fā)展、惡化這一系列環(huán)節(jié)中，到底有哪些細胞因子參與其中，發(fā)揮了什么作用，通過什么途徑發(fā)揮作用，通過什么干預(yù)可以終止這些反應(yīng)的傳導(dǎo)，進而制定出在SAP早期即可以采取干預(yù)手段，就可以減少因為腹腔灌洗或是動脈灌注、手術(shù)清創(chuàng)等有創(chuàng)性治療來給患者帶來的痛苦。

MD2的發(fā)現(xiàn)和其功能的研究，使我們逐步認識到了它能輔助TLR4對LPS的識別。但是仍有許多問題值得我們進行更深入的研究:對于LPS、TLR4和MD2三者之間更加深層的關(guān)系;為什么TLR4不能直接與LPS結(jié)合，而當MD2與TLR4結(jié)合后，是通過改變TLR4的空間構(gòu)象還是利用自身的結(jié)構(gòu)特點，使其更易于與LPS-CD14結(jié)合;既然大量的MD2可以反過來抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生，那么作為維持機體穩(wěn)態(tài)的一種機制，它究竟在SAP的哪一階段被啟動等等。所以把MD2作為干預(yù)SAP早期炎癥反應(yīng)的靶點，可能會成為一個新的研究熱點，希望能夠通過抑制LPS信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，減少甚至抑制炎性介質(zhì)的釋放，從而可以避免炎癥反應(yīng)的級聯(lián)擴大，達到干預(yù)SAP進展惡化的目的。

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