蔡賢華，吳璐鋒，劉曦明，徐 峰，黃衛(wèi)兵，汪國(guó)棟，魏世俊

骨折并發(fā)脂肪栓塞綜合征(fat embolism syndrome，F(xiàn)ES)的救治相當(dāng)困難，目前尚未取得明顯突破，預(yù)防一直是FES研究的重點(diǎn)，藥物逐漸成為預(yù)防FES的重要措施之一［1－4］。在早期固定骨折的基礎(chǔ)上，單一藥物(如地塞米松等)已顯示出一定的預(yù)防效果［1－5］，但FES仍有一定的發(fā)生率，說明FES發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性。而低分子右旋糖酐加地塞米松聯(lián)合應(yīng)用臨床觀察顯示其預(yù)防FES的療效較兩藥單用強(qiáng)［5］，但無相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)。因此，本研究以靜脈注射油酸法建立大鼠FES動(dòng)物模型，觀察低分子右旋糖酐、地塞米松及其聯(lián)用對(duì)FES的預(yù)防效果，旨在探討這些藥物預(yù)防FES的作用及其機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

材料與方法

1 材料

健康雄性Wistar大鼠(廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提供)，體重300～320g。油酸注射液(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，低分子右旋糖酐(武漢濱湖雙鶴藥業(yè))，地塞米松(湖北天藥藥業(yè)股份有限公司)，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNFα)，髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所)，ELISA試劑盒(武漢博士德生物科技有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

大鼠80只，飼養(yǎng)2周后，隨機(jī)分為4組:低分子右旋糖酐組(A組)、地塞米松組(B組)、地塞米松及低分子右旋糖酐聯(lián)用組(C組)、空白對(duì)照組(D組)，每組20只。

采用10%水合氯醛腹腔注射(0.3ml/100g)麻醉后，經(jīng)大鼠尾靜脈分別注射相應(yīng)藥物:低分子右旋糖酐20ml/kg加油酸0.2ml/kg(A組)、地塞米松35mg/kg加油酸0.2ml/kg(B組)、低分子右旋糖酐20ml/kg加地塞米松25mg/kg加油酸0.2ml/kg(C組)、油酸0.2ml/kg(D組)。于注射后1、2、3、4小時(shí)隨機(jī)取5只大鼠行動(dòng)脈血氧分壓(PaO2)測(cè)定，然后放血法處死大鼠，取肺組織進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

3 PaO2檢查

于注射前及注射后各時(shí)間點(diǎn)，經(jīng)頸動(dòng)脈抽取血液0.3ml，立即行PaO2測(cè)定。

4 MPO、TNF-α測(cè)定

于各時(shí)間點(diǎn)取肺組織，用等滲鹽水為遞質(zhì)制成20%勻漿，隨機(jī)分為兩部分。一部分按MPO測(cè)試盒說明操作，在460nm處，10mm光徑，測(cè)各管吸光度值;另一部分4 000r/min離心10分鐘(4℃)，取上清液按TNF-αELISA試劑盒說明操作，在450nm處測(cè)定光密度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算TNF-α生成量。

5 組織學(xué)檢查

于4小時(shí)取肺組織分別行光鏡和電鏡觀察。光鏡標(biāo)本用10%甲醛浸泡，逐級(jí)脫水，石蠟包埋，HE染色。透射電鏡標(biāo)本則用3%戊二醛前固定24小時(shí)以上，1%鋨酸后固定，脫水后樹脂包埋，橫斷面超薄切片，鈾-鉛復(fù)染色。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

1 一般情況

各組大鼠尾靜脈注射油酸及相應(yīng)藥物后，均表現(xiàn)為心跳加快、呼吸急促，以D組最明顯，但無死亡。

2 PaO2檢查結(jié)果

藥物注射前大鼠PaO2為(12.67±0.58)kPa，注射后PaO2均為C組＞B組＞A組＞D組(圖1)，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=41.076，P＜0.01)。其中，注射1小時(shí)時(shí)各組均下降:D組最明顯(下降近1/2)，A組次之，C組最輕;隨后PaO2均呈進(jìn)行性上升:C組2小時(shí)、B組3小時(shí)、A組4小時(shí)接近或超過注射前水平，但D組PaO2上升緩慢且4小時(shí)時(shí)仍低于A組1小時(shí)水平。

3 TNF-α檢查結(jié)果

注射后1～4小時(shí)均為D組＞A組＞B組＞C組(圖2)，4組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=50.074，P＜0.01;F=46.388，P＜0.01;F=67.575，P＜0.01;F=73.879，P＜0.01)。其中，注射后1、2小時(shí)，各組TNF-α值先逐漸上升，隨后呈下降趨勢(shì)，4小時(shí)時(shí)TNF-α含量均低于初始值。

4 MPO檢查結(jié)果

注射后各用藥組肺組織MPO值低于空白對(duì)照組:D組＞A組＞B組＞C組(圖3)，4組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.257，P＜0.01;F=23.716，P＜0.01;F=6.204，P＜0.01;F=73.285，P＜0.01)。其中，注射1、2、3小時(shí)時(shí)，各組MPO值基本上呈逐漸上升趨勢(shì)，4小時(shí)時(shí)下降。

5 組織學(xué)改變

光鏡觀察各組均有廣泛肺泡間質(zhì)水腫與肺泡腔滲出，以D組最為嚴(yán)重，A、B組有不同程度減輕，C組最輕(圖4)。電鏡檢查見A組、B組肺泡Ⅱ型細(xì)胞內(nèi)線粒體均呈不同程度腫脹，肺泡腔內(nèi)散見油酸滴，并見白細(xì)胞、纖維素滲出;C組Ⅱ型細(xì)胞內(nèi)板層小體良好，肺泡腔內(nèi)可見單核細(xì)胞及紅細(xì)胞滲出;D組Ⅱ型細(xì)胞退變，胞漿內(nèi)板層小體破裂，肺泡腔內(nèi)可見較多巨噬細(xì)胞及纖維素等滲出(圖5)。

圖1 各組PaO2水平隨時(shí)間變化

圖2 各組TNF-α`隨時(shí)間的變化趨勢(shì)

圖3 各組MPO隨時(shí)間的變化趨勢(shì)

圖4 各組肺組織光鏡下改變

圖5 各組肺組織電鏡下改變

討 論

1 油酸靜脈注射制作FES動(dòng)物模型的特點(diǎn)

靜脈注射油酸、甘油三油酸酯、骨髓脂肪均可制作FES動(dòng)物模型［1，6］。由于肺血管栓塞或血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，動(dòng)物注射后出現(xiàn)呼吸急促、心動(dòng)過速、PaO2下降;病理學(xué)檢查呈現(xiàn)肺泡內(nèi)滲出，肺間質(zhì)充血、水腫或壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等化學(xué)性肺部炎癥改變［6－8］，這些表現(xiàn)與FES相似。骨髓脂肪制作的模型與臨床最為接近，但小型動(dòng)物不易提取。油酸所致模型優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單易得，模型穩(wěn)定且重復(fù)性強(qiáng)，成本低;缺點(diǎn)是油酸劑量與注射速度不易掌握，劑量偏小或速度過慢PaO2下降不明顯，劑量偏大或速度過快容易死亡，不利于長(zhǎng)時(shí)間觀察。精確控制油酸劑量與注射速度，可顯著提高造模的成功率與可行性，此方法已廣泛用于FES、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、急性肺損傷等研究［6－8］。故本實(shí)驗(yàn)選用油酸靜脈注射法制備動(dòng)物模型。

FES的病變主要在肺，臨床表現(xiàn)以低氧血癥為主。注射油酸前PaO2為(12.67±0.58)kPa、注射油酸后1小時(shí)時(shí)PaO2降為(6.43±0.57)kPa，說明PaO2變化明顯。筆者結(jié)合人類FES診斷標(biāo)準(zhǔn)［2，5，8］，以PaO2≤8kPa為大鼠FES低氧血癥的判斷標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)油酸靜脈注射劑量為0.2ml/kg時(shí)，大鼠PaO2下降能達(dá)到此標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)靜脈注射油酸后大鼠表現(xiàn)為呼吸、心跳加快、PaO2下降;病理切片示大鼠肺組織表現(xiàn)出廣泛出血，肺葉梗死(圖4、5)，這表明FES模型制作是成功的。

2 地塞米松與低分子右旋糖酐對(duì)FES的預(yù)防作用與機(jī)制探討

PaO2是早期診斷FES的可靠且敏感指標(biāo)之一，也是肺組織損傷時(shí)肺部病理改變的直接反應(yīng)，阻止PaO2降低、減輕肺組織損傷是FES預(yù)防中的關(guān)鍵措施［9］。本實(shí)驗(yàn)顯示，使用藥物初期能不同程度地減輕油酸注射所引起的PaO2下降，且隨著時(shí)間的推移，各用藥組PaO2逐漸上升，其作用:C組＞B組＞A組。這表明地塞米松、低分子右旋糖酐均能降低FES低氧血癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)或程度，聯(lián)合用藥作用最強(qiáng)，地塞米松次之。組織學(xué)檢查結(jié)果與之相對(duì)應(yīng)，即各用藥組均能明顯降低FES引起的肺部病理改變(圖4、5):聯(lián)合用藥＞地塞米松＞低分子右旋糖酐。可能的原因是各用藥組能不同程度地抑制或降低對(duì)肺泡Ⅱ型細(xì)胞損害，減輕肺泡壁水腫與肺泡腔滲出。此結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道類似［1－5］。

TNF-α、MPO主要分別由巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞分泌。TNF-α在油酸所致肺損傷中是一個(gè)前炎性遞質(zhì)［9］，能誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等分泌具有趨化中性粒細(xì)胞功能的白細(xì)胞介素-8(IL-8)，中性粒細(xì)胞被激活后脫顆粒、釋放溶酶體，導(dǎo)致MPO峰值出現(xiàn)，產(chǎn)生過多的氧自由基;同時(shí)它介導(dǎo)肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損害，增加其通透性，并刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放大量組織因子，損害毛細(xì)血管的抗凝功能，導(dǎo)致微血栓的形成，從而引起急性肺水腫［3，9－10］。因此，肺組織中TNF-α、MPO的變化能在一定程度上反映FES的嚴(yán)重程度及其發(fā)病機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)中各組TNF-α于2小時(shí)達(dá)到高峰，與文獻(xiàn)報(bào)道相似［9］。各用藥組TNF-α水平較空白對(duì)照組低(D組＞A組＞B組＞C組)，隨時(shí)間延長(zhǎng)而作用更明顯(圖2)。除峰值延緩1小時(shí)外，MPO水平的變化與TNF－α相似。這些現(xiàn)象與同時(shí)相PaO2和肺組織病理改變呈對(duì)應(yīng)關(guān)系，表明各用藥組均具有預(yù)防FES作用(聯(lián)合用藥＞地塞米松＞低分子右旋糖酐)，其主要機(jī)制可能是穩(wěn)定巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞細(xì)胞膜，從而減少其相應(yīng)細(xì)胞因子的生成。此外，地塞米松還能阻止炎癥應(yīng)答反應(yīng)并抑制血小板聚集［3］，低分子右旋糖酐能減輕肺內(nèi)紅細(xì)胞聚集，改善微循環(huán)［5，9］。

綜上所述，地塞米松、低分子右旋糖酐均具有一定的預(yù)防大鼠FES作用，聯(lián)合用藥作用最強(qiáng)，地塞米松次之。其機(jī)制較為復(fù)雜，聯(lián)合用藥可能是同時(shí)阻斷了FES發(fā)生的多個(gè)病理環(huán)節(jié)，包括穩(wěn)定巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等細(xì)胞膜、抑制對(duì)肺泡Ⅱ型細(xì)胞損害并減少肺組織TNF-α與MPO生成或改善肺內(nèi)微循環(huán)等。

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